CN102106235B - 一种全人工培养冬虫夏草的方法 - Google Patents

一种全人工培养冬虫夏草的方法 Download PDF

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一种全人工培养冬虫夏草的方法，本发明涉及冬虫夏草的全人工培养领域。本发明提供了一种冬虫夏草的全人工培养方法，包括下列步骤：a，中国被毛孢混悬液的制备；b，寄主昆虫的采集、繁殖和饲养；c，侵染：取步骤b得到的蝠蛾幼虫，用一端直径小于0.2mm的针状器具沾取步骤a的混悬液刺中蝠蛾幼虫完成侵染；d，继续饲养。本发明提供的方法可以降低蝠蛾蛹的不当死亡率，提高蝠蛾蛹的羽化率；提高蝠蛾的交尾率；大幅度的提高中国被毛孢对寄主蝠蛾幼虫的侵染率，实现全人工冬虫夏草的产业化生产。

Description

一种全人工培养冬虫夏草的方法
技术领域
本发明涉及冬虫夏草的全人工培养领域。
背景技术
冬虫夏草是一种名贵的菌类中药材，是中国被毛孢侵染只生长在3500-5000公尺高寒灌丛草甸的蝙蝠蛾幼虫产生的有性型。冬虫夏草主要分布于我国西南、西北3500公尺以上的高原，主要产区是四川、青海、西藏及云贵高原。夏初子座出土、孢子未散发时挖取，除去包裹在虫体外的菌丝体干燥。由于产区局限、产量稀少，国内外的需求量日益增大，刺激乱采滥挖，生态破坏严重，致使冬虫夏草产量急剧下降，价格直线上升，供求矛盾突出。
全人工培育冬虫夏草是解决上述问题的方法之一。目前报道的全人工培养冬虫夏草的文献有：申请号：200410021927.X，授权公告号：CN1312271C，发明名称：冬虫夏草的全人工培养方法，申请日：2005年1月5日的发明专利中公开了一种冬虫夏草的全人工冬虫夏草的方法，其步骤为：
a，取样：取冬虫夏草样本(Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.)；
b，菌种分离：分别取冬虫夏草的菌核部分、子座部分及子囊孢子进行分离、培养得中国被毛孢(Hiesutella Sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng.)，保藏号CCTCC No.M871010；菌种分离是将菌核、子座部分经表面消毒、无菌水冲洗后，将菌核及子座切成小段或薄片，或挑取子囊孢子置有分离培养基的培养皿中，在8℃～20℃进行分离、培养；所述的分离培养基为：马铃薯、葡萄糖、琼脂、蛋白胨、水或者马铃薯、葡萄糖、琼脂、蚕蛹汁、水；
c，寄主昆虫采集、繁殖和饲养：寄主蝠蛾Hepialus Spp.幼虫首次采自海拔3500～5000公尺的高寒灌丛草甸，在人工条件下经过化蛹、羽化为成虫、交尾、产卵，孵化、幼虫饲养循环进行；
具体步骤为：
①寄主昆虫的采集：寄主蝠蛾幼虫首次采自海拔3500～5000公尺的高寒灌丛草甸；
②化蛹：化蛹期温度为：10℃～18℃，湿度：45％～60％，蛹的历期：20～50天；
③羽化：蛹的羽化温度10℃～18℃，羽化的空气相对湿度为80％～100％；
④成虫、交尾：羽化后的成虫即可交尾，通过人为帮助提高交尾率；
⑤产卵：交尾后的雌成虫即行产卵，收集卵粒置容器养护；
⑥孵化：在10～18℃，相对湿度60～90％的条件下，经20～55天即孵化；
⑦幼虫饲养：幼虫饲养温度：8～18℃，湿度：40～50％；
d，侵染：将b步骤所得的菌丝体、分生孢子制成混悬液，侵染c步骤繁殖的蝠蛾幼虫；
e，继续饲养：将d步骤经侵染后的幼虫继续饲养至呆滞状态，经低温4～8℃，光照处理，至长出子实体，即得人工培养的冬虫夏草。
该方法可以实现冬虫夏草的全人工培育，但是，使用该培育方法仍有许多不足之处：蝠蛾蛹不当死亡率高、羽化率低；用于侵染的混悬液孢子含量低，不利于侵染；侵染方法机械化操作程度有待提高，侵染率较低，侵染后至幼虫僵化的时间较长，僵化幼虫长原基的时间参差不齐，工业化效率有待进一步提高。
由于平原人工饲养寄主蝠蛾幼虫难度较大、中国被毛孢遗传育种和侵染方法等原因使得冬虫夏草不能产业化，不能满足市场对冬虫夏草的需求。
发明内容
为了解决人工培育冬虫夏草产量低的问题，本发明提供了一种新的全人工培育冬虫夏草的技术方案。
本发明提供的新的全人工培育冬虫夏草的技术方案为：一种冬虫夏草的全人工培养方法，包括下列步骤：
a、中国被毛孢混悬液的制备：取保藏号为CCTCC No.M87101的中国被毛孢Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng.，制备菌体和孢子的混悬液；
b、寄主昆虫的采集、繁殖和饲养：首次采集不同产地的冬虫夏草寄主蝠蛾蛹；在人工条件下，对寄主蝠蛾进行蛹的养护、羽化、交尾、产卵、卵的养护、孵化、幼虫饲养，且循环进行；
c、侵染：取步骤b所述的蝠蛾幼虫，用一端直径小于0.2mm的针状器具沾取步骤a的混悬液刺中蝠蛾幼虫完成侵染；
d、继续饲养：将步骤c经侵染后的幼虫继续饲养至僵化，经低温4～8℃，光照处理，长出子实体，直至子实体抽生到3～5厘米长度，收获，干燥处理，即得冬虫夏草。
步骤a所述的制备菌体、孢子的混悬液的方法，包括下列步骤：
①，取保藏号为CCTCC No.M87101的中国被毛孢Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng.依次进行斜面培养、液体振荡培养和种子发酵罐液体发酵培养，得到菌液；
②，将所得菌液中的菌丝体捣碎，用50-100目滤网滤过，滤液即为菌体和孢子的混悬液，所述混悬液至少含有103个/ml孢子。
前述步骤①的斜面培养、液体振荡培养和种子发酵罐液体发酵培养的培养基每1000ml中含有：碳源20g～50g，氮源10g～45g，磷酸二氢钾1.0g，硫酸镁0.5g，水1000ml；所述碳源为葡萄糖、蔗糖或者葡萄糖和蔗糖，氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、蚕蛹粉中的一种或者两种以上的配合。
步骤b中所述蛹的养护和羽化温度为10-18℃，相对湿度为70-95％；步骤b中所述蛹的养护过程采用养护床，所述养护床为透气隔离装置；步骤b中所述交尾过程采用交尾帐，其由网眼布制成，体积为1M3～6M3。
步骤c中的针状器具是一端直径小于0.2mm的不锈钢实心针或空心针；步骤c中刺中蝠蛾幼虫的部位为蝠蛾幼虫尾部背线或近尾部背线。
与现有技术相比，本发明提供的全人工培养冬虫夏草的方法在寄主蝠蛾蛹的养护、中国被毛孢的培养和中国被毛孢对寄主蝠蛾侵染这三个步骤均有改进。本发明提供的方法可以降低蝠蛾蛹的不当死亡率，提高蝠蛾蛹的羽化率，现有文献中报道的蝠蛾蛹的不当死亡率为60％左右，而本发明蝠蛾蛹的成活率达到80％；提高蝠蛾交尾率，由40％左右提高到85％以上；大幅度的提高中国被毛孢对寄主蝠蛾幼虫的侵染率，使侵染率从60％提高到80-90％，缩短侵染后幼虫僵化的时间。
本发明提供的全人工培养冬虫夏草的方法可以实现冬虫夏草的大规模、产业化生产。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1冬虫夏草的全人工培养方法
一、寄主蝠蛾幼虫饲养
1)、蛹的采集：寄主蝠蛾蛹首次采自海拔3500～5000公尺的草原；
2)、蛹的养护和羽化：采集的蝠蛾蛹置于养护床中养护，该养护床是由网眼布或者纱网制备的装置，其具有隔离作用，与外界通气不密封，防止外界的寄生蜂等天敌进入，容易控制蛹养护的温度和湿度，防止羽化后的成虫到处飞舞，其内部可以安装温度和湿度检测仪。控制养护温度到10～18℃，养护床内的相对湿度调节到70～95％，养护30～60天后蛹羽化；
3)、交尾：待羽化后成虫逐渐展翅，将养护床内羽化的成虫转移到交尾帐内交尾，该交尾帐由网眼布制成，且体积为1M3～6M3；
4)、产卵：交尾后的雌成虫即行产卵，收集卵粒置容器养护；
5)、卵的养护：受精卵在孵化容器中保持8～15℃温度下保湿，相对湿度为60～90％；
6)、孵化：相对湿度为60～90％，温度为8～15℃，卵期：20～45天；
7)、幼虫饲养：温度为8～20℃，相对湿度60～90％。
在不使用养护床的情况下，蝠蛾蛹的不当死亡率为60％左右，而使用本发明养护床的情况下，蛹的存活率达到80％以上，成虫交尾率由40％以下提高到85％以上。
二、中国被毛孢培养
1)取中国被毛孢Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng.，保藏号为CCTCC No.M87101。
2)培养
将中国被毛孢Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng.按照下述条件依次进行斜面培养、液体振荡培养和种子发酵罐液体发酵培养，得到菌液。
a，斜面培养。培养基(每1000ml)：葡萄糖10g，蔗糖30g，牛肉膏5g，蛋白胨10g，蚕蛹汁20g，酵母粉10g，琼脂20g，磷酸二氢钾1.0，硫酸镁0.5g，水1000ml。培养条件：PH 6.5，温度：10～20℃，培养时间：10～30天；
b，液体振荡培养。培养基(每1000ml)：葡萄糖10g，蔗糖30g，牛肉膏，5g，酵母粉10g，蚕蛹汁，20g，磷酸二氢钾1.0g，硫酸镁0.5g，水1000ml。培养条件：PH 6.0～7.0，摇床100～200rpm，15～20℃，培养时间7～15天；
c，种子发酵罐液体发酵培养。培养基每(1000ml)：葡萄糖10g，蔗糖20g，麦皮汁20g，酵母粉10g，蚕蛹汁30g，磷酸二氢钾1.0g，硫酸镁0.5g，水1000ml。培养条件：PH6.5，培养温度15～20℃，通气量1∶1(V/V)，接种量5～20％，培养时间7～15天。
3)将所得菌液中的菌丝体捣碎，用50～100目滤网滤过，滤液即为菌体和孢子的混悬液。
用现有技术公开的方法制备得到的菌体和孢子的混悬液含有的孢子少，而用上述方法制备得到的菌体合孢子的混悬液含有的孢子多。菌体和孢子的混悬液中含有的孢子越多，其对蝠蛾幼虫的侵染率越高，因此，上述制备菌体和孢子的混悬液的方法更有利于中国被毛孢对蝠蛾幼虫的侵染。
三、中国被毛孢对蝠蛾幼虫的侵染
取培养得到的中国被毛孢混悬液，用针尖直径小于0.2mm的不锈钢空心针或者实心针沾取混悬液针刺蝠蛾幼虫，完成侵染。
针剌蝠蛾幼虫的尾部流出的体液少，死亡率低，侵染率和产座率高。
本发明侵染方法突破表皮屏障直接把中国被毛孢菌体带入寄主体内，大量的中国被毛孢菌丝段，分生孢子涌入幼虫体内，直接破坏了寄主的免疫系统，比中国被毛孢一个个孢子和菌丝段芽管侵染表皮具有巨大的侵染优势。大幅度的提高了侵染率，使侵染率从60％以下提高到80～90％，使冬虫夏草的工业化生产效率大幅度提高。
四、继续饲养
将步骤三侵染后的幼虫继续饲养至僵化，饲养温度：8～20℃，相对湿度60～90％；幼虫僵化后，经低温4～8℃，光照处理，长出子实体，直至子实体抽生到3～5厘米长度，进行收获，干燥处理。
综上，本发明提供的冬虫夏草的全人工培养方法可以实现冬虫夏草的大规模、产业化生产，进一步满足市场对冬虫夏草的需求。

Claims (9)

1.一种冬虫夏草的全人工培养方法，其特征在于：包括下列步骤：
a、中国被毛孢混悬液的制备：取保藏号为CCTCC No.M87101的中国被毛孢Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng.，制备菌体和孢子的混悬液；
b、寄主昆虫的采集、繁殖和饲养：首次采集不同产地的冬虫夏草寄主蝠蛾蛹；在人工条件下，对寄主蝠蛾进行蛹的养护、羽化、交尾、产卵、卵的养护、孵化、幼虫饲养，且循环进行；
c、侵染：取步骤b所述的蝠蛾幼虫，用一端直径小于0.2mm的针状器具沾取步骤a的混悬液刺中蝠蛾幼虫完成侵染；
d、继续饲养：将步骤c经侵染后的幼虫继续饲养至僵化，经低温4～8℃，光照处理，长出子实体，直至子实体抽生到3～5厘米长度，收获，干燥处理，即得冬虫夏草。
2.根据权利要求1所述的冬虫夏草的全人工培养方法，其特征在于：步骤a所述的制备菌体、孢子的混悬液的方法，包括下列步骤：
①，取保藏号为CCTCC No.M87101的中国被毛孢Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng.依次进行斜面培养、液体振荡培养和种子发酵罐液体发酵培养，得到菌液；
②，将所得菌液中的菌丝体捣碎，用50-100目滤网滤过，滤液即为菌体和孢子的混悬液，所述混悬液至少含有103个/ml孢子。
3.根据权利要求2所述的冬虫夏草的全人工培养方法，其特征在于：步骤①所述的斜面培养、液体振荡培养和种子发酵罐液体发酵培养的培养基每1000ml中含有：碳源20g～50g，氮源10g～45g，磷酸二氢钾1.0g，硫酸镁0.5g，水1000ml。
4.根据权利要求3所述的冬虫夏草的全人工培养方法，其特征在于：所述的碳源为葡萄糖、蔗糖或者葡萄糖和蔗糖；所述的氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、蚕蛹粉中的一种或者两种以上的配合。
5.根据权利要求1所述的冬虫夏草的全人工培养方法，其特征在于：步骤b中所述蛹的养护和羽化温度为10-18℃，相对湿度为70-95％。
6.根据权利要求1所述的冬虫夏草的全人工培养方法，其特征在于：步骤b中所述蛹的养护过程采用养护床，所述养护床为透气隔离装置。
7.根据权利要求1所述的全人工培养方法，其特征在于，步骤b中所述交尾过程采用交尾帐，其由网眼布制成，体积为1M3～6M3。
8.根据权利要求1所述的冬虫夏草的全人工培养方法，其特征在于：所述步骤c中的针状器具是一端直径小于0.2mm的不锈钢实心针或空心针。
9.根据权利要求1所述的冬虫夏草的全人工培养方法，其特征在于：所述的步骤c中刺中蝠蛾幼虫的部位为蝠蛾幼虫尾部背线或近尾部背线。
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