CN1312271C - 冬虫夏草的全人工培养方法 - Google Patents

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CN1312271C CNB200410021927XA CN200410021927A CN1312271C CN 1312271 C CN1312271 C CN 1312271C CN B200410021927X A CNB200410021927X A CN B200410021927XA CN 200410021927 A CN200410021927 A CN 200410021927A CN 1312271 C CN1312271 C CN 1312271C
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Abstract

本发明提供了冬虫夏草的全人工培养方法，它包括取样、菌种分离、寄主昆虫采集、繁殖和饲养、侵染、继续饲养，在人工条件下，大量的培养中国被毛孢菌；低海拔环境下规模化室内饲养寄主昆虫，完成中国被毛孢侵染寄主昆虫完成冬虫夏草的有性型。通过人工培养，寄主幼虫个体大，质量好，侵染成功率高，时间短，质量稳定、可控，通过药效试验充分说明，本发明方法生产冬虫夏草与天然冬虫夏草相比，药效相当，且能克服天然冬虫夏草生长时间长，自然侵染率低的缺点，满足市场需求，实现了冬虫夏草的工厂化生产。

Description

冬虫夏草的全人工培养方法
技术领域
本发明提供了冬虫夏草的全人工培养方法，属生物领域。
背景技术
冬虫夏草是一种名贵的菌类中药材，是中国被毛孢HirsutellaSinensis Liu，Guo，Yu et Zeng.侵染只生长在3500-5000公尺高寒灌丛草甸的蝠蛾属Hepialus Spp.幼虫产生的有性型。夏初子座出土、孢子未发散时挖取，除去包裹在虫体外的似纤维状菌丝体，晒干或低温干燥。
冬虫夏草的寄主蝠蛾属幼虫居于土中，中国被毛孢菌侵入虫体后随体液的循环并不断的在幼虫体内生长繁殖、充满整个幼虫体形成菌核，最后从幼虫头部抽生出子座。
冬虫夏草主要分布于我国西南、西北3500公尺以上的高原，主要产区是四川、青海、西藏及云贵高原。由于产区局限，产量稀少，国内外的需求量日益增大，刺激藏民乱采滥挖，生态破坏严重，致使冬虫夏草产量急剧下降，价格直线上升，供求矛盾突出，因此全人工培植冬虫夏草的研究是恢复草原生态和对人类健康事业的一大贡献。
在自然界寄主昆虫完成一个世代需4年以上的时间，这表明形成冬虫夏草有性型的时间很长；而且在自然界菌、虫接触的机率很小，自然侵染率也很低，冬虫夏草菌侵染寄主蝠蛾属幼虫并形成冬虫夏草的有性型的百分率自然就很低。
一些生物学专家采用液体深层发酵的方式解决对冬虫夏草的市场需求，由于应用液体深层发酵生产的只能是冬虫夏草的菌丝体，只能加工成冬虫夏草菌丝体的制剂，无法获得和天然同样外形的冬虫夏草，且人们多认可如同天然外形的冬虫夏草。而全人工培养冬虫夏草目前尚无相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术方案是，提供冬虫夏草的全人工培养方法，大量的培养中国被毛孢菌；低海拔环境下规模化室内饲养寄主昆虫；人工条件下中国被毛孢侵染寄主昆虫完成冬虫夏草的有性型。
本发明提供了冬虫夏草的人工培养方法，它包括下列步骤：
a、取样：采冬虫夏草Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.样本；
b、菌种分离：分别取冬虫夏草的菌核(虫体)部份、子座部份及子囊孢子进行分离，培养得中国被毛孢(Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng.)，保藏号为CCTCC No.M87101；
c、寄主昆虫采集、繁殖和饲养：首次寄主蝠蛾属幼虫采自海拔3500～5000公尺的草原，在人工规模化条件下经过化蛹、羽化、成虫、交尾、产卵、孵化、幼虫饲养，循环进行。
d、侵染：取b步骤所得中国被毛孢的菌丝体、分生孢子制成混悬液，侵染c步骤人工繁殖的幼虫；
e、继续饲养：将d步骤经侵染后的幼虫继续饲养至呆滞状态，经低温4～8℃、光照处理，长出子实体，即得人工培养的冬虫夏草。
其中步骤a取样：采自四川省甘孜州3500～5000公尺的高寒灌丛草甸的冬虫夏草Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.样本。
其中步骤b中菌种分离、培养是将菌核(虫体)及子座部分经表面消毒、多次无菌水冲洗后，切成薄片或小段；或挑取子囊孢子置有培养基的培养皿中，在8℃～20℃下培养。具体地，可用0.1％升汞液进行表面消毒，无菌水冲洗后切片或切段置培养基培养。
步骤b中所述的分离培养基为：含马铃薯、葡萄糖、琼脂、蛋白胨、水或含马铃薯、葡萄糖、琼脂、蚕蛹汁、水，其中含马铃薯、葡萄糖、琼脂、蛋白胨、水的重量配比：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蛋白胨10g，水1000ml。
其中步骤c所述的寄主昆虫采集、繁殖和饲养的具体步骤为：
①寄主昆虫的采集：寄主蝠蛾属幼虫首次采自海拔3500～5000公尺的草原灌丛草甸；
②化蛹：化蛹期温度为10℃～18℃，湿度：45％～60％，蛹的历期：20～50天。
③羽化：蛹的羽化温度10～18℃，羽化的空气相对湿度为80～100％湿度太低，成虫羽化时，无法展翅；
④成虫、交尾：羽化后的成虫即可交尾，可人为的提高交尾率；交尾最短时间为10多分钟，最长可达2小时以上，一般在1小时左右；
⑤产卵：交尾后的雌成虫即行产卵，当天产完大部份卵，第2天还可产少量的卵，收集卵粒置容器养护；产的卵初时为白色，以后变黑色，有时也可不变色；
⑥孵化：在10～18℃，相对湿度60～90％，经20～55天即孵化；
⑦幼虫饲养：幼虫饲养温度：8～18℃；湿度：40％～50％，幼虫的饲养温度高于18℃幼虫表现出多动、焦躁不安的状态，不能正常生长发育；低于8℃取食活动减少，生长缓慢，蝠蛾幼虫比较耐低温；适当提高生长环境的温度，能加快幼虫生长速率，缩短历期；环境湿度过大容易发病致死；过干则造成幼虫大量吐丝，虫体缩小，逐渐死亡，过干过湿均不易脱皮。整个寄主昆虫的培育时间共需1年。
冬虫夏草的寄主昆虫蝠蛾属包括斜脉蝠蛾Hepialus oblifurcus Chuet Wang还有虫草蝙蝠蛾Hepialus armoricanus oberthür，康定蝠蛾Hepialus kangdingensis Chu et Wang，康姬蝠蛾Hepialuskangdingroides Chu et Wang。中国被毛孢菌的寄主昆虫为蝠蛾属中的多个种，已鉴定的有19种(朱弘复、王林瑶，冬虫夏草与蝙蝠蛾，动物学集刊，1985(3)：121-134)，蝠蛾属的这些种均可被侵染形成冬虫夏草有性型。
步骤d所述的侵染方法为：将所得的菌丝体、分生孢子制成混悬液，直接置于饲养幼虫的饲料中或将幼虫体表皮沾有混悬液中的菌丝及分生孢子，则中国被毛孢菌丝体和分生孢子侵染幼虫体，并随幼虫体液的循环蔓延至幼虫整体，虫体消耗贻尽成为幼虫表皮包裹的菌核，最后从幼虫头壳抽生出子座，完成冬虫夏草的有性型。侵染率在60％以上，而在自然界侵染率仅为15％以下。
幼虫的致病菌主要有粉状拟青霉Paecilomyces farinose(Holm exS.F.Gray)Brown&Amith及绿僵菌Metarrhizium sp.，还有一种细菌所致的软腐病。为了提高幼虫的成活率，对幼虫生长空间和幼虫体需进行定期消毒杀菌处理。
本发明还提供了一种药物和食品组合物，它是由有效量的全人工培养方法培养的冬虫夏草为原料与药学上可接受的辅料或作为食品原料—制成的药剂或食品。
其中所述的人工冬虫夏草每单位原料中含有甘露醇0.3％～0.4％、腺苷含量为0.03-0.036％。
其中所述的药剂为散剂、胶囊剂、片剂、丸剂、口服液。
采用本发明冬虫夏草的人工培养方法，低海拔环境下室内规模化饲养寄主昆虫，从卵孵化到完成冬虫夏草有性阶段只需1年时间，而冬虫夏草寄主昆虫在自然界从1龄到8龄老熟幼虫的历期在4年以上；人工条件下饲养幼虫个体大，侵染成功率高。全人工培养的冬虫夏草成分检测表明，本发明方法培养的冬虫夏草与天然冬虫夏草成分类同：一些成分略高于天然冬虫夏草，另一些成分基本相同，能达到成品质量稳定、可控；人工条件下饲养的寄主幼虫个体大，质量好，通过药效学试验充分说明，本发明方法生产冬虫夏草与天然冬虫夏草相比，药效相当，且能克服天然冬虫夏草生长时间长，自然侵染率低的缺点，满足市场需求，实现了冬虫夏草的工厂化生产。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：人工饲养寄主昆虫的成虫
图2：人工饲养寄主昆虫的成虫交尾
图3：人工饲养寄主昆虫的卵
图4：人工饲养寄主昆虫的幼虫
图5：人工饲养寄主昆虫的蛹
图6：中国被毛孢菌落
图7：试管内中国被毛孢产生的子实体
图8：人工培养的冬虫夏草
具体实施方式
实施例1本发明冬虫夏草的全人工培养方法
1.1样本的采集
冬虫夏草样本采自四川甘孜州3500～5000公尺的高寒灌丛草甸。
1.2菌种分离
1.2.1分离用的基本培养基：马铃薯、葡萄糖、琼脂，水，加蛋白胨(简称PDA+胨)及马铃薯、葡萄糖、琼脂，水，加蚕蛹汁。
其重量配比：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蛋白胨10g，水1000ml。
1.2.2分离方法
菌核(虫体)及子座分离：菌核及子座用0.1％升汞液进行表面消毒、无菌水清洗后切成小段或薄片，置于有培养基的培养皿上，在8～18℃下培养。
子囊孢子分离：取子座头部，用0.1％升汞液经表面消毒、无菌水清洗后，置于有培养基的三角瓶或培养皿。子囊孢子成熟后弹射到三角瓶和培养皿内进行培养。也可取成熟的子座在显微镜下挑取子囊孢子进行培养。
1.3培养
用于产生冬虫夏草菌丝体和无性孢子的培养基：
葡萄糖30g、蛋白胨10g、酵母膏10g、蚕蛹粉5g、琼脂20g、MgSO4 0.5g、KH2PO4 1.0g、水1000ml
1.4寄主昆虫的采集与饲养
寄主幼虫首次采自3500～5000公尺的草原，在人工条件下室内规模化饲养，化蛹，羽化，成虫交尾，产卵，孵化，幼虫饲养。
1.5侵染
用无菌水洗下中国被毛孢菌菌丝和分生孢子制成悬液，经镜检含有一定的孢子量，用孢子悬液接种及孢子悬液添加于饲料等方式进行侵染。
其中寄主昆虫的采集与饲养方法具体为：
1、寄主蝠蛾的生境
寄主蝠蛾幼虫采自四川甘孜州海拔3500～5000公尺的高寒灌丛草甸带。
自然界幼虫在土中栖息的平均深度为20CM，最深达30CM，最浅5.0CM，幼虫活动期主要分布于5～25CM深度的土层内，以20CM处为最多，幼虫在土中活动的深度根据气温变化而定。幼虫在自然界呈聚集分布，这与成虫不善飞翔，在飞翔中分次间息产卵及幼虫活动性不大的特点有关。
2、寄主蝠蛾的生物学特性研究
2.1成虫
羽化：自然界蛹在6月初开始羽化，羽化期约30天，到7月初结束。羽化与温度关系密切，海拔越高温度越低，羽化时间愈向后推迟。在自然界羽化率比较低。
羽化时间：一般在白天，以下午居多。(图1)
2.2成虫交尾
一般在羽化后就进行交尾，少数可以在第二天交尾。成虫交尾的关键因素是光线。交尾时间最短为15～20分钟，最长的达2小时，一般都在1小时左右。(图2)
2.3产卵
交尾结束，雌蛾开始产卵，产卵时基本沿地面扑飞过程中间歇分次产出，大部卵在当天产出，到第二天尚产有少数卵粒，平均每只雌蛾产卵400粒左右。
2.4卵
卵呈椭圆形，开始为乳白色，逐渐变成黑色，转色时间可以在几小时之内，也有的要在10小时左右逐渐转色，也有不转色的，受精卵并不一定转色。(图3)
卵期：在10～18℃条件下，卵期最短是20天，最长是55天。
孵化率：卵的孵化率在40～80％之间。
2.5幼虫
初孵幼虫白色，长2mm左右，在人工条件下，可把快要孵化的卵放在饲料上，孵化后就在饲料上爬动，取食。(图4)
蝠蛾属幼虫在自然界的幼虫历期约需4年多，在人工条件下，无休眠期或滞育现象，大大的缩短了幼虫历期，可在一年左右完成其一个生活周期。
2.6蛹
自然界化蛹始期在5月上中旬，盛期是5月下旬至6月初。蛹期在日平均10～18℃温度下为20～50天。蛹还需要比较湿润的环境，达不到一定湿度，成虫羽化时，无法展翅。(图5)
3、寄主昆虫饲养条件
3.1饲料
蝠蛾幼虫在自然条件中是打隧道取食，温度决定它在土中的深浅。幼虫的天然食料是高山的蓼科植物，最主要的是珠芽蓼Polygonumviviparum L.团穗蓼P.sphacrostachyum Meosn.。和小大黄Rheumpumilum Maxim.等三种。
在室内规模化饲养中对多种饲料进行了研究，选择出的人工饲料取材容易，能满足幼虫的营养条件，不改变其筑隧道生活习性，潜入在饲料中取食，食料的湿度容易控制，便于消毒，又能加快幼虫生长。
用天然食料试验也取得了满意结果，幼虫喜食，生长良好，便于规模化操作。
3.2幼虫饲养条件
温度：幼虫的饲养温度一般在8℃以上18℃以下均能正常生长，高于18℃幼虫表现出多动、焦躁不安的状态，不能正常生长；低于8℃取食活动减少，生长缓慢。适当提高生长环境的温度，能加快幼虫生长速率，缩短历期。
湿度：生长环境湿度太大容易发病致死；过干则造成幼虫大量吐丝，虫体缩小，逐渐致死。过干过湿均不宜脱皮，一般人工饲养环境相对湿度控制在40～50％左右为宜。
4.0、分离获得冬虫夏草的无性型
经进行菌核、子座和子囊孢子分离，获得了90％以上是同一种真菌，该菌菌落坚硬，隆起，棕黄色或黑褐色，菌丝短而稀疏，有黑色色素渗入培养基。在更换培养基后可以在菌落上形成稀疏的菌丝及分生孢子(图6)。
4.1、产生子实体
在培养基上的菌落经低温和光照处理，产生的子实体初呈牛角状，继续生长可达5厘米多长，色泽同天然冬虫夏草的子实体。一个菌落可形成一个子实体(图7)。
4.2、用中国被毛孢菌丝体、分生孢子侵染完全在人工条件下低海拔饲养的寄主昆虫，形成与天然冬虫夏草一样的子实体，证明中国被毛孢是冬虫夏草的无性型(图8)
实施例2本发明方法培养的冬虫夏草的质量控制
选用天然冬虫夏草与本发明全人工培养冬虫夏草比较，以氨基酸为例：样品经6NHCl水解，温度110℃，时间24hr，用日立835-50氨基酸分析仪分析，结果如下：
                      天然冬虫夏草％ 全人工冬虫夏草％
  冬虫夏草   虫体部份   子座部分
  ASP.天门冬氨酸   1.646   1.658   2.201 3.449
  THR.苏氨酸   0.911   0.994   1.269 1.751
  SER.丝氨酸   1.080   1.029   1.609 1.424
  GLU.谷氨酸   2.360   2.836   3.498 4.172
  GLY.甘氨酸   0.954   0.998   1.261 1.886
  ALA.丙氨酸   1.140   1.159   1.451 2.698
  CYS.胱氨酸   0.381   0.377   0.437 0.333
  VAL.缬氨酸   0.719   0.880   0.910 1.634
  MET.蛋氨酸   0.285   0.171   0.338 0.543
  ILE.异亮氨酸   2.280   1.654   2.702 5.529
  LEU.亮氨酸   0.937   1.135   1.243 2.281
  TYR.酪氨酸   0.853   0.932   0.932 0.384
  PHE.苯丙氨酸   0.781   0.832   0.941 1.008
  LYS.赖氨酸   0.913   0.781   0.985 2.144
  NH3.氨   0.339   0.368   0.456 0.527
  HIS.组氨酸   0.791   0.658   1.082 0.680
  ARG.精氨酸   1.426   1.427   2.064 0.479
  PRO.脯氨酸   1.029   1.039   1.350 1.465
本发明方法培养的冬虫夏草中氨基酸成分略高于天然冬虫夏草。
以腺苷(C10H13N5O4)活性成分为例对全人工培养冬虫夏草的测定(《中国药典》规定测定腺苷(C10H13N5O4)的含量不得少于0.010％)：
腺苷(mg/g) 康定产冬虫夏草0.25-0.3     全人工冬虫夏草0.3-0.36
通过测定，说明全人工冬虫夏草中腺苷活性成分和天然冬虫夏草基本接近，达到质量可控。
实施例3本发明方法培养的冬虫夏草药效学试验
取本发明方法培养的冬虫夏草300g，直接打粉，装入胶囊，制成胶囊剂，每颗胶囊含冬虫夏草药材0.3g。
现以通过调节免疫；改善睡眠、提高睡眠质量的药效学试验实例证明本发明的有益效果。
经试验：全人工培养的冬虫夏草对中枢神经系统有镇静作用；对呼吸系统有明显扩张支气管作用，并可明显增强肾上腺素的作用，还有祛痰平喘和防治肺气肿的作用。
对心血管系统有降低心肌耗氧量、改善心肌缺血、抗血小板聚集、抗心律失常作用。
对内分泌系统有雄性激素样作用。
实验例1对免疫功能的作用
1、材料与方法
1.1样品
本发明全人工培养冬虫夏草粉末，日服用量1.8g/60Kg.bw。
1.2实验动物
雌性Balb/c小鼠，体重18-22克。
1.3剂量选择
先用基础饲料喂养3天后，按随机分组原则分0.15g/Kg.bw组、0.3g/Kg.bw组，和0.6g/Kg.bw组。实验组以相应剂量的样品灌胃，对照组以蒸馏水灌胃，灌胃量为2ml/Kg.bw，每天1次，连续灌胃25天。
1.4实验方法
1.4.1脏器/体重比值测定  连续灌胃25天后，颈椎脱臼处死动物，取出脾脏、胸腺，分析天平分别称出动物、脾脏、胸腺重量，按公式计算脏器/体重比值(以mg/10g表示)，并进行统计学处理。
1.4.2迟发型变态反应(足跖增厚法)
连续灌胃20天后，每只小鼠腹腔注射2％SRBC 0.2ml免疫，继续灌胃4天后，测量左后足跖厚度，测量3次取平均值；然后在测量部位皮下注射20％(V/V)SRBC，每只20μl。注射后24小时、48小时分别测定左后足跖厚度，测量3次取平均值。计算攻击前后足跖厚度的差值，以差值表示小鼠DTH的程度，并进行统计学处理。
1.4.3血清溶血素测定(血凝法)
连续灌胃20天后，每只小鼠腹腔注射2％SRBC 0.2ml免疫，继续灌胃5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置1小时，剥离，2000rpm离心10分钟，收集血清，用生理盐水将血清作倍比稀释，每份稀释12孔，将不同稀释度的血清置于血凝板中，每孔100μl，再加入0.5％SRBC悬液100μl，混匀，置湿盒37℃3小时后观察结果，记录每孔的凝集程度。按公式计算抗体积数，并进行统计学处理。
1.4.4小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)
连续灌胃25天后于每只小鼠腹腔注射20％鸡红细胞悬液1ml，30分钟后，颈椎脱臼处死，将其固定在鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2ml，转动鼠板1分钟，吸出腹腔洗液1ml，平均滴于2张载玻片上，置湿盒37℃30分钟，取出在生理盐水中漂洗、凉干、固定，4％Giemsa PBS染色3分钟，蒸馏水漂洗晾干，镜检。按公式计算吞噬百分率和吞噬指数，并进行统计学处理。
1.4.5NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶测定法)
连续灌胃25天后，颈椎脱臼处死动物，取出脾脏，撕碎，过200目筛网后，用Hank’s液洗3次，用完全1640培养液配成5×106、个/ml细胞悬液。将各只小鼠的的细胞悬液取300μl分置于96孔培养板中，每孔100μl，每孔加靶细胞(YAC-1细胞1×105、个/ml)100μl，同时做靶细胞自然释放孔(靶细胞100μl+培养液100μl)及最大释放孔(靶细胞100μl+1％NP-40 100μl)各8孔，37℃5％CO2培养4小时，取出，1500rpm离心5分钟。将各孔上清液100μl置于另一培养板中，每孔再加入100μl基质液，10分钟后加1mol/L HCl 30μl终止反应，在490nm处测定O.D值，按公式计算NK细胞活性率，并进行统计学处理。
1.5实验数据统计
采用方差分析数据进行处理。
2.0结果
2.1对小鼠体重的影响
各剂量小鼠的初始体重、中期体重及结束体重分别与对照组小鼠相应时期体重相比，均无显著性差异，(P＞0.05)
表1对小鼠体重的影响(血清溶血素与迟发型变态反应测定组)
*表示各剂量组与对照组的增重值比较
表2对小鼠体重的影响(吞噬鸡红细胞试验组)
Figure C20041002192700142
*表示各剂量组与对照组的增重值比较
表3对小鼠体重的影响(NK细胞活性测定组)
Figure C20041002192700151
*表示各剂量组与对照组的增重值比较
2.2对小鼠脏器/体重比值的影响
各剂量分别与对照组小鼠相比，其脏器/体重比值均无显著性差异(P＞0.05)
表4.对小鼠脏器/体重比值的影响
*P1各剂量组与对照组脾脏/体重比值比较，P2为各剂量组与对照组胸腺/体重比值比较
2.3对迟发型变态反应(DTH)的影响
抗原攻击后24小时，各剂量分别与对照组小鼠相比，其足跖肿胀度均有显著性增高(P＜0.05)；抗原攻击后48小时，各剂量分别与对照组小鼠相比，其足跖肿胀度均有显著性增高(P＜0.01)。
表5对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响
Figure C20041002192700161
*P1各剂量组与对照组24h足跖肿胀度比较，P2为各剂量组与对照组48h足跖肿胀度比较
2.4对小鼠血清溶血素产生的影响
0.15g/Kg.bw剂量与对照组小鼠相比，其抗体积数有显著性增高(P＜0.05)；0.3g/Kg.bw剂量、0.6g/Kg.bw剂量与对照组小鼠相比，其抗体积数显著增高(P＜0.01)。
表6对小鼠血清溶血素抗体积数的影响
Figure C20041002192700162
*P表示各剂量组与对照组抗体积数比较
2.5对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响
各剂量组与对照组小鼠相比，其腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率、吞噬指数均无显著差异性(P＞0.05)
表7.对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响
*P1各剂量组与对照组吞噬百分率的比较，P2为各剂量组与对照组吞噬指数比较
2.6对小鼠NK细胞活性的影响
各剂量组与对照组小鼠相比，其NK细胞活性率均无差异(P＞0.05)
表8.对小鼠NK细胞活性的影响
Figure C20041002192700172
Figure C20041002192700173
*P各剂量组与对照组NK细胞活性率比较
3.0小结
分别经口给予小鼠(Balb/c)0.15g/Kg.bw、0.3g/Kg.bw，和0.6g/Kg.bw剂量组的全人工冬虫夏草粉剂25天，在小鼠脏器/体重比值测定中，各剂量组分别与对照组小鼠相比，其脏器/体重比值均无显著性差异(P＞0.05)；在小鼠迟发型变态反应试验中，抗原攻击后24小时，各剂量组分别与对照组小鼠相比，其足跖肿胀度均有显著性增高(P＜0.05)，抗原攻击后48小时，各剂量组分别与对照组小鼠相比，其足跖肿胀度均有显著性增高(P＜0.01)；在小鼠血清溶血素测定试验中，0.15g/Kg.bw剂量组与对照组小鼠相比，其抗体积数有显著性增高(P＜0.05)，0.3g/Kg.bw剂量组、0.6g/Kg.bw剂量组与对照组小鼠相比，其抗体积数有显著增高(P＜0.01)；在小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验中，各剂量组与对照组小鼠相比，其腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率、吞噬指数均无显著性差异(P＞0.05)。在小鼠NK细胞活性测定试验中，各剂量组与对照组小鼠相比，其NK细胞活性率均无显著性差异(P＞0.05)。
结论：用天然冬虫夏草和全人工培养冬虫夏草进行免疫功能调节作用的试验表明两者均有免疫调节作用，无显著差异。
两者经口给予小鼠(Balb/c)0.15g/Kg.bw、0.3g/Kg.bw，和0.6g/Kg.bw剂量25天，经测试，两者各剂量组均可增高小鼠足跖肿胀度(细胞免疫功能)；两者各剂量组均可增高小鼠抗体积数(体液免疫功能)，说明全人工冬虫夏草和天然冬虫夏草一样具有免疫调节功能。
实验例2全人工冬虫夏草对改善睡眠作用
1材料与方法
1.1样品：全人工冬虫夏草粉末，用量：1.8g/人/日
1.2试验动物：清洁级昆明种雌性鼠，体重18-20g，
1.3剂量300mg/Kg.bw、600mg/Kg.bw，和900mg/Kg.bw(相当于推荐量1.8g/人/日的10、20、30倍)
1.4实验方法
1.4.1延长戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时间试验：
成年小鼠随机分为4组(人工虫草三个剂量组和阴性对照组)按全人工虫草水溶液2％体积每天灌胃一次，连续4周。阴性对照组灌蒸馏水。末次灌胃30分钟后给各组动物腹腔注射戊巴比妥钠55mg/Kg.bw，观察并记录动物的深睡眠(即失去翻正反射)持续时间。分别计算各组动物的平均睡眠时间。
1.4.2戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验：
分组、灌胃方法和时间均同1.4.1。末次灌胃30分钟后，按33mg/Kg.bw剂量给各组动物腹腔注射戊巴比妥钠生理盐水溶液，观察注射后30分钟内的入睡动物数(以翻正反射消失超过2分钟为判断入睡的标准)。分别计算各组动物的睡眠发生率。
1.4.3戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠潜伏时间试验：
分组、灌胃方法和时间均同1.4.1。末次灌胃30分钟后给各组动物腹腔注射戊巴比妥钠240mg/Kg.bw，观察并记录注射后动物的入睡时间。分别计算各组动物的平均睡眠潜伏时间(即入睡时间—注射戊巴比妥钠时间)。
1.5实验数据统计
睡眠发生率用卡方检验，睡眠时间、睡眠潜伏时间和体重用方差分析作组间差异的比较。
2.结果
2.1对小鼠体重的影响
方差分析表明试验中期和试验结束时各剂量组动物平均体重与对照组比较无显著差异(P＞0.05)，表明本试验品对小鼠生长发育无不良影响。
表9对小鼠体重的影响
组别 动物数(只) 初始体重(g) 中期体重(g) 结束体重(g)
    对照组300mg/Kg..bw600mg/Kg..bw900mg/Kg..bw 41414141   18.88±0.8118.88±0.7818.90±0.8018.88±0.78  30.71±1.9129.73±2.2929.83±1.9129.61±1.93   34.37±2.5933.44±2.8634..07±2.6132..95±2.16
2.2延长戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时间试验
900mg/Kg.bw剂量组小鼠的平均睡眠时间显著长于对照组(P＜0.05)，表明本试验品对高剂量戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时间有延长作用。
表10对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响
*与阴性对照组比较
2.3戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验
900mg/Kg.bw剂量组小鼠的睡眠发生率显著高于对照组(P＜0.05)，且有较好的剂量—效应关系，即本试验品可增加戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠发生率。
表11对阈下剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠发生率的影响
剂量mg/Kg.bw     戊巴比妥钠剂量mg/Kg.bw 动物数(只) 入睡动物数(只) 睡眠发生率(％) P值*
   对照组0300600900 33333333 15151515 2248 13.3313.3326.6753.33 ＞0.05＞0.05＜0.05
*与阴性对照组比较
2.4戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠潜伏时间试验
各剂量组小鼠的平均睡眠潜伏时间与对照组比较无显著性差异(P＞0.05)即本试验品对戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠潜伏时间无明显影响。
表12对戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠潜伏时间的影响
*与阴性对照组比较
结论：
本试验品改善睡眠作用动物试验结果表明，对小鼠生长发育无不良影响；900mg/Kg.bw剂量组小鼠的平均睡眠时间显著长于对照组，睡眠发生率显著高于对照组，且有较好的剂量—效应关系。结论是本试验品有改善睡眠作用。
此外，本发明方法培养的冬虫夏草对药物肾毒性损伤具保护作用；对慢性肾功能衰竭(CRF)具有防治作用。
通过上述的质量控制试验和药效学试验充分说明，本发明的全人工培养的冬虫夏草中活性成分可控，质量稳定，通过药效学试验说明本发明方法培养的冬虫夏草与天然冬虫夏草在药效学上无显著性差异，能够满足临床的需要。

Claims (7)

1、冬虫夏草的全人工培养方法，其步骤为：
a、取样：取冬虫夏草样本(Cordyceps sinensis Berk.)Sacc.)；
b、菌种分离：分别取冬虫夏草的菌核部份、子座部份及子囊孢子进行分离、培养得中国被毛孢(Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu etZeng.)，保藏号为CCTCC No.M87101；菌种分离是将菌核、子座部份经表面消毒、无菌水冲洗后，将菌核及子座切成小段或薄片，或挑取子囊孢子置有分离培养基的培养皿中，在8℃～20℃进行分离、培养；所述的分离培养基为：马铃薯、葡萄糖、琼脂、蛋白胨、水或马铃薯、葡萄糖、琼脂、蚕蛹汁、水；
c、寄主昆虫采集、繁殖和饲养：寄主蝠蛾属Hepialus Spp.幼虫首次采自海拔3500～5000公尺的高寒灌丛草甸，在人工条件下经过化蛹、羽化、成虫、交尾、产卵，孵化、幼虫饲养循环进行；
具体步骤为：
①寄主昆虫的采集：寄主蝠蛾属幼虫首次采自海拔3500～5000公尺的高寒灌丛草甸；
②化蛹：化蛹期温度为10℃～18℃，湿度：45％～60％，蛹的历期：20～50天；
③羽化：蛹的羽化温度10～18℃，羽化的空气相对湿度为80～100％；
④成虫、交尾：羽化后的成虫即可交尾，通过人为帮助提高交尾率；
⑤产卵：交尾后的雌成虫即行产卵，收集卵粒置容器养护；
⑥孵化：在10～18℃，相对湿度60～90％的条件下，经20～55天即孵化；
⑦幼虫饲养：幼虫饲养温度：8～18℃，湿度：40％～50％；
d、侵染：将b步骤所得的菌丝体、分生孢子制成混悬液，侵染c步骤繁殖的蝠蛾属幼虫；
e、继续饲养：将d步骤经侵染后的幼虫继续饲养至呆滞状态，经低温4～8℃，光照处理，至长出子实体，即得人工培养的冬虫夏草。
2、根据权利要求1所述的冬虫夏草的全人工培养方法，其特征在于：步骤a取样：采自四川省甘孜州3500～5000公尺的高寒灌丛草甸的冬虫夏草样本。
3、根据权利要求1所述的冬虫夏草的全人工培养方法，其特征在于：
步骤b所述的分离培养基为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蛋白胨10g，水1000ml。
4、根据权利要求1所述的冬虫夏草的全人工培养方法，其特征在于：
步骤c中步骤①所述的昆虫为蝠蛾属幼虫，包括虫草蝙蝠蛾Hepialusarmoricanus oberthür，斜脉蝠蛾Hepialus oblifurcus Chu etWang，康定蝠蛾Hepialus kangdingensis Chu et Wang，康姬蝠蛾Hepialus kangdingroides Chu et Wang。
5、一种药物组合物，它是由有效量的权利要求1所述的方法培养的冬虫夏草与药学上可接受的辅料制成的药物组合物。
6、根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的每单位原料冬虫夏草中，甘露醇含量为0.3％～0.4％、腺苷含量为0.03％～0.036％。
7、根据权利要求5或6所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物的剂型为为散剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
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Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1309823C (zh) * 2005-04-29 2007-04-11 东莞市生物技术研究所 提高蛹虫草优良菌种筛选效率和繁殖稳定性的生产方法
CN100434508C (zh) * 2006-11-08 2008-11-19 中山大学 一种提高青藏高原冬虫夏草产量的方法
CN102106235B (zh) * 2010-12-24 2012-12-05 四川藏宝虫草生物科技有限公司 一种全人工培养冬虫夏草的方法
CN102487905A (zh) * 2011-12-21 2012-06-13 重庆市中药研究院 冬虫夏草寄主蝙蝠蛾卵的孵化方法
CN102523927A (zh) * 2012-01-17 2012-07-04 辽宁仙榆湾北冬虫夏草（集团）有限公司 自然环境中培养蛹虫草的方法
CN103299821A (zh) * 2012-03-08 2013-09-18 黄友鹰 原生态冬虫夏草高产及育种的方法
CN102813081B (zh) * 2012-05-24 2015-02-04 四川农业大学 用于饲养冬虫夏草寄主幼虫的饲料和饲养寄主幼虫的方法
CN102696392B (zh) * 2012-05-30 2013-08-07 苏诚玉 天然冬虫夏草的增产方法
CN103081869B (zh) * 2012-08-16 2014-12-17 重庆市中药研究院 一种冬虫夏草低海拔人工培殖方法
CN102845218A (zh) * 2012-08-23 2013-01-02 大化金玉草生物科技有限责任公司 一种冬虫夏草菌中国被毛孢的原生态分离法
CN102792855B (zh) * 2012-09-13 2014-03-05 重庆市中药研究院 一种用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料及寄主感染方法
CN102960183A (zh) * 2012-10-31 2013-03-13 贵州神奇集团控股有限公司 一种冬虫夏草的人工培养方法及冬虫夏草产物
CN103270887B (zh) * 2013-05-13 2017-07-07 玄永男 蚕蛹北冬虫夏草工厂化栽培技术
CN103548779B (zh) * 2013-11-15 2015-10-21 重庆市中药研究院 一种冬虫夏草寄主蝙蝠蛾幼虫的野外放养方法
CN103749149A (zh) * 2013-12-20 2014-04-30 凌中鑫 一种以黄粉虫蛹为载体培养人工虫草的方法
CN103918480A (zh) * 2014-04-11 2014-07-16 钱志强 一种冬虫夏草的人工培养方法
CN104381011B (zh) * 2014-09-30 2017-06-06 中山大学 一种具有高侵染活性的冬虫夏草菌种材料的制备及侵染钩蝠蛾幼虫的方法
CN104381010B (zh) * 2014-10-08 2017-09-15 生展生物科技股份有限公司 冬虫夏草子实体的培养方法及其组合物和应用
CN105075667B (zh) * 2015-08-25 2017-05-10 四川藏宝虫草生物科技有限公司 一种可用于低海拔地区之全人工培育冬虫夏草的方法
CN105766379B (zh) 2016-03-22 2017-05-03 广东东阳光药业有限公司 培植冬虫夏草的系统和方法
CN106010978A (zh) * 2016-05-25 2016-10-12 浙江农林大学 冬虫夏草无性型中国被毛孢纯菌种的培养方法
CN106010977A (zh) * 2016-05-25 2016-10-12 浙江农林大学 中国被毛孢人工侵染蝙蝠蛾幼虫的方法
CN108112542A (zh) * 2017-12-29 2018-06-05 谢远泰 一种虫草寄主蝙蝠蛾幼虫世代循环饲养方法
CN110305795B (zh) * 2019-03-15 2021-10-01 广东省生物资源应用研究所 一株中国被毛孢及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1104249A (zh) * 1994-08-25 1995-06-28 俞永信 冬虫夏草的深层发酵工艺
CN1274006A (zh) * 2000-06-09 2000-11-22 车振明 人工培育冬虫夏草的方法
CN1338510A (zh) * 2001-09-04 2002-03-06 上海大中生物种苗有限公司 一种北冬虫夏草子实体人工培育方法及其鲜活虫草产品
CN1414091A (zh) * 2001-10-26 2003-04-30 李健 用昆虫培育冬虫夏草的新技术
CN1445359A (zh) * 2002-03-14 2003-10-01 李健 人工培育无虫体虫草的新技术

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1104249A (zh) * 1994-08-25 1995-06-28 俞永信 冬虫夏草的深层发酵工艺
CN1274006A (zh) * 2000-06-09 2000-11-22 车振明 人工培育冬虫夏草的方法
CN1338510A (zh) * 2001-09-04 2002-03-06 上海大中生物种苗有限公司 一种北冬虫夏草子实体人工培育方法及其鲜活虫草产品
CN1414091A (zh) * 2001-10-26 2003-04-30 李健 用昆虫培育冬虫夏草的新技术
CN1445359A (zh) * 2002-03-14 2003-10-01 李健 人工培育无虫体虫草的新技术

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