CN109952912A - 一种中国被毛孢感染寄主昆虫蝙蝠蛾幼虫获得冬虫夏草的方法 - Google Patents

一种中国被毛孢感染寄主昆虫蝙蝠蛾幼虫获得冬虫夏草的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种中国被毛孢感染寄主昆虫蝙蝠蛾幼虫获得冬虫夏草的方法。本发明通过对被注射中国被毛孢的孢子形态(芽生孢子)、注射方法(在无菌条件下操作)和注射后护理(0‑6℃低温下)这三个关键步骤进行改进，使被感染蝙蝠蛾幼虫同时达到低死亡率(小于30％)、高感染率(均可达到100％携菌率)与缩短感染僵化时间(3‑5个月)的效果，获得了与野生冬虫夏草形态一致的人工生态抚育冬虫夏草。

Description

一种中国被毛孢感染寄主昆虫蝙蝠蛾幼虫获得冬虫夏草的 方法
技术领域：
本发明属于冬虫夏草人工培育领域，具体涉及一种中国被毛孢感染寄主昆虫蝙蝠蛾幼虫获得冬虫夏草的方法。
背景技术：
冬虫夏草是我国最具特色的生物资源，隶属子囊菌门(Ascomycota)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、线虫草科(Ophiocordycipitaceae)、虫草属(Ophiocordyceps)，国内主要产于西藏、青海、云南、四川、甘肃等海拔3000米以上的雪山高寒地区。
冬虫夏草是中国被毛孢(Ophiocordyceps sinensis)真菌感染寄主昆虫-蝙蝠蛾幼虫，并使其僵化，在适宜条件下感菌僵虫生长，形成具有虫(僵虫)草(真菌子实体)复合形态的结构。
冬虫夏草具有“补肺、强肾、益精气、理诸虚百损”等众多功效。现代医学证明，冬虫夏草具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗辐射及免疫调节等功能，在医药、食品以及现代生物技术等方面被广泛应用。在我国传统滋补品市场中，冬虫夏草一直被国民推崇和信赖，并在日本、韩国、东南亚国家和美国等国际市场热销。资源的枯竭、需求的旺盛和政策的保护导致其市场价格飞涨。野生冬虫夏草已被列为国家二级保护植物。为了保护高原生态、虫草资源，让冬虫夏草更好地服务普惠健康，唯一选择是人工培育。
冬虫夏草真菌的寄主昆虫蝙蝠蛾(鳞翅目蝙蝠蛾科Hepialidae)的人工繁殖是冬虫夏草人工培育的重要环节。据报道的蝙蝠蛾昆虫超过60种。蝙蝠蛾为全变态昆虫，生活周期包括卵、幼虫、蛹和成虫阶段。最适宜的生长土壤为高寒草甸和高寒灌木丛土。尽管不同地区的蝙蝠蛾种类的不同，但是总体来说有规律性。每年6-8月份蛹羽化成成虫，雌雄虫交配后，雌虫立即将卵散产于附近草丛中或灌丛植被中，一般每只雌蛾产卵200-800粒。蝙蝠蛾幼虫在自然土壤中营隧道式生活，杂食性，主要以植物嫩根为食；幼虫期漫长，一般经过900-1300天7-9龄的生长发育期才能化蛹，且具有明显的世代交替现象；每年10月至次年4月冻土期蝙蝠蛾幼虫在土壤中处于休眠状态。每年5月下旬蝙蝠蛾幼虫开始形成蛹,蛹期经过1-2个月后羽化为成虫。在自然环境中蝙蝠蛾昆虫完成整个世代的周期受到种类、地理分布、食物、植被、土壤结构、温度、湿度和自然天敌等多种生态因子的综合控制。
虫生真菌主要通过昆虫体壁、自然孔口或消化道进入到虫体内部。冬虫夏草菌感染蝙蝠蛾幼虫的途径和方法研究报道有限。尽管目前人工感染幼虫方法包括将中国被毛孢孢子液涂抹于寄主体表，孢子混合饲料喂食从食道进入寄主体内，或注射到寄主体内。但是，体表涂布和饲喂方法均时间长、被感染幼虫过程死亡率高、感染率低；现有的穿刺感染方法易因操作不慎造成虫体表面伤口过大、幼虫体液流失过多而死亡率高。
因此，现有技术无法同时达到低死亡率、高感染率与缩短感染僵化时间的效果。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种中国被毛孢感染寄主昆虫蝙蝠蛾幼虫获得冬虫夏草的方法。
本发明的目的是提供一种中国被毛孢感染寄主昆虫蝙蝠蛾幼虫获得冬虫夏草的方法，包括以下步骤：
1)注射感染和注射后护理：在无菌条件下，将中国被毛孢芽生孢子注射到蝙蝠蛾幼虫体内，注射幼虫部位为腹部足间膜；将被注射蝙蝠蛾幼虫置于0-6℃饲养至少1周，然后移到11-16℃下饲养；
2)子实体诱导：将被注射蝙蝠蛾幼虫饲养至变成僵虫，僵虫头部开裂，子实体从僵虫头部开裂处长出，获得冬虫夏草。
步骤1)所述的中国被毛孢芽生孢子的注射孢子量优选为每头幼虫注射10-106个芽生孢子，更进一步优选为每头幼虫注射105个芽生孢子。
所述的将被注射蝙蝠蛾幼虫置于0-6℃饲养至少1周，然后移到11-16℃下饲养具体为：将被注射蝙蝠蛾幼虫置于3-6℃饲养4周，然后移到11-16℃下饲养。将被注射蝙蝠蛾幼虫置于0-6℃饲养至少1周，可以减少被注射蝙蝠蛾幼虫的死亡率(一般低于30％)。
步骤1)和2)所述的饲养，其饲料优选为胡萝卜、珠芽蓼和鹅绒委陵菜中的一种或几种的混合。胡萝卜、珠芽蓼和鹅绒委陵菜这三种饲料可根据幼虫龄期或饲料价格采用任何比例混合后进行饲喂。
步骤1)和2)所述的饲养，其饲料优选为胡萝卜、珠芽蓼和鹅绒委陵菜按质量比1:1:1混合的饲料。
步骤1)所述的蝙蝠蛾幼虫优选为2-7龄蝙蝠蛾幼虫。
所述的蝙蝠蛾优选为贡嘎蝠蛾(Thitarodes gonggaensis)、小金蝠蛾(Thitarodes xiaojinensis)、剑川无钩蝠蛾(Thitarodes jianchuanensis)或虫草钩蝠蛾(Thitarodes armoricanus)。
优选，所述的中国被毛孢芽生孢子的制备方法优选为：将中国被毛孢分生孢子接种到PDA培养基中培养获得中国被毛孢芽生孢子。
与现有技术相比，本发明提供的中国被毛孢(Ophiocordyceps sinensis)感染寄主昆虫蝙蝠蛾幼虫获得冬虫夏草的方法在被注射中国被毛孢的孢子形态(芽生孢子)、注射方法(以微量注射器在无菌条件下操作)和注射后护理(0-6℃低温下)这三个关键步骤均有改进，使被感染蝙蝠蛾幼虫同时达到低死亡率(小于30％)、高感染率(均可达到100％携菌率)与缩短感染僵化时间(3-5个月)的效果，获得了与野生冬虫夏草形态一致的人工生态抚育冬虫夏草。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
本实施例使用的蝙蝠蛾是采自四川的贡嘎蝠蛾(Thitarodes gonggaensis)。
1、中国被毛孢芽生孢子制备
培养芽生孢子的培养基为PDA培养基：每升含有葡萄糖20g、马铃薯200g、蛋白胨5g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O 1.5g和VB1 0.02g，其余为H2O(自然pH)。中国被毛孢分生孢子经分子准确鉴定后，接入上述PDA培养基中，置于摇床(120rpm，9℃)中培养60天，离心收集中国被毛孢芽生孢子用于注射感染蝙蝠蛾幼虫。
2、蝙蝠蛾幼虫饲养
以胡萝卜、珠芽蓼和鹅绒委陵菜按质量比1:1:1混合饲喂蝙蝠蛾幼虫，获得健康的、用于被感染的5龄蝙蝠蛾幼虫。
3、注射感染和注射后护理
利用微量注射器(针头直径为0.06mm)注射中国被毛孢芽生孢子感染5龄蝙蝠蛾幼虫。注射是在超净工作台下进行，确保被注射蝙蝠蛾幼虫不受杂菌污染。芽生孢子注射量为每头幼虫4微升；注射孢子量为每头幼虫105个芽生孢子。注射幼虫部位为腹部足间膜。
将被注射蝙蝠蛾幼虫置于0-3℃饲养4周，然后移到11-16℃下饲养(以胡萝卜、珠芽蓼和鹅绒委陵菜按质量比1:1:1混合饲喂蝙蝠蛾幼虫)。注射30d后蝙蝠蛾幼虫的死亡率为3％，注射芽生孢子缩短了幼虫僵化的时间，幼虫3-5个月变僵。
4、被注射蝙蝠蛾幼虫携菌检测
被注射感染4周后，以微型针头(针头直径为0.06mm)在幼虫腹部取血淋巴约2-5微升，经Calcofluor White(Sigma)染色后于显微镜下观察菌体形态，可观察到芽生孢子。注射一个月后幼虫的携菌率约为62％，注射两个月后约为83％，注射三个月后达到100％。
5、子实体诱导
被注射感染的蝙蝠蛾幼虫经过3-10个月的生长，从活幼虫变成僵虫，僵虫头部开裂，子实体从僵虫头部开裂处长出，获得与野生冬虫夏草形态一致的人工生态抚育冬虫夏草，子实体发生率为96.5％。
实施例2：
本实施例使用的蝙蝠蛾是采自四川的贡嘎蝠蛾(Thitarodes gonggaensis)。
1、中国被毛孢芽生孢子制备
培养芽生孢子的培养基为PDA培养基：每升含有葡萄糖20g、马铃薯200g、蛋白胨5g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O 1.5g和VB1 0.02g，其余为H2O(自然pH)。中国被毛孢分生孢子经分子准确鉴定后，接入上述PDA培养基中，置于摇床(120rpm，9℃)中培养60天，离心收集中国被毛孢芽生孢子用于注射感染蝙蝠蛾幼虫。
2、蝙蝠蛾幼虫饲养
以胡萝卜、珠芽蓼和鹅绒委陵菜按质量比1:1:1混合饲喂蝙蝠蛾幼虫，获得健康的、用于被感染的5龄蝙蝠蛾幼虫。
3、注射感染和注射后护理
利用微量注射器(针头直径为0.06mm)注射中国被毛孢芽生孢子感染5龄蝙蝠蛾幼虫。注射是在超净工作台下进行，确保被注射蝙蝠蛾幼虫不受杂菌污染。芽生孢子注射量为每头幼虫4微升；注射孢子量为每头幼虫105个芽生孢子。注射幼虫部位为腹部足间膜。
将被注射蝙蝠蛾幼虫置于3-6℃饲养4周，然后移到11-16℃下饲养(以胡萝卜、珠芽蓼和鹅绒委陵菜按质量比1:1:1混合饲喂蝙蝠蛾幼虫)。注射30d后蝙蝠蛾幼虫的死亡率为3.0％，注射芽生孢子缩短了幼虫僵化的时间，幼虫3-5个月变僵。
4、被注射蝙蝠蛾幼虫携菌检测
被注射感染4周后，以微型针头(针头直径为0.06mm)在幼虫腹部取血淋巴约2-5微升，经Calcofluor White(Sigma)染色后于显微镜下观察菌体形态，可观察到芽生孢子。注射一个月后幼虫的携菌率约为80％，注射两个月后约为95％，注射三个月后达到100％。
5、子实体诱导
被注射感染的蝙蝠蛾幼虫经过3-10个月的生长，从活幼虫变成僵虫，僵虫头部开裂，子实体从僵虫头部开裂处长出，获得与野生冬虫夏草形态一致的人工生态抚育冬虫夏草，子实体发生率为97.5％。
实施例3：
本实施例使用的蝙蝠蛾是采自四川的贡嘎蝠蛾(Thitarodes gonggaensis)。
1、中国被毛孢芽生孢子制备
培养芽生孢子的培养基为PDA培养基：每升含有葡萄糖20g、马铃薯200g、蛋白胨5g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O 1.5g和VB1 0.02g，其余为H2O(自然pH)。中国被毛孢分生孢子经分子准确鉴定后，接入上述PDA培养基中，置于摇床(120rpm，9℃)中培养60天，离心收集中国被毛孢芽生孢子用于注射感染蝙蝠蛾幼虫。
2、蝙蝠蛾幼虫饲养
以胡萝卜、珠芽蓼和鹅绒委陵菜按质量比1:1:1混合饲喂蝙蝠蛾幼虫，获得健康的、用于被感染的2龄蝙蝠蛾幼虫。
3、注射感染和注射后护理
利用微量注射器(针头直径为0.06mm)注射中国被毛孢芽生孢子感染2龄蝙蝠蛾幼虫。注射是在超净工作台下进行，确保被注射蝙蝠蛾幼虫不受杂菌污染。芽生孢子注射量为每头幼虫4微升；注射孢子量为每头幼虫105个芽生孢子。注射幼虫部位为腹部足间膜。
将被注射蝙蝠蛾幼虫置于3-6℃饲养4周，然后移到11-16℃下饲养(以胡萝卜、珠芽蓼和鹅绒委陵菜按质量比1:1:1混合饲喂蝙蝠蛾幼虫)。注射30d后蝙蝠蛾幼虫的死亡率为8％，注射芽生孢子缩短了幼虫僵化的时间，幼虫3-5个月变僵。
4、被注射蝙蝠蛾幼虫携菌检测
被注射感染4周后，以微型针头(针头直径为0.06mm)在幼虫腹部取血淋巴约2-5微升，经Calcofluor White(Sigma)染色后于显微镜下观察菌体形态，可观察到芽生孢子。注射一个月后幼虫的携菌率约为75％，注射两个月后约为92％，注射三个月后达到100％。
5、子实体诱导
被注射感染的蝙蝠蛾幼虫经过3-10个月的生长，从活幼虫变成僵虫，僵虫头部开裂，子实体从僵虫头部开裂处长出，获得与野生冬虫夏草形态一致的人工生态抚育冬虫夏草，子实体发生率为94％。
实施例4：
本实施例使用的蝙蝠蛾是采自四川的贡嘎蝠蛾(Thitarodes gonggaensis)。
1、中国被毛孢芽生孢子制备
培养芽生孢子的培养基为PDA培养基：每升含有葡萄糖20g、马铃薯200g、蛋白胨5g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O 1.5g和VB1 0.02g，其余为H2O(自然pH)。中国被毛孢分生孢子经分子准确鉴定后，接入上述PDA培养基中，置于摇床(120rpm，9℃)中培养60天，离心收集中国被毛孢芽生孢子用于注射感染蝙蝠蛾幼虫。
2、蝙蝠蛾幼虫饲养
以胡萝卜、珠芽蓼和鹅绒委陵菜按质量比1:1:1混合饲喂蝙蝠蛾幼虫，获得健康的、用于被感染的7龄蝙蝠蛾幼虫。
3、注射感染和注射后护理
利用微量注射器(针头直径为0.06mm)注射中国被毛孢芽生孢子感染7龄蝙蝠蛾幼虫。注射是在超净工作台下进行，确保被注射蝙蝠蛾幼虫不受杂菌污染。芽生孢子注射量为每头幼虫4微升；注射孢子量为每头幼虫105个芽生孢子。注射幼虫部位为腹部足间膜。
将被注射蝙蝠蛾幼虫置于3-6℃饲养4周，然后移到11-16℃下饲养(以胡萝卜、珠芽蓼和鹅绒委陵菜按质量比1:1:1混合饲喂蝙蝠蛾幼虫)。注射30d后蝙蝠蛾幼虫的死亡率为6.5％，注射芽生孢子缩短了幼虫僵化的时间，幼虫3-5个月变僵。
4、被注射蝙蝠蛾幼虫携菌检测
被注射感染4周后，以微型针头(针头直径为0.06mm)在幼虫腹部取血淋巴约2-5微升，经Calcofluor White(Sigma)染色后于显微镜下观察菌体形态，可观察到芽生孢子。注射一个月后幼虫的携菌率约为30％，注射两个月后约为75％，注射三个月后达到100％。
5、子实体诱导
被注射感染的蝙蝠蛾幼虫经过3-10个月的生长，从活幼虫变成僵虫，僵虫头部开裂，子实体从僵虫头部开裂处长出，获得与野生冬虫夏草形态一致的人工生态抚育冬虫夏草，子实体发生率为95.5％。
实施例5：
本实施例使用的蝙蝠蛾是小金蝠蛾(Thitarodes xiaojinensis)。
1、中国被毛孢芽生孢子制备
培养芽生孢子的培养基为PDA培养基：每升含有葡萄糖20g、马铃薯200g、蛋白胨5g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O 1.5g和VB1 0.02g，其余为H2O(自然pH)。中国被毛孢分生孢子经分子准确鉴定后，接入上述PDA培养基中，置于摇床(120rpm，16℃)中培养60天，离心收集中国被毛孢芽生孢子用于注射感染蝙蝠蛾幼虫。
2、蝙蝠蛾幼虫饲养
以胡萝卜饲喂蝙蝠蛾幼虫，获得健康的、用于被感染的5龄蝙蝠蛾幼虫。
3、注射感染和注射后护理
利用微量注射器(针头直径为0.06mm)注射中国被毛孢芽生孢子感染5龄蝙蝠蛾幼虫。注射是在超净工作台下进行，确保被注射蝙蝠蛾幼虫不受杂菌污染。芽生孢子注射量为每头幼虫1微升；注射孢子量为每头幼虫10个芽生孢子。注射幼虫部位为腹部足间膜。
将被注射蝙蝠蛾幼虫置于3-6℃饲养1周，然后移到11-16℃下饲养(以胡萝卜饲喂蝙蝠蛾幼虫)。注射30d后蝙蝠蛾幼虫的死亡率为3％，注射芽生孢子缩短了幼虫僵化的时间，幼虫3-5个月变僵。
4、被注射蝙蝠蛾幼虫携菌检测
被注射感染4周后，以微型针头(针头直径为0.06mm)在幼虫腹部取血淋巴约2-5微升，经Calcofluor White(Sigma)染色后于显微镜下观察菌体形态，可观察到芽生孢子。注射一个月后幼虫的携菌率约为15％，注射两个月后约为55％，注射三个月后达到100％。
5、子实体诱导
被注射感染的蝙蝠蛾幼虫经过3-10个月的生长，从活幼虫变成僵虫，僵虫头部开裂，子实体从僵虫头部开裂处长出，获得与野生冬虫夏草形态一致的人工生态抚育冬虫夏草，子实体发生率为95.5％。
实施例6：
本实施例使用的蝙蝠蛾是采自云南的剑川无钩蝠蛾(Thitarodesjianchuanensis)。
1、中国被毛孢芽生孢子制备
培养芽生孢子的培养基为PDA培养基：每升含有葡萄糖20g、马铃薯200g、蛋白胨5g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O 1.5g和VB1 0.02g，其余为H2O(自然pH)。中国被毛孢分生孢子经分子准确鉴定后，接入上述PDA培养基中，置于摇床(120rpm，9℃)中培养60天，离心收集中国被毛孢芽生孢子用于注射感染蝙蝠蛾幼虫。
2、蝙蝠蛾幼虫饲养
以珠芽蓼饲喂蝙蝠蛾幼虫，获得健康的、用于被感染的5龄蝙蝠蛾幼虫。
3、注射感染和注射后护理
利用微量注射器(针头直径为0.06mm)注射中国被毛孢芽生孢子感染5龄蝙蝠蛾幼虫。注射是在超净工作台下进行，确保被注射蝙蝠蛾幼虫不受杂菌污染。芽生孢子注射量为每头幼虫20微升；注射孢子量为每头幼虫106个芽生孢子。注射幼虫部位为腹部足间膜。
将被注射蝙蝠蛾幼虫置于3-6℃饲养5周，然后移到11-16℃下饲养(以珠芽蓼饲喂蝙蝠蛾幼虫)。注射30d后蝙蝠蛾幼虫的死亡率为12％，注射芽生孢子缩短了幼虫僵化的时间，幼虫3-5个月变僵。
4、被注射蝙蝠蛾幼虫携菌检测
被注射感染4周后，以微型针头(针头直径为0.06mm)在幼虫腹部取血淋巴约2-5微升，经Calcofluor White(Sigma)染色后于显微镜下观察菌体形态，可观察到芽生孢子。注射一个月后幼虫的携菌率约为60％，注射两个月后约为85％，注射三个月后达到100％。
5、子实体诱导
被注射感染的蝙蝠蛾幼虫经过3-10个月的生长，从活幼虫变成僵虫，僵虫头部开裂，子实体从僵虫头部开裂处长出，获得与野生冬虫夏草形态一致的人工生态抚育冬虫夏草，子实体发生率为93％。
实施例7：
本实施例使用的蝙蝠蛾是采自西藏和青海虫草钩蝠蛾(Thitarodesarmoricanus)。
1、中国被毛孢芽生孢子制备
培养芽生孢子的培养基为PDA培养基：每升含有葡萄糖20g、马铃薯200g、蛋白胨5g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O 1.5g和VB1 0.02g，其余为H2O(自然pH)。中国被毛孢分生孢子经分子准确鉴定后，接入上述PDA培养基中，置于摇床(120rpm，9℃)中培养60天，离心收集中国被毛孢芽生孢子用于注射感染蝙蝠蛾幼虫。
2、蝙蝠蛾幼虫饲养
以鹅绒委陵菜饲喂蝙蝠蛾幼虫，获得健康的、用于被感染的5龄蝙蝠蛾幼虫。
3、注射感染和注射后护理
利用微量注射器(针头直径为0.06mm)注射中国被毛孢芽生孢子感染5龄蝙蝠蛾幼虫。注射是在超净工作台下进行，确保被注射蝙蝠蛾幼虫不受杂菌污染。芽生孢子注射量为每头幼虫4微升；注射孢子量为每头幼虫105个芽生孢子。注射幼虫部位为腹部足间膜。
将被注射蝙蝠蛾幼虫置于3-6℃饲养4周，然后移到11-16℃下饲养(以鹅绒委陵菜饲喂蝙蝠蛾幼虫)。注射30d后蝙蝠蛾幼虫的死亡率为5.5％，注射芽生孢子缩短了幼虫僵化的时间，幼虫3-5个月变僵。
4、被注射蝙蝠蛾幼虫携菌检测
被注射感染4周后，以微型针头(针头直径为0.06mm)在幼虫腹部取血淋巴约2-5微升，经Calcofluor White(Sigma)染色后于显微镜下观察菌体形态，可观察到芽生孢子。注射一个月后幼虫的携菌率约为47％，注射两个月后约为78％，注射三个月后达到100％。
5、子实体诱导
被注射感染的蝙蝠蛾幼虫经过3-10个月的生长，从活幼虫变成僵虫，僵虫头部开裂，子实体从僵虫头部开裂处长出，获得与野生冬虫夏草形态一致的人工生态抚育冬虫夏草，子实体发生率为94％。
实施例8：
本实施例使用的蝙蝠蛾是采自四川的贡嘎蝠蛾(Thitarodes gonggaensis)。
1、中国被毛孢芽生孢子制备
培养芽生孢子的培养基为PDA培养基：每升含有葡萄糖20g、马铃薯200g、蛋白胨5g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O 1.5g和VB1 0.02g，其余为H2O(自然pH)。中国被毛孢分生孢子经分子准确鉴定后，接入上述PDA培养基中，置于摇床(120rpm，9℃)中培养60天，离心收集中国被毛孢芽生孢子用于注射感染蝙蝠蛾幼虫。
2、蝙蝠蛾幼虫饲养
以胡萝卜、珠芽蓼和鹅绒委陵菜按质量比1:1:1混合饲喂蝙蝠蛾幼虫，获得健康的、用于被感染的5龄蝙蝠蛾幼虫。
3、注射感染和注射后护理
利用微量注射器(针头直径为0.06mm)注射中国被毛孢芽生孢子感染5龄蝙蝠蛾幼虫。注射是在超净工作台下进行，确保被注射蝙蝠蛾幼虫不受杂菌污染。芽生孢子注射量为每头幼虫4微升；注射孢子量为每头幼虫105个芽生孢子。注射幼虫部位为腹部足间膜。
将被注射蝙蝠蛾幼虫置于8-11℃下饲养4周，然后移到11-16℃下饲养(以胡萝卜、珠芽蓼和鹅绒委陵菜按质量比1:1:1混合饲喂蝙蝠蛾幼虫)。注射30d后蝙蝠蛾幼虫的死亡率为8.5％，注射芽生孢子缩短了幼虫僵化的时间，幼虫3-5个月变僵。
4、被注射蝙蝠蛾幼虫携菌检测
被注射感染4周后，以微型针头(针头直径为0.06mm)在幼虫腹部取血淋巴约2-5微升，经Calcofluor White(Sigma)染色后于显微镜下观察菌体形态，可观察到芽生孢子。注射一个月后幼虫的携菌率约为75％，注射两个月后约为90％，注射三个月后达到100％。
5、子实体诱导
被注射感染的蝙蝠蛾幼虫经过3-10个月的生长，从活幼虫变成僵虫，僵虫头部开裂，子实体从僵虫头部开裂处长出，获得与野生冬虫夏草形态一致的人工生态抚育冬虫夏草，子实体发生率为96.5％。
实施例9：
本实施例使用的蝙蝠蛾是采自四川的贡嘎蝠蛾(Thitarodes gonggaensis)。
1、蝙蝠蛾幼虫饲养
以胡萝卜、珠芽蓼和鹅绒委陵菜按质量比1:1:1混合饲喂蝙蝠蛾幼虫，获得健康的、用于被感染的5龄蝙蝠蛾幼虫。
2、注射感染和注射后护理
利用微量注射器(针头直径为0.06mm)注射中国被毛孢分生孢子感染5龄蝙蝠蛾幼虫。注射是在超净工作台下进行，确保被注射蝙蝠蛾幼虫不受杂菌污染。分生孢子注射量为每头幼虫4微升；注射孢子量为每头幼虫105个分生孢子。注射幼虫部位为腹部足间膜。
将被注射蝙蝠蛾幼虫置于3-6℃饲养4周，然后移到11-16℃下饲养(以胡萝卜、珠芽蓼和鹅绒委陵菜按质量比1:1:1混合饲喂蝙蝠蛾幼虫)。注射30d后蝙蝠蛾幼虫的死亡率为5.5％，幼虫7-12个月变僵。
3、被注射蝙蝠蛾幼虫携菌检测
被注射感染4周后，以微型针头(针头直径为0.06mm)在幼虫腹部取血淋巴约2-5微升，经Calcofluor White(Sigma)染色后于显微镜下观察菌体形态，可观察到芽生孢子。注射一个月后幼虫的携菌率约为0％，注射两个月后约为6.67％，注射三个月后达到43.3％。
5、子实体诱导
被注射感染的蝙蝠蛾幼虫经过7-12个月的生长，从活幼虫变成僵虫，僵虫头部开裂，子实体从僵虫头部开裂处长出，获得与野生冬虫夏草形态一致的人工生态抚育冬虫夏草，子实体发生率为94％。

Claims (9)

1.一种中国被毛孢感染寄主昆虫蝙蝠蛾幼虫获得冬虫夏草的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)注射感染和注射后护理：在无菌条件下，将中国被毛孢芽生孢子注射到蝙蝠蛾幼虫体内，注射幼虫部位为腹部足间膜；将被注射蝙蝠蛾幼虫置于0-6℃饲养至少1周，然后移到11-16℃下饲养；
2)子实体诱导：饲养被注射蝙蝠蛾幼虫至活幼虫变成僵虫，僵虫头部开裂，子实体从僵虫头部开裂处长出，获得冬虫夏草。
2.根据权利要求1所述的中国被毛孢感染寄主昆虫蝙蝠蛾幼虫获得冬虫夏草的方法，其特征在于，步骤1)所述的中国被毛孢芽生孢子的注射孢子量为每头幼虫注射10-106个芽生孢子。
3.根据权利要求2所述的中国被毛孢感染寄主昆虫蝙蝠蛾幼虫获得冬虫夏草的方法，其特征在于，步骤1)所述的中国被毛孢芽生孢子的注射孢子量为每头幼虫注射105个芽生孢子。
4.根据权利要求1、2或3所述的中国被毛孢感染寄主昆虫蝙蝠蛾幼虫获得冬虫夏草的方法，其特征在于，所述的将被注射蝙蝠蛾幼虫置于0-6℃饲养至少1周，然后移到11-16℃下饲养具体为：将被注射蝙蝠蛾幼虫置于3-6℃饲养4周，然后移到11-16℃下饲养。
5.根据权利要求1所述的中国被毛孢感染寄主昆虫蝙蝠蛾幼虫获得冬虫夏草的方法，其特征在于，步骤1)和2)所述的饲养，其饲料为胡萝卜、珠芽蓼和鹅绒委陵菜中的一种或几种的混合。
6.根据权利要求5所述的中国被毛孢感染寄主昆虫蝙蝠蛾幼虫获得冬虫夏草的方法，其特征在于，步骤1)和2)所述的饲养，其饲料为胡萝卜、珠芽蓼和鹅绒委陵菜按质量比1:1:1混合的饲料。
7.根据权利要求1所述的中国被毛孢感染寄主昆虫蝙蝠蛾幼虫获得冬虫夏草的方法，其特征在于，步骤1)所述的蝙蝠蛾幼虫为2-7龄蝙蝠蛾幼虫。
8.根据权利要求1所述的中国被毛孢感染寄主昆虫蝙蝠蛾幼虫获得冬虫夏草的方法，其特征在于，所述的蝙蝠蛾为贡嘎蝠蛾(Thitarodes gonggaensis)、小金蝠蛾(Thitarodesxiaojinensis)、剑川无钩蝠蛾(Thitarodes jianchuanensis)或虫草钩蝠蛾(Thitarodesarmoricanus)。
9.根据权利要求1所述的中国被毛孢感染寄主昆虫蝙蝠蛾幼虫获得冬虫夏草的方法，其特征在于，所述的中国被毛孢芽生孢子的制备方法为：将中国被毛孢分生孢子接种到PDA培养基中培养获得中国被毛孢芽生孢子。
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