CN102792855A - 一种用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料及寄主感染方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种采用冬虫夏草菌皮代替中国被毛孢孢子菌作为冬虫夏草寄主染菌的菌种材料。具体内容为：一种用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料，所述用于冬虫夏草寄主饲养中寄主感染的菌种材料为冬虫夏草菌皮；本发明提供的采用冬虫夏草菌皮代替中国被毛孢孢子菌作为冬虫夏草寄主染菌的菌种材料的方法，菌种材料的制备成本更低；更重要的是，冬虫夏草菌作为菌种材料，冬虫夏草寄主的存活率和感染率较接种中国被毛孢孢子菌菌液，寄主幼虫的感染率和存活率都显著提高。

Description

一种用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料及寄主感染方法

技术领域

本发明涉及一种冬虫夏草培养方法，更具体的说涉及一种用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料及寄主感染方法。

技术背景

冬虫夏草Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.又名虫草，系麦角菌科虫草属真菌中国被毛孢寄生蝙蝠蛾属昆虫幼虫体内形成的虫菌复合体，是我国特有珍稀名贵中药材。具有补肺益肾、止咳化痰，主治咳嗽、咳血、阳痿遗精、病后体虚、老年慢性咳嗽等疾病。冬虫夏草主产于我国西藏、青海、云南、四川和甘肃等省区海拔3500-5200m局部高寒山区草甸地带。天然资源十分有限，近年来采挖过度造成生态环境的恶化，天然资源日趋枯竭。因此，人工栽培冬虫夏草势在必行。人工培殖的关键是冬虫夏草菌能否侵染寄主昆虫，进入到寄主的体腔内，并在体腔中繁殖生长，最后产生子座，形成冬虫夏草药材。野生冬虫夏草寄主蝙蝠蛾幼虫的的感染途径为，蝙蝠蛾属昆虫幼虫在野生环境中通过体表或食道感染中华被毛孢菌，但是上述方法，染菌率低，周期长，而且不能进行规模化生产。

目前寄主人工感染方法为将中国被毛孢孢子菌液采用涂抹于寄主体表、注射到寄主体内、灌注或通过饲料从寄主食道进入寄主体内。涂永勤等在期刊《食用菌》2010（3）中发表的《蝠蛾属幼虫感染冬虫夏草茵的实验研究》公开了多种以中华被毛孢孢子菌液作为冬虫夏草寄主感染的菌种材料。但是上述方法存在中华被毛孢菌种分离纯化难度大，且幼虫染菌率和染菌后存活率较低的问题。专利申请人在国家自然科学基金面上项目“冬虫夏草寄主幼虫适应饲料的机理及其生态适合度评估”（编号为81072997）、“冬虫夏草寄主昆虫拟青霉病的分子流行病学研究”（编号为81173479）和国家自然科学基金青年基金项目“人工繁育冬虫夏草寄主幼虫发育变异的影响因素研究”（项目批准号为30901964）的资助下对冬虫夏草寄主感染的菌种材料进行了研究。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种采用冬虫夏草菌皮代替中国被毛孢孢子菌作为冬虫夏草寄主染菌的菌种材料。具体内容为：

一种用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料，所述用于冬虫夏草寄主饲养中寄主感染的菌种材料为冬虫夏草菌皮。

所述的冬虫夏草菌皮为冬虫夏草采挖出来时，冬虫夏草僵虫菌核表面覆盖的菌膜。

所述冬虫夏草菌皮的提取方法为:将挖出来且未经过任何清理的冬虫夏草清理掉表面的颗粒状土块以及杂物，保留冬虫夏草僵虫菌核表面与僵虫菌核外形相似的一层与土混合的菌膜外壳；将与土混合的菌膜外壳剥落收集得到冬虫夏草菌皮。

一种冬虫夏草寄主的寄主感染方法，为将上所述冬虫夏草寄主感染的菌种材料的溶混悬液体灌注到冬虫夏草寄主虫口中或拌到冬虫夏草寄主饲料中，对冬虫夏草寄主进行饲养。

一种冬虫夏草寄主的寄主感染方法，为将上所述冬虫夏草寄主感染的菌种材料或粉末直接拌入冬虫夏草寄主饲料或直接喂到冬虫夏草寄主虫口。

一种冬虫夏草寄主的寄主感染方法，所述的寄主感染的方法为将权利要求3所述冬虫夏草寄主感染的菌种材料溶混悬液体注射到虫体中。

一种冬虫夏草寄主的寄主感染方法，为将上所述冬虫夏草寄主感染的菌种材料溶混悬液体直接喷淋到冬虫夏草寄主虫体上或将冬虫夏草寄主感染的菌种材料混入到冬虫夏草寄主的培养基中。

本发明的有益技术效果是：本发明提供的采用冬虫夏草菌皮代替中国被毛孢孢子菌作为冬虫夏草寄主染菌的菌种材料的方法，菌种材料的制备成本更低；更重要的是，冬虫夏草菌作为菌种材料，冬虫夏草寄主的存活率和感染率较接种中国被毛孢孢子菌菌液，寄主幼虫的感染率和存活率都显著提高。

具体实施方式

实施例1用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料的制备方法

采集长成的冬虫夏草，具体的采集方法为:撬起冬虫夏草周围的表土，不能触及冬虫夏草的僵虫菌核表面；剥落冬虫夏草周围的土块，得到被一层外形与僵虫菌核形态相似的菌膜与泥土混合物构成的外壳包裹的冬虫草夏草；收集上述菌膜与泥土混合物构成的外壳，得到冬虫夏草菌皮。

将冬虫夏草菌皮用水超声融化，得到冬虫夏草菌皮的混悬液，过滤混悬液中的泥土，得到第一次水溶液；将过滤出的泥土用水洗涤，过滤得到第二次水溶液，合并第一次和第二次水溶液，浓度为每1g菌皮制备3mL菌皮水溶液，得到用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料。

实施例2冬虫夏草寄主的感染方法的考察1

从已感染中国被毛孢菌的蝙蝠蛾幼虫活体得到蝙蝠蛾幼虫体液，将体液用接种针粘上在无菌条件下涂抹（即接种）于平板培养基上。将涂抹了带菌活幼虫体液的平板培养基置于8～18℃恒温箱内培养。3天后，每天观察一次，及时汰除杂菌，10～16天后方在平板培养基的接种处形成深灰、继而转变成棕黄乃至黑色的中国被毛孢菌落。将分离出来的中国被毛孢菌，从平培养基板上转入行的培养基上，置18℃条件下培养，接种体中心呈黄褐色、菌落坚硬，有稀疏平贴的纤细菌丝，进而形成冬虫夏草菌的分生孢子。用无菌水将其孢子洗下，配制成孢子悬浮液；浓度为每毫升105个孢子。

收集小金蝠蛾Hepialus xiaojinensisTu etMa幼虫，2400条虫六等分放于8个1m²干净的经消毒的搪瓷盘中，每组300条虫，上一些经消毒的干树叶，以利虫子活动和隐蔽，喷一些蒸馏水保持湿度。先用无菌的珠芽蓼、胡萝卜、红苕、菜叶饲喂7d，使虫体恢复生长。然后清除剩余全部食用。停喂2～3d后，取上述任意3组饲喂孢子悬浮液喷淋过的珠芽蓼、胡萝卜、红苕、菜叶，作为对照组Ⅰ；取任意4组饲喂实施例1得到的冬虫夏草寄主感染的菌种材料喷淋过的珠芽蓼、胡萝卜、红苕、菜叶，作为实验组Ⅰ；每天清除剩余物，第2d用同样方法饲喂，连喂30d，观察虫生长和活动情况，这时剔除那些生长健壮。活动敏捷，反应灵敏的虫，然后上覆10cm幼虫生长区采回的高山草甸土及草皮，控制温度在1～5℃，继续饲喂，分别在1个月、3个月、6个月和1年后，分别将实验组和对照组个一组挖出虫体，计算感染僵化的成活的和死亡的虫体数；得到混合饲料饲喂方法组数据。

按1个月、3个月、6个月和1年的时间阶段定期收集幼虫群体内随机抽取10头幼虫进行调查。将幼虫体表面消毒后，采用特制的工具在无菌条件下抽取微量的血淋巴制片，镜检观察，记录血淋巴内菌体的形态。追踪观察幼虫僵化情况。在对菌体进行观察的同时，抽取微量带菌血淋巴涂抹在灭菌PDA培养基平板上，置于18℃恒温箱内培养。每日一次取出培养皿镜检观察菌体生长发育的状态，或挑取菌体及其培养物制片观察。待涂布菌体处形成菌落，挑取菌落表面的菌丝体制片镜检观察；具体结果如表1所示。

表1不同菌种材料幼虫的感染情况

结果表明,寄主幼虫感染冬虫夏草菌是一个复杂的过程，需要一定的时间，才能完成整个侵染过程。由表1可知，采用实施例1所述的用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料，寄主幼虫接种1个月后即可感染上冬虫夏草菌。接种6个月后感染达高峰，感染率为100％。

实施例3冬虫夏草寄主的感染方法的考察2

收集小金蝠蛾Hepialus xiaojinensisTu etMa幼虫，2400条虫六等分放于8个1m²干净的经消毒的搪瓷盘中，每组300条虫，上一些经消毒的干树叶，以利虫子活动和隐蔽，喷一些蒸馏水保持湿度。先用无菌的珠芽蓼、胡萝卜、红苕、菜叶饲喂7d，使虫体恢复生长。将上述6组，清洗虫子表面，用3％双氧水作表面消毒后；选取任意4组，用微型注射枪，在显微镜下将实施例2制备的孢子悬浮液通过虫体表面的微孔道注入虫体血腔内，作为对照组Ⅱ；选取任意4组，用微型注射枪，在显微镜下将实施例1所述的用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料通过虫体表面的微孔道注入虫体血腔内，作为实验组Ⅱ；30d后观察虫生长和活动情况，这时剔除那些生长健壮，活动敏捷，反应灵敏的虫，然后上覆10cm幼虫生长区采回的高山草甸土及草皮，控制温度在1～5℃，继续饲喂，分别在1个月、3个月、6个月和1年后，挖出虫体，计算感染僵化的、成活的和死亡的虫体数；得到注射方法组数据。按1个月、3个月、6个月和1年的时间阶段定期收集幼虫群体内随机抽取10头幼虫进行调查。采用是实施例2所述的检测方法，具体结果如表2所示。

表2不同菌种材料幼虫的感染情况

结果表明,采用注射方法，冬虫夏草寄主的存活率很低，由表2可知，采用实施例1所述的用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料，寄主幼虫接种1个月后即可感染上冬虫夏草菌。接种6个月后感染达高峰，感染率为100％。

实施例4冬虫夏草寄主的感染方法的考察3

收集小金蝠蛾Hepialus xiaojinensisTu etMa幼虫，2400条虫六等分放于8个1m²干净的经消毒的搪瓷盘中，每组300条虫，上一些经消毒的干树叶，以利虫子活动和隐蔽，喷一些蒸馏水保持湿度。先用无菌的珠芽蓼、胡萝卜、红苕、菜叶饲喂7d，使虫体恢复生长。将上述6组，清洗虫子表面，选取任意4组，用3:1的孢子液对虫体进行喷淋，每2d进行1次，作为对照组Ⅲ；选取任意4组，用3:1的实施例1所述的用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料对虫体进行喷淋，每2d进行1次，作为实验组Ⅲ；30d后观察虫生长和活动情况，这时剔除那些生长健壮，活动敏捷，反应灵敏的虫，然后覆盖上10cm幼虫生长区采回的高山草甸土及草皮，控制温度在1～5℃，继续饲喂，分别在1个月、3个月、6个月和1年后，挖出虫体，计算感染僵化的、成活的和死亡的虫体数；得到喷淋方法组数据。按1个月、3个月、6个月和1年的时间阶段定期收集幼虫群体内随机抽取10头幼虫进行调查。采用是实施例2所述的检测方法，具体结果如表3所示。

表3不同菌种材料幼虫的感染情况

结果表明,采用注射方法，冬虫夏草寄主的存活率很高，但是感染率比较低，，由表3可知，采用实施例1所述的用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料，寄主幼虫接种1个月后即可感染上冬虫夏草菌。接种一年后感染达高峰，感染率为78.57％，感染率远低于饲喂方法和注射方法。

实施例5冬虫夏草寄主的感染方法的考察4

收集小金蝠蛾Hepialus xiaojinensisTu etMa幼虫，2400条虫六等分放于8个1m²干净的经消毒的搪瓷盘中，每组300条虫，上一些经消毒的干树叶，以利虫子活动和隐蔽，喷一些蒸馏水保持湿度。先用无菌的珠芽蓼、胡萝卜、红苕、菜叶饲喂7d，使虫体恢复生长。将上述6组，清洗虫子表面，用3％双氧水作表面消毒后；选取任意4组，将实施例2制备的孢子悬浮液直接注入到幼虫口中，作为对照组Ⅵ；选取任意4组，将实施例1所述的用于冬虫夏草菌皮直接放入幼虫口中并作为饲料直接混入幼虫食物中，作为实验组Ⅵ；30d后观察虫生长和活动情况，这时剔除那些生长健壮，活动敏捷，反应灵敏的虫，然后上覆lOcm幼虫生长区采回的高山草甸土及草皮，控制温度在1～5℃，继续饲喂，分别在1个月、3个月、6个月和1年后，挖出虫体，计算感染僵化的、成活的和死亡的虫体数；得到直接饲喂组数据。按1个月、3个月、6个月和1年的时间阶段定期收集幼虫群体内随机抽取10头幼虫进行调查。采用是实施例2所述的检测方法，具体结果如表4所示。

表4不同菌种材料幼虫的感染情况

结果表明,采用注射方法，冬虫夏草寄主的存活率比较高，由表4可知，采用实施例1所述的用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料，寄主幼虫接种1个月后即可感染上冬虫夏草菌。接种12个月后感染达高峰，感染率为100％。

实施例6菌种材料不同施用方法对冬虫夏草产量的影响

将实施例2-4所述菌种材料接种后的冬虫夏草寄主，饲养一年左右，幼虫即可发病僵化，接着萌生出幼芽，成长为子实体。将本发明筛选出的菌种染菌培养的蝙蝠蛾幼虫的出土20天的虫草与野生感菌幼虫出土20天的虫草相对比，将本发明筛选出的菌种染菌培养的蝙蝠蛾幼虫的子囊壳发育成熟的虫草与野生感菌幼虫子囊壳发育成熟的虫相对比。发现本发明得到的菌种染菌得到的虫草和野生冬虫夏草的子囊果、子囊孢子被认为与冬虫夏草天然的子囊果、子囊孢子形态特征完全一样；各组冬虫夏草的产量如表5所示。

表5菌种材料不同施用方法冬虫夏草产量情况

Claims (7)

1.一种用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料，其特征在于：所述用于冬虫夏草寄主饲养中寄主感染的菌种材料为冬虫夏草菌皮。

2.根据权利要求1所述的用于冬虫夏草寄主感染的菌种材料，其特征在于：所述的冬虫夏草菌皮为冬虫夏草采挖出来时，冬虫夏草僵虫菌核表面覆盖的菌膜。

3.根据权利要求2所述的用于冬虫夏草寄主感染得菌种材料，其特征在于：所述冬虫夏草菌皮的提取方法为：将挖出来且未经过任何清理的冬虫夏草清理掉表面的颗粒状土块以及杂物，保留冬虫夏草僵虫菌核表面与僵虫菌核外形相似的一层与土混合的菌膜外壳；将与土混合的菌膜外壳剥落收集得到冬虫夏草菌皮。

4.一种冬虫夏草寄主的寄主感染方法，其特征在于：所述的寄主感染的方法为将权利要求3所述冬虫夏草寄主感染的菌种材料的溶混悬液体灌注到冬虫夏草寄主虫口中或拌到冬虫夏草寄主饲料中，对冬虫夏草寄主进行饲养。

5.一种冬虫夏草寄主的寄主感染方法，其特征在于：所述的寄主感染的方法为将权利要求3所述冬虫夏草寄主感染的菌种材料或粉末直接拌入冬虫夏草寄主饲料或直接喂到冬虫夏草寄主虫口。

6.一种冬虫夏草寄主的寄主感染方法，其特征在于：所述的寄主感染的方法为将权利要求3所述冬虫夏草寄主感染的菌种材料溶混悬液体注射到虫体中。

7.一种冬虫夏草寄主的寄主感染方法，其特征在于：所述的寄主感染的方法为将权利要求3所述冬虫夏草寄主感染的菌种材料溶混悬液体直接喷淋到冬虫夏草寄主虫体上或将冬虫夏草寄主感染的菌种材料混入到冬虫夏草寄主的培养基中。