CN102599031B

CN102599031B - 一种高效稳定的稻曲病菌室内接种方法及专用菌株

Info

Publication number: CN102599031B
Application number: CN2011100287351A
Authority: CN
Inventors: 黄俊斌; 罗朝喜; 贾切; 郑露
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2011-01-24
Filing date: 2011-01-24
Publication date: 2013-06-26
Anticipated expiration: 2031-01-24
Also published as: CN102599031A

Abstract

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种室内高效稳定的稻曲病菌人工接种方法及专用菌株。发明的方法包括：通过PSB振荡培养1块在PSA上培养7天的菌丝块(6mm)7-10天制备菌丝孢子混合液，4层纱布过滤后获得106个/ml孢子液接种体；在水稻幼穗分化第七期以注射方式接种水稻穗苞；25℃、95％RH条件下保湿3天后置于25-32℃、90％-98％RH的喷灌网室内培养。采用本发明可使稻曲病人工接种病穗率达到90％以上，与室外的人工接种技术相比，本发明能够在可控的条件下获得高效的稳定的稻曲病发病率。

Description

一种高效稳定的稻曲病菌室内接种方法及专用菌株

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种高效稳定的稻曲病菌的室内接种方法以及应用该方法的专用菌株。

背景技术

水稻稻曲病是由Ustilaginoidea virens引起的一种水稻穗部谷粒病害。近些年来，随着水稻栽培模式的改变，稻田氮肥施用量的增加以及新型高产密穗型杂交稻的大面积推广，稻曲病在世界各水稻产区发生日益严重。稻曲病不仅影响水稻产量，病原菌所产生的毒素还污染稻谷，影响米质，降低商品价值，严重威胁着全世界的食品安全。迄今为止，已有不少学者对稻曲病进行了广泛研究，初步揭示了稻曲菌的生物学特性、病害循环和防治方法，但这些研究大多局限于田间自然发病的调查和研究，难以向侵染过程、致病机制、抗病机制以及抗病育种等深层次研究领域扩展。室内人工接种技术即是制约稻曲病深入研究的技术瓶颈。

据检索，申请号为03131625.5、申请日期为2003.6.3(高效引发稻曲病的接种方法)的发明公开了一种引发稻曲病的接种方法。该发明虽然比较了不同接种条件对稻曲病发病严重度的影响，如水稻生育期、接种时段等，但发明所涉及的水稻生育期的限定并不准确，也没有表观的定义，而且在接种试验之中也未能对温湿度环境条件进行控制或监测。由此得出的接种试验结果往往会因接种温湿度的条件变化而不稳定。因此在室内完善稻曲病的人工接种条件，建立起一套稳定高效的稻曲病接种技术体系，已成为现今稻曲病研究的一项重要任务。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的缺陷，提出一种高效稳定稻曲病菌的室内人工接种方法以及专用于该方法的菌株，解决了目前稻曲病室内人工接种发病率不稳定这一难题。

实现本发明的技术方案如下所述。

一、稻曲菌菌株HWD-2的分离、筛选和鉴定

1、稻曲菌菌株的分离

待分离病样材料——稻曲球是申请人的发明人2009年10月从湖北省武汉市江夏区五里界镇东湖村水稻田采集得到，按常规组织分离法(参照：方中达，植物病理学，北京：中国农业出版社，1998)，将稻曲球置于75％酒精中消毒30s，再经0.1％升汞表面消毒5min后，无菌水漂洗3次。然后用无菌吸水纸将稻曲球表面水分吸干，切取其内层组织，置于PSA(PSA培养基成分：按g/L计，马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂粉12g；补充蒸馏水至1000ml)平板(含50ug/ml的链霉素)上，28℃黑暗条件下培养14天，待长出菌落后挑取边缘的菌丝移至新鲜PSA平板中培养，将分离物命名为HWD-2。

2、稻曲菌分类鉴定

采用传统的鉴定方法和分子鉴定等三种方法对候选分离物进行了鉴定，具体步骤如下：

(1)菌落形态鉴定：取6mm菌丝块，置于PSA平板上，28℃黑暗条件下培养14天，观察其菌落形态(如图1)。其菌落白色，中央隆起，菌丝致密，边缘光滑，7-10天后基质菌丝呈黄色，呈典型稻曲病菌菌落特征。

(2)孢子形态鉴定：将分离物在PSA培养基上培养7天后，取直径为6mm菌丝块1块，置于200mlPSB培养基(PSB培养基成分：按g/L计，马铃薯200g，蔗糖20g；补充蒸馏水至1000ml)中，于28℃、转速180rpm的摇床上振荡培养7-10天，得到菌丝孢子混合液。将以上获得的菌丝孢子混合液经四层纱布过滤，取滤液，即得薄壁分生孢子液，在显微镜(10×40倍)下观察孢子形态(见图2)。分生孢子为单孢，无色透明，表明光滑，呈卵圆形，呈典型稻曲病菌分生孢子特征。

(3)分子鉴定：

采用报道的CTAB法(刘少华，2005)提取分离物的培养7天后的菌丝总DNA，按照Zhou Yongli报道的方法进行PCR扩增(Zhou Yongli，2003)，运用稻曲菌ITS序列的特异引物(见序列表SEQ ID NO：2-5所示)进行PCR扩增，用ddH₂O作为阴性对照(见图3)，得到的一条特异性条带(序列长度为233bp)。

根据菌落形态、孢子形态及特异性PCR扩增条带，确定上述分离物HWD-2鉴定为稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)。

稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)HWD-2的生物学特征

取6mm菌株HWD-2菌丝块，置于PSA平板上，隔天以十字交叉法测量菌落直径。结果表明，24-28℃、胁本哲氏或PSA培养基的条件最适合HWD-2菌丝生长，日平均生长速率为2.5mm/天。

菌株HWD-2在PSA上培养7天后，取6mm菌丝块1块，放入200mlPSB培养基，置于28℃、转速180rpm的摇床上振荡培养7-10天，经四层纱布过滤，取滤液，获得薄壁分生孢子液，以血球计数板检测薄壁分生孢子浓度。结果表明，28℃、180rpm转速和大米汁或PSB的条件最适合HWD-2产生薄壁分生孢子。

将上述孢子液用PSB稀释至浓度10⁶个/ml，于不同时间点在显微镜(10×40倍)下观察孢子萌发情况，结果表明在PSB中48h孢子萌发率可达到90％以上。

3、菌株活化与保存

取6mm菌丝块，置于铺有灭菌的滤纸片(1cm×1cm)的PSA平板上，于28℃，黑暗条件下培养，待7天后菌丝长满滤纸片，再将滤纸片揭下，放入硫酸纸袋中并封口，置于28℃烘箱中干燥7天，然后放置于-20℃条件下作为长期保存的菌株，需要时进行按常规方法活化。

该稻曲病(Ustilaginoidea virens)菌株HWD-2已于2011年1月19日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保存中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：M2011023。

二、接种体制备：

病原菌在PSA培养基上培养7天后，取直径为6mm菌丝块1块放入200mlPSB培养基(PSB培养基成分：按g/L计，马铃薯200g，蔗糖20g；补充蒸馏水至1000ml)中，置28℃、转速180rpm的摇床上振荡培养7-10天，得到菌丝孢子混合液。再将以上获得的菌丝孢子混合液经四层纱布过滤，取滤液，3000rpm下离心5min，弃上清液，沉淀用新鲜的PSB培养基悬浮并将孢子终浓度稀释至10⁶个/ml，即得薄壁分生孢子液。

三、接种方法：

采用注射接种法，在水稻幼穗分化第7期(黄祥辉，水稻栽培生理，上海科学技术出版社，1978)，用10ml注射器从穗苞中上部插入，向穗苞内注射制备好的10⁶个/ml浓度薄壁分生孢子液2ml，直至接种液从穗苞顶部溢出。

接种后的水稻植株放置在植物生长箱(型号：ZSX1500GS，武汉瑞华仪器设备有限责任公司)内，于25℃、95％RH下保湿培养3天，然后移至喷灌网室(十字式悬挂微喷系统，江西贝嘉实业有限公司)，白天每2小时喷水一次，夜间每4小时喷水一次，保持温度在25-32℃，湿度90％-98％。

四、病穗率和病情指数调查方法：

1、接种3周后调查病穗率和病情指数，计算方法如下：

病穗率＝(病穗率数)/(接种并已抽穗数)×100％

病情指数＝(1级株数×1+2级的株数×2+3级的株数×3+4级的株数×1+5级的株数×5)/(总株数×5)×100

2、稻曲病的分级标准(参照唐春生报道的方法，2001)：

0级：无病

1级：每穗有1个稻曲球或染病稻粒

2级：每穗有2个稻曲球或染病稻粒

3级：每穗有3～5个稻曲球或染病稻粒

4级：每穗有6～9个稻曲球或染病稻粒

5级：每穗有10个及10个以上及稻曲球或染病稻粒

本发明的优点：通过准确的定义植株生育期，详细记录接种后温湿度培养条件，优化接种方法、接种时期及温湿度发病条件，可获得稳定高效的稻曲菌接种效果。稻曲菌生长易受温湿度影响，常常会因为室外天气持续高温或骤然降低等剧烈变化而难以得到理想的接种效果。因此，通过本发明可在室内人工控制的条件下，获得稳定高效的接种效果，使稻曲病研究不受气候变化的影响。

表1本发明与对比文献专利申请号03131625.5专利申请的比较

附图说明

序列表SEQID NO：1是稻曲病菌核糖体基因转录间隔区(ITS)部分核苷酸序列。

序列表SEQID NO：2-5是扩增稻曲病菌核糖体基因转录间隔区(ITS)部分核苷酸序列的引物。

图1：培养14天的稻曲病菌落形态(图1a为菌落形态正面，图1b为菌落形态反面)。

图2：培养7天的稻曲菌薄壁分生孢子。

图3：HWD-2分离物的特异性扩增条带。

图4：注射接种方法示意图。

图5：稻曲病发病示意图。

具体实施方式

实施例1稻曲菌菌株HWD-2的分离、筛选和鉴定

1、稻曲菌菌株的分离

2、稻曲菌分类鉴定

采用传统的鉴定方法和分子鉴定等三种方法候选分离物进行了鉴定，具体步骤如下：

(3)分子鉴定：

采用报道的CTAB法(刘少华，2005)提取分离物的培养7天后的菌丝总DNA，按照Zhou Yongli报道的方法进行PCR扩增(Zhou Yongli，2003)，运用稻曲菌ITS序列的特异引物(见序列表SEQ ID NO：2-5所示)进行PCR扩增，用ddH₂O作为阴性对照(见图3)，得到的一条特异性条带(序列长度为233bp)。本实施例所用的特异引物US1-5/US3-3和US2-5/US4-3由上海生工生物工程有限公司合成。

1)引物对的核苷酸序列如下所示：

US1-5：ccggaggatacaaccaaaaaaactct(见序列表SEQ ID NO：2所示)：

US3-3：gctccaagtgcgaggataactgaat(见序列表SEQ ID NO：3所示)：

US2-5：caatgcatgtctgagtggatttttg(见序列表SEQ ID NO：4所示)：

US4-3：ccaacaccaagcgcaagacaga(见序列表SEQ ID NO：5所示)，

2)扩增的特异性条带的核苷酸序列如下(SEQ ID NO：1所示)：

CAATGCATGT CTGAGTGGAT TTTTGCAAAT CAAAATGAAT CAAAACTTTC AACAACGGAT

CTCTTGGTTC TGGCATCGAT GAAGAACGCA GCGAAATGCG ATAAGTAATG TGAATTGCAG

AATTCAGTGA ATCATCGAAT CTTTGAACGC ACATTGCGCC CGCCAGTATT CTGGCGGGCA

TGCCTGTTCG AGCGTCATTT CAACCCTCAA GCTCTGTCTT GCGCTTGGTG TTG

上述扩增的特异性条带(序列长度为233bp)由上海生工生物工程有限公司完成测序。

3)PCR反应体系如下：

反应为nested PCR，包括两轮PCR扩增反应。每个PCR反应体系为25μl，内含10×PCR反应缓冲液2.5μl，dNTPs(10mmol/L)2μl，引物(8μmol/L)2μl，Taq DNA聚合酶(3u/μl)0.2μl，Mg²⁺(25mmol/L)2μl，模板DNA(20～40ng/μl)1μl。同时以灭菌ddH₂代替模板DNA作为阴性对照。反应在PCR仪(580BR10583，bio-rad)中进行。第二轮PCR以1μl第一轮PCR产物为模板。

4)PCR反应条件如下：

95℃预变性3min，95℃变性30s，56℃复性45s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸7min。

实施例2稻曲病接种体的制备

病原菌经培养10天后，取直径为6mm菌丝块放入200mlPSB培养基(PSB培养基成分：按g/L计：马铃薯200g；蔗糖20g；补充蒸馏水至1000ml)中，置28℃，转速180rpm的摇床上振荡培养7-10天，得到菌丝孢子混合液。

稻曲菌菌丝片段+孢子混合液(MHC液)的制备：将以上获得的菌丝孢子混合液用榨汁机打碎(CDE-300E，佛山市顺德区欧科电器有限公司)，3000rpm下离心5min，弃上清液，沉淀用新鲜的PSB培养基悬浮并稀释至孢子浓度10⁶个/ml，即得MHC液。

稻曲菌薄壁分生孢子液的制备：同样将以上获得的菌丝孢子混合液经四层纱布过滤，取滤液，3000rpm下离心5min，弃上清液，沉淀用新鲜的PSB培养基悬浮并稀释至孢子终浓度10⁶个/ml，即得薄壁分生孢子液。

实施例3不同接种体对稻曲病发病的影响

在水稻孕穗期，用10ml注射器向穗苞内注射制备好的10⁶个/ml浓度的薄壁分生孢子液2ml和同等孢子浓度的MHC液2ml，直至接种液从穗苞顶部溢出。接种后将水稻放置在植物生长箱(型号：ZSX1500GS，武汉瑞华仪器设备有限责任公司)内，于25℃、95％RH条件下保湿培养3天，然后移至喷灌网室(十字式悬挂微喷系统，江西贝嘉实业有限公司)，白天每2小时喷水一次，夜间每4小时喷水一次，保持温度在25-32℃，湿度90％-98％。接种3周后调查稻曲病的病穗率％和病情指数。

结果表明，在水稻孕穗期注射接种稻曲菌薄壁分生孢子液，可使病穗率达到83.0％，病情指数可达56；注射接种同样浓度的MHC液进行喷雾接种，可使病穗率达到82.0％，病情指数可达44。两种接种体对稻曲病发病并无显著差异。

实施例4稻曲病接种方法的试验

1、注射接种：在水稻孕穗期，用10ml注射器向穗苞内注射制备好的10⁶个/ml浓度的薄壁分生孢子液2ml，直至接种液从穗苞顶部溢出(见图一)。接种后将水稻放置在植物生长箱(型号：ZSX1500GS，武汉瑞华仪器设备有限责任公司)内，于25℃、95％RH条件下保湿培养3天，然后移至喷灌网室(十字式悬挂微喷系统，江西贝嘉实业有限公司)，白天每2小时喷水一次，夜间每4小时喷水一次，保持温度在25-32℃，湿度90％-98％。接种3周后调查稻曲病的病穗率％和病情指数。

2、喷雾接种：在水稻扬花期，用手动喷雾器向稻穗上均匀喷洒制备好的10⁶个/ml浓度的薄壁分生孢子液，均匀喷洒直至稻穗被孢子液完全润湿。接种后将水稻放置在植物生长箱(型号：ZSX1500GS，武汉瑞华仪器设备有限责任公司)内，于25℃、95％RH条件下保湿培养3天，然后移至喷灌网室(十字式悬挂微喷系统，江西贝嘉实业有限公司)，白天2小时喷一次水，夜间4小时喷一次水，保持温度在25-32℃，湿度90％-98％。接种3周后调查稻曲病病穗率％和病情指数。

结果表明，在水稻孕穗期注射接种稻曲菌薄壁分生孢子液，可使病穗率达到83.0％，病情指数可达56；但在水稻扬花期用同样浓度的分生孢子液进行喷雾接种，病穗率和病情指数均为0。说明注射接种法是一种有效的室内接种方法。

实施例5稻曲病接种时期的试验

在水稻幼穗不同分化时期，即叶枕距2～17cm时，用10ml注射器向穗苞内注射制备好的10⁶个/ml浓度的MHC液2ml，直至接种液从穗苞顶部溢出。接种后的水稻放置在植物生长箱(型号：ZSX1500GS，武汉瑞华仪器设备有限责任公司)内，于25℃、95％RH条件下保湿培养5天，然后移至喷灌网室，白天每2小时喷水一次，夜间每4小时喷水一次，保持温度在25-32℃，湿度90％-98％。接种3周后调查稻曲病病穗率％和病情指数。

结果表明，在水稻幼穗分化7期接种稻曲菌MHC液，稻曲病发病效果良好，病穗率为94％，病情指数为64(见表2)。

实施例6接种后不同温湿度培养条件的试验

在水稻幼穗分化7期，用10ml注射器向穗苞内注射制备好的10⁶个/ml浓度的薄壁分生孢子液2ml，直至接种液从穗苞顶部溢出。接种后的水稻放置在植物生长箱(型号：ZSX1500GS，武汉瑞华仪器设备有限责任公司)内，于25℃、95％RH下保湿培养3天，然后移至喷灌网室，分别设置于两种种不同温湿度培养条件下，培养条件一：白天每2小时喷水一次，夜间每4小时喷水一次，保持温度在25-32℃，湿度90％-98％；培养条件二：白天每4小时喷水一次，夜间每6小时喷水一次，保持温度在16-28℃，湿度90％-98％；接种3周后调查稻曲病病穗率％和病情指数。

结果表明，接种后不同的温湿度培养条件对稻曲病病穗率和病情指数的影响存在显著差异。接种后将水稻植株移至培养条件一(即温度25-32℃、湿度90％-98％)中培养，稻曲病病穗率和病情指数分别可达到83％和56；接种后置于培养条件二(即温度16-28℃、湿度90％-98％)中培养，水稻病穗率和病情指数分别可达到25.0％和11.0(见表3)。因此，接种后将水稻放置在喷灌网室中培养，设置喷水条件为白天每2小时喷水一次，夜间每4小时喷水一次，保持温度25-32℃、湿度90％-98％，可获得较好的发病效果。

表2不同水稻幼穗分化期对稻曲病发病的影响

表3接种后不同温湿度培养条件对稻曲病发病的影响

主要参考文献

1、黄祥辉，水稻栽培生理，上海科学技术出版社，1978。

2、方中达.植病研究方法(第三版).北京：中国农业出版社，1998。

3、李阳等，稻曲病菌无性孢子萌发及在不同培养基上生长特性，植物保护学报，2008第35卷第1期。

4、唐春生等，稻曲病病情分级标准的研究和应用，植物保护2001，第27卷第1期。

5、王大为等，稻曲病研究进展，辽宁农业科学(1)：21-24。

6、Zhou Yongli，PCR-based Specific Detection of Ustilaginoidea virens and Ephelis japonica，J.Phytopathology(2003)151，513-518。

7、刘少华，一种快速简便的植物病原真菌基因组DNA提取方法，植物病理学报2005，35(4)。

8、中国发明专利公开说明书，申请号03131625.5，公开号CN1460406(发明名称：高效引发稻曲病的接种方法)。

Claims

1.一种高效稳定的稻曲病菌的室内接种方法，其特征在于，它包含下列步骤：

1)取直径为6mm的PSA培养基上培养7天的保藏号为CCTCC NO：M2011023号的稻曲病菌HWD-2的菌丝块1块，放入200mlPSB培养基中，置于28℃、转速180rpm的摇床上振荡培养7-10天，将所得的菌丝孢子混合液经四层纱布过滤，取滤液，于3000rpm下离心5min，弃上清，沉淀用新鲜的PSB培养基悬浮并将孢子终浓度稀释至10⁶个/ml，即得薄壁分生孢子液；

2)在水稻幼穗分化第7期，用10ml注射器从穗苞中上部插入，向穗苞内注射制备好的薄壁分生孢子液2ml，直至接种液从穗苞顶部溢出；

3)将接种后的水稻植株放置在植物生长箱内，于25℃、95％RH下保湿培养3天，然后移至喷灌网室，白天每2小时喷水一次，夜间每4小时喷水一次，保持温度在25-32℃，湿度90-98％；

其中

步骤1)所述的PSA培养基的组分及配比如下：

按g/L计：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂粉12g；补充蒸馏水至1000ml；

步骤1)所述的PSB培养基的组分及配比如下：

按g/L计：马铃薯200g，蔗糖20g，补充蒸馏水至1000ml。

2.一种分离的稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)HWD-2，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2011023号。

3.权利要求2所述的菌株在稻曲病接种中的应用。