CN110679322A - 一种水稻细菌性穗枯病的人工接种方法 - Google Patents

一种水稻细菌性穗枯病的人工接种方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种水稻细菌性穗枯病的人工接种方法，其特征在于：包括以下步骤：S1.采用颖壳伯克氏菌菌液配置接种体；S2.接种的时期为水稻孕穗期，有利于病菌的定殖；S3.接种方法为注射，通过注射器将步骤S1中配置的接种体由下往上注射进水稻茎秆中空孕穗部位；S4.接种后以病穗数和病粒数计算发病率和病情指数。这是一种水稻细菌性穗枯病高效的接种方法，能广泛用于穗枯病菌的致病性分型，水稻品种的抗性鉴定以及病原菌和水稻互作研究，有助于筛选出抗性较好的优良品种，解决目前生产上穗枯病抗性品种缺乏的问题，对水稻穗枯病的抗性育种研究有重要的推动作用。

Description

一种水稻细菌性穗枯病的人工接种方法
技术领域
本发明属于植物病理学领域的病原菌接种方法，特别一种涉及水稻细菌性穗枯病的人工接种方法。
背景技术
水稻细菌性穗枯病(Bacterial panicle blight of rice，BPBR)，又称细菌性谷枯病是由颖壳伯克氏菌(Burkholderia glumae)引起的世界性水稻病害之一。该病在亚洲、非洲和美洲都有发生，引起水稻秧苗枯萎腐烂、谷粒瘪壳、变褐和腐坏，造成产量损失最高可达80％。
2007年，水稻细菌性穗枯病在中国被列为检疫性病害，但近年来由于气候改变、水稻品种(组合)的更换、耕作栽培制度的变化等因素，该病目前正在中国发生和蔓延，成为新近快速上升的细菌性病害。因此，科学地预防和控制穗枯病是生产上亟待解决的首要问题。栽培抗病品种是防治穗枯病最为有效的方法，水稻种质资源与品种抗性鉴定和评价则是关键。而其中，快速、简便、高效的人工接种方法是抗性鉴定可靠准确的保障。
穗枯病的抗性鉴定和评价方法有自然诱发和人工接种两种。田间自然诱发由于受到田间菌源基数和温湿度的影响，会导致不发病或发病不充分，并且鉴定的一致性和稳定性较差，该方法较少使用。目前已报道的穗枯病人工接种方法主要是水稻抽穗期菌液喷雾接种法(Mizobuchi1R.et al.Mapping a quantitative trait locus for resistance tobacterial grain rot in rice.Rice,2013,6:13)：剪取出穗3天的稻穗，108cfu/mL的菌液喷雾，保鲜袋套盖，清水培养，放置光照培养箱(先25℃，相对湿度100％，20h；然后27℃，相对湿度>80％；光照14h/黑暗10h)，6-7天后观察发病情况。但在试验中发现该方法不但保湿措施费时，而且接种效率低，发病程度差异很大，出现了喷雾后不发病或发病不理想的问题，严重阻碍了水稻细菌性穗枯病抗性研究。
发明内容
本发明设计了一种高效的水稻细菌性穗枯病人工接种方法。
为了解决上述存在的技术问题，本发明采用了以下方案：
所述的一种水稻细菌性穗枯病的人工接种方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.采用颖壳伯克氏菌菌液配置接种体；
S2.接种时期为水稻孕穗期，有利于病菌的定殖和发病；
S3.接种方法为注射，通过注射器将步骤S1中配置的接种体由下往上注射进水稻茎秆中空孕穗部位；
S4.接种后以病穗数和病粒数记录水稻发病情况，计算发病率以及病情指数。
所述的水稻细菌性穗枯病的人工接种方法，其特征在于：步骤S1中所述的接种体由以下步骤获取：
S11.取-70℃冻存的颖壳伯克氏菌标准菌株LMG2196，以1:1000的比例转接含50μg/mL的氨苄的NA液体培养基；
S12.在37℃，200rpm/min的条件下培养16-24h；
S13.将步骤S22培养后的菌液通过灭菌蒸馏水稀释直至菌液的OD600值为0.2-0.3。
所述的水稻细菌性穗枯病的人工接种方法，其特征在于：所述步骤S3中，注射的具体位置为水稻倒数第一片叶下5-7cm。
所述的水稻细菌性穗枯病的人工接种方法，其特征在于：所述步骤S3中，所述接种体的注射量为0-1mL，至茎秆顶端有菌液溢出。
所述的水稻细菌性穗枯病的人工接种方法，其特征在于：所述步骤S3中，所述接种是在日均气温大于30℃，相对湿度大于75％的环境进行。
所述的水稻细菌性穗枯病的人工接种方法，其特征在于：所述步骤S3中，所述接种的具体时间是傍晚16:00-18：00。所述的水稻细菌性穗枯病的人工接种方法，其特征在于：所述接种体的注射量为0.5ml。
所述的水稻细菌性穗枯病的人工接种方法，其特征在于：所述步骤S3中，在每植株水稻上至少注射3个分蘖。
该水稻细菌性穗枯病的人工接种方法具有以下有益效果：
本发明简便、快速、高效、安全，3-4周后统计发病率达100％，病情指数高达75以上。这是水稻细菌性穗枯病高效的接种方法，能广泛用于穗枯病菌的致病性分型，水稻品种的抗性鉴定以及病原菌和水稻互作研究，有助于筛选出抗性较好的优良品种，解决目前生产上穗枯病抗性品种缺乏的问题，对水稻抗穗枯病的育种研究也有重要的推动作用。
附图说明
图1两种接种方法的接种效果比较。A：孕穗期茎秆注射的症状；B：抽穗期喷雾接种的症状；C:两种接种方法的发病率；D:两种接种方法的病情指数。品种：甬优；栽培方式：自然条件下盆栽。
图2孕穗期茎秆注射的发病情况。A：大田孕穗期茎秆注射的症状；B：发病率；C：病情指数。品种：华占；栽培方式：大田。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式作进一步详述，使本发明技术方案更易于理解和掌握。
一种高效的水稻细菌性穗枯病人工接种方法，包括以下步骤：
(1)取-70℃冻存的颖壳伯克氏菌株LMG2196(浙江大学谢关林教授馈赠)，以1:1000的比例转接NA液体培养基，培养基中含有50μg/mL的氨苄，在37℃，200rpm/min的条件下培养16-24h，采用灭菌的蒸馏水稀释菌液，使其OD600值在0.2-0.3，作为接种体。
(2)下午16:00-17:00时左右，在水稻茎秆中空的孕穗部位(即倒数第一片叶下约5-7cm处)用1mL医用灭菌注射器由下往上注射配置好的菌液约0.5mL，至茎秆顶端有菌液溢出。
(3)步骤(2)中所接种的水稻的生长时期为10-12周(孕穗期)。
(4)在日均气温大于30℃，相对湿度大于75％的环境中进行步骤(2)的接种操作。
(5)接种3-4周后调查病情，以病穗数和病粒数为调查指标。
(6)计算水稻细菌性穗枯病的发病率，发病率计算公式：(发病穗数/接种总穗数)X100％。
(7)计算水稻细菌性穗枯病的病情指数，病情指数计算公式：[Σ(各级稻穗数x相应级数)/(调查总稻穗数x最高级数)]x 100。
其中，病情分级标准：见表1
表1水稻抗细菌性穗枯病评价分级标准
病情级别 平均病粒比率
0级 稻穗未变色
1级 1-20％谷粒变色
3级 21-40％谷粒变色
5级 41-60％谷粒变色
7级 61-80％谷粒变色
9级 >81％谷粒变色
实施例1
结合图1，种植品种为甬优的水稻，于5月20日左右，甬优按照常规浸种、播种25-30天后移栽蓝色塑料盆，其中塑料盆长50cm，宽35cm，高16cm，每盆9棵，每个品种设置有三个重复样本，放置室外自然条件下栽培管理，待植株长至孕穗期用于接种试验。
制作接种菌液：将-70℃冻存的颖壳伯克氏菌标准菌株LMG2196，以1:1000的比例转接NA液体培养基，培养基中含50μg/mL的氨苄，在37℃，200rpm/min的条件下培养16-24h，采用灭菌的蒸馏水稀释菌液使其OD600值在0.2-0.3，将得到的菌液A作为接种体。
孕穗期茎秆注射接种：待甬优水稻播种后约10-12周，即孕穗期，在下午16:00-17:00时，选取水稻茎秆中空的孕穗部位，即倒数第一片叶下约5-7cm处，用左手的食指和中指抵住茎秆的背面，右手拿住1mL医用注射器顺着与茎秆平行的方向由下往上慢慢注射0.5mL左右的LMG2196的菌液A，至茎秆顶端有菌液溢出为止。每个植株注射3个分蘖，每盆注射27个分蘖，3个重复，放置室外自然条件下，每日观察及时记录发病情况。
计算发病率及发病指数：注射接种后跟踪调查发病情况，约4周后，调查穗发病率和谷粒变色比率(每穗红褐色谷粒占总谷粒数的百分比)，按照表1的分级标准计算病情指数。
穗发病率＝(发病穗数/接种总穗数)x 100％；
病情指数＝[Σ(各级稻穗数x相应级数)/(调查总稻穗数x最高级数)]x 100。
传统抽穗期喷雾接种：水稻抽穗2-3天后，下午16:00-17:00时喷洒OD600值约0.4的接种菌液，其中含0.01％的吐温20，约4周后调查病情，计算发病率和病情指数。
本实施例中，采用水稻细菌性穗枯病孕穗期茎秆注射方法接种水稻品种甬优约4周后，感病稻穗产生典型的穗枯病症状谷粒变色(红褐色病斑)、灌浆不充实、瘪壳(图1A)，其发病率为100％(图1C)，病情指数高达85(图1D)，且在病粒上能在再次分离到颖壳伯克氏菌LMG2196
采用传统抽穗期喷雾接种，病变谷粒(变色、瘪壳)，较谷粒孕穗期茎秆注射的少(图1B)；发病率只有63％，病情指数也只有20％，显著低于孕穗期茎秆注射接种的发病率100％和病情指数85(图1C和1D)(P<0.01)。
实施例2
结合图2，种植品种为华占的水稻，5月20日左右，将华占按照常规浸种、播种25-30天后移栽大田，4行，每行6棵，行间距为20cm，株距为16cm，每个品种三个重复，常规大田管理，待植株长至孕穗期用于接种试验。
制作接种菌液：将-70℃冻存的颖壳伯克氏菌标准菌株LMG2196，以1:1000的比例转接NA液体培养基，培养基中含50μg/mL的氨苄，在37℃，200rpm/min的条件下培养16-24h，采用灭菌的蒸馏水稀释菌液使其OD600值在0.2-0.3，将得到的菌液A作为接种体。
孕穗期茎秆注射接种：待华占播种后约10周，即孕穗期，在下午16:00-17:00时，选取水稻茎秆中空的孕穗部位，即倒数第一片叶下约5-7cm处，用左手的食指和中指抵住茎秆的背面，右手拿住1mL医用注射器顺着与茎秆平行的方向由下往上慢慢注射0.5mL左右的LMG2196的菌液A，至茎秆顶端有菌液溢出为止。注射24个植株，每个植株注射3个分蘖，3个重复，每日观察及时记录发病情况。
计算发病率及发病指数：注射接种后跟踪调查发病情况，约4周后，调查穗发病率和谷粒变色比率(每穗红褐色谷粒占总谷粒数的百分比)，按照表1的分级标准计算病情指数。
穗发病率＝(发病穗数/接种总穗数)x 100％；
病情指数＝[Σ(各级稻穗数x相应级数)/(调查总稻穗数x最高级数)]x 100。
本实施例提供的水稻细菌性穗枯病孕穗期茎秆注射方法接种水稻品种华占后，感病稻穗产生典型的穗枯病症状：谷粒红褐色病斑、灌浆不充实/瘪壳(图2A)；其发病率为100％(图2B)，病情指数高达76(图2C)。
具体来说，采用孕穗期茎秆注射的方法，对自然条件下盆栽的甬优和大田种植的华占进行了水稻细菌性穗枯病的接种试验，试验结果表明不论是在盆栽还是大田的种植环境下，孕穗期茎秆注射的接种方法发病率高，症状典型且病情严重，是一种非常简单、方便、高效的接种方法，可以广泛应用到穗枯病的抗性鉴定评价，病原致病性分型，病原与寄主互作等研究，为预防和防治该病提供了强有力的技术保障。
上面结合附图对本发明进行了示例性的描述，显然本发明的实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种水稻细菌性穗枯病的人工接种方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.采用颖壳伯克氏菌菌液配置接种体；
S2.在水稻孕穗期进行接种，孕穗时，茎秆内稳定封闭的环境可以为病菌定殖提供充足的营养和较高的湿度，利于发病；
S3.采用注射的接种方法，选取水稻茎秆中空孕穗部位，通过注射器由下而上将步骤S1中配置的接种体注射进茎秆内；
S4.接种后通过病穗数和病粒数记录水稻发病情况，计算发病率以及病情指数。
2.根据权利要求1所述的水稻细菌性穗枯病的人工接种方法，其特征在于：步骤S1中所述的接种体由以下步骤获取：
S11.取-70℃冻存的颖壳伯克氏菌标准菌株，以1:1000的比例转接含50μg/mL的氨苄的NA液体培养基；
S12.在37℃，200rpm/min的条件下培养16-24h；
S13.将步骤S12培养后的菌液通过灭菌蒸馏水稀释直至菌液的OD600值为0.2-0.3。
3.根据权利要求1所述的水稻细菌性穗枯病的人工接种方法，其特征在于：所述步骤S3中，注射的具体位置为水稻倒数第一片叶下5-7cm。
4.根据权利要求1所述的水稻细菌性穗枯病的人工接种方法，其特征在于：所述步骤S3中，所述接种体的注射量为0-1mL，至茎秆顶端有菌液溢出。
5.根据权利要求1所述的水稻细菌性穗枯病的人工接种方法，其特征在于：所述步骤S3中，所述接种是在日均气温大于30℃，相对湿度大于75％的环境进行。
6.根据权利要求1所述的水稻细菌性穗枯病的人工接种方法，其特征在于：所述步骤S3中，所述接种具体时间是傍晚16:00-18:00之间。
7.根据权利要求4所述的水稻细菌性穗枯病的人工接种方法，其特征在于：所述接种体的注射量为0.5mL。
8.根据权利要求1所述的水稻细菌性穗枯病的人工接种方法，其特征在于：所述步骤S3中，在每植株水稻上至少注射3个分蘖。
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