CN102517376A - 一种桑树抗青枯病能力鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种桑树抗青枯病能力鉴定方法，通过在室内将具有一定苗龄的待鉴定不同抗性品种或品系及抗、感病对照桑苗，水培后将伤根接种于青枯病原菌菌液中，控制发病条件，然后调查发病情况并按照抗性评价标准进行评价，获得不同抗病能力的桑树品种或品系。该方法操作简单、结果准确可靠、重复性好。在桑树抗青枯病能力的鉴定、抗病资源的评价、抗病育种材料的筛选等方面应用潜力较大。
Description
技术领域
本发明涉及一种桑树抗青枯病能力鉴定方法。
背景技术
桑树细菌性青枯病是威胁我国蚕桑生产的主要桑树病害之一，在华南蚕区发病尤为严重，目前种植抗青枯病的桑树品种是防治该病的最根本方法，但桑树种质资源中已经鉴定筛选出的用于抗青枯病育种的抗性材料较少，且由于桑树作为一种多年生木本植物，其抗青枯病能力的评价筛选方法与蔬菜和其它作物有很大不同，这些都严重制约着桑树抗青枯病新品种的选育。
目前对桑树抗青枯病材料的鉴定筛选主要是通过田间自然接种鉴定和室内人工接种鉴定等方法进行。田间自然接种鉴定，需在发生病害比较严重，土壤质地、肥力和发病程度均匀一致的地块进行，鉴定周期较长，且易受外界环境等因素影响，结果不稳定。室内人工接种主要是采用无土栽培大树悬浮液接种和离体桑枝注射接种等方法，前者由于桑树是多年生木本植物，接种费工、费时、成本高；后者虽然操作简单，但不足之处是必须依赖于成熟的离体培养体系，而目前桑树桑枝离体培养受品种类型等条件的制约，有些品种桑枝离体后即萎蔫，较难成活，因而难以进行抗青枯病材料的离体筛选。
发明内容
本发明的目的在于提供一种桑树抗青枯病能力鉴定方法，该方法具有操作简单、结果准确可靠、重复性好特点。
本发明通过在室内将具有一定苗龄的待鉴定不同抗性品种或品系及抗、感病对照桑苗，水培一定时间后伤根接种于一定浓度的青枯病原菌菌液中，控制发病条件，一定时间后调查发病情况并按照一定抗性评价标准进行评价。
本发明的上述目的是通过如下技术手段来实现的：一种桑树抗青枯病能力鉴定方法，含以下步骤：
(1)桑苗的培育 培育待鉴定的不同品种或品系的桑树苗、感病对照桑树品种塘10×伦109的桑树苗和抗病对照桑树品种283×抗青10号的桑树苗；
(2)桑苗的处理 前期为苗圃育苗，后期为水培，待桑苗生长到3-5片叶，苗龄3-5个月时，将待鉴定及抗、感病对照桑苗小心移出植株，用水轻轻洗净根部育苗基质，移植于盛水容器中，水培成活一周后，用于抗病性鉴定；
(3)接种 将待鉴定的不同抗性品种或品系的桑树苗、感病对照桑树品种塘10×伦109桑树苗和抗病对照桑树品种283×抗10桑树苗侧根剪去，然后将伤根浸泡于桑树青枯病菌液中进行接种鉴定，获得不同抗病能力的桑树品种或品系。
本发明步骤(1)中培育待鉴定抗青枯病能力的不同抗性品种或品系的桑树苗、感病对照桑树品种塘10×伦109桑树苗和抗病对照桑树品种283×抗10桑树苗的过程是：将待鉴定抗青枯病能力的不同抗性品种或品系的桑种子、感病对照桑品种塘10×伦109的桑种子和抗病对照桑树品种283×抗10的桑种子播种于无青枯病发病史的苗圃中，按常规水肥条件管理。
本发明步骤(3)中桑树青枯病菌液中青枯病致病菌的浓度为3×108～1×109cfu/mL。
本发明步骤(3)中将待鉴定的不同抗性品种或品系的桑树苗、感病对照桑树品种塘10×伦109桑树苗和抗病对照桑树品种283×抗10桑树苗侧根剪去0.2～0.5cm，然后将伤根接种于待接种菌液中调节温度为28-35℃、空气相对湿度大于75％下进行接种鉴定。
本发明步骤(3)中反应不同抗病能力的桑树品种或品系的具体参数的获取过程为：从菌液处理伤根后第3天开始记录，前期每隔2天，11天后每隔3天调查记录发病情况及死亡株数，连续调查20天，计算病情指数。
选取感病对照桑树品种塘10×伦109桑苗病情指数达到80及以上时的数据，通过以下公式计算病情指数DI；
桑树青枯病病害严重度分级标准
0级：叶片无萎蔫症状；
1级：整株的1/2或以下叶片出现萎蔫症状；
2级：整株的1/2以上叶片出现萎蔫症状；
3级：整株死亡；
以病情指数DI评价各供试品种或品系的抗病程度，共分为5级，DI≤15时为强抗HR；15＜DI≤30为中抗MR，30＜DI≤45为弱抗LR，45＜DI≤60为感病S，DI＞60为易感HS。
本发明具有以下优点：
(1)本发明方法克服了传统鉴定方法中由于桑树是多年生木本植物，抗性鉴定费工、费时、成本高且环境条件无法控制导致抗性结果不理想等缺点，可以在室内一年多次大批量进行鉴定，具有操作简单、结果准确可靠、重复性好特点；
(2)本发明在桑树抗青枯病能力的鉴定、抗病资源的评价、抗病育种材料的筛选等方面应用潜力较大。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供的桑树抗青枯病能力鉴定方法，含以下步骤：
(1)供试品种 待鉴定的不同抗性桑树杂交品系果选04-19×抗10、283×LK2、LK3×果选04-10，共3个供试品种，其中采用塘10×伦109作为感病对照，283×抗10作为抗病对照；
(2)桑苗的培育 将待鉴定的不同抗性桑树杂交品系果选04-19×抗10、283×LK2、LK3×果选04-10及感病对照塘10×伦109、抗病对照283×抗10桑品种的桑种子播种于无菌育苗圃中，按常规水肥条件管理，待桑苗生长到3-5片叶，苗龄3-5个月时，将待鉴定及抗、感病对照桑苗小心移出植株，用水轻轻洗净根部育苗基质，移植于盛水容器中，水培成活一周后，用于抗病性鉴定；
(3)接种 将待鉴定及抗、感病对照桑树苗侧根剪去0.2～0.5cm，伤根接种于桑树青枯病菌液中，其中桑树青枯病致病菌选自广东省农业科学研究院，应用前先将桑树青枯病原菌划线接种于TTC培养基上活化48h，挑取单菌落，接种于LB培养基中，32℃温度下培养36小时后，5000rmp，离心时间10min，去除上清液，将菌体配制成大约1×109cfu/mL浓度的待接种菌液；然后用电炉调节温度为28℃，补湿器调节空气相对湿度大于75％条件下接种鉴定；
(4)抗性评价 从菌液处理伤根后第3天开始调查，前期每隔2天，11天后每隔3天调查记录发病情况及死亡株数，连续调查20天，计算病情指数。当感病对照桑树品种塘10×伦109桑苗病情指数达到80及以上时，本次试验为有效统计。
桑树青枯病病害严重度分级标准
0级：叶片无萎蔫症状；
1级：整株的1/2或以下叶片出现萎蔫症状；
2级：整株的1/2以上叶片出现萎蔫症状；
3级：整株死亡；
以病情指数(DI)评价各供试品种或品系的抗病程度，共分为5级，DI≤15时为强抗(HR)；15＜DI≤30为中抗(MR)，30＜DI≤45为弱抗(LR)，45＜DI≤60为感病(S)，DI＞60为易感(HS)。
其中各级病情指数为根据桑树青枯病病害严重度分级标准获得的株数。
具体结果见下表1：结果表明，感病对照塘10×伦109的病情指数达到85.83，统计评价结果有效。抗病对照283×抗10作为已经在蚕桑生产上大面积推广的中抗桑树青枯病品种，我们室内苗期鉴定结果其病情指数为20.00，评价结果为中抗青枯病，与生产上推广鉴定结果一致。本实验在苗龄为3～5个月，接种浓度为1×109cfu/mL，控制一定温湿度的条件下，可以明显的将抗性材料和感病材料区分开。
表1不同抗性杂交组合及对照抗青枯病力的室内水培伤根接种鉴定结果
(5)鉴定方法有效性的验证
选用桑树苗期伤根接种鉴定筛选出的3个不同抗性杂交组合及感病对照桑树品种塘10×伦109、抗病对照桑树品种283×抗10，育苗3个月后栽种于青枯病发病严重的广州市萝岗区桑树青枯病发病严重的地块。田间设计顺序排列，设3个小区重复，每个小区中待鉴定3个桑树杂交组合和抗、感对照种植3行，每行30棵，3个小区共种植待鉴定的每个杂交组合和抗、感对照各270棵。管理方式按照每年3造降枝养蚕方式进行管理，每造剪枝后第10天调查，连续调查3年，统计其发病及死亡株数，进行抗性评价，以病情指数(DI)评价各供试品种或品系的抗病程度，病害严重度分级标准与室内接种评价相同(无感病对照桑树品种塘10×伦109桑苗病情指数达到80及以上时，统计有效要求)，以验证室内苗期伤根接种桑树病原菌快速鉴定方法的有效性，具体结果见表2。
结果表明，3个不同抗性杂交组合及抗、感病对照桑树品种的抗青枯病力田间自然接种鉴定结果与室内苗期接种鉴定结果基本一致，说明利用室内水培苗期接种桑树青枯病菌进行抗病性鉴定是有效的。
表2不同抗性杂交组合及对照抗青枯病力的田间自然接种鉴定结果
实施例2
本实施例提供的桑树抗青枯病能力鉴定方法，含以下步骤：
(1)供试品种 待鉴定的不同抗性桑树杂交品系果选69×98-8、04-77×抗选06-10、04-55×LK2、LK3×98-8、LK3×LK2、283×抗选06-10共6个供试品种，其中采用塘10×伦109作为感病对照，283×抗10作为抗病对照；
(2)桑苗的培育 将待鉴定的不同抗性桑树杂交品系果选69×98-8、04-77×抗选06-10、04-55×LK2、LK3×98-8、LK3×LK2、283×抗选06-10共6个供试品种及感病对照塘10×伦109、抗病对照283×抗10桑品种的桑种子播种于无菌育苗圃中，按常规水肥条件管理，待桑苗生长到3～5片叶，苗龄3～5个月时，将待鉴定及抗、感病对照桑苗小心移出植株，用水轻轻洗净根部育苗基质，移植于盛水容器中，水培成活一周后，用于抗病性鉴定；
(3)接种 将待鉴定及抗、感病对照桑树苗侧根剪去0.2～0.5cm，伤根接种于桑树青枯病菌液中，其中桑树青枯病致病菌选自广东省农业科学研究院，应用前先将桑树青枯病原菌划线接种于TTC培养基上活化48h，挑取单菌落，接种于LB培养基中，32℃温度下培养36小时后，5000rmp，离心时间10min，去除上清液，将菌体配制成大约3×108cfu/mL浓度的待接种菌液；然后用电炉调节温度为28℃，补湿器调节空气相对湿度大于75％条件下接种鉴定；
(4)抗性评价从菌液处理伤根后第3天开始调查，前期每隔2天，11天后每隔3天调查记录发病情况及死亡株数，连续调查20天，计算病情指数。当感病对照桑树品种塘10×伦109桑苗病情指数达到80及以上时，本次试验为有效统计。
桑树青枯病病害严重度分级标准
0级：叶片无萎蔫症状；
1级：整株的1/2或以下叶片出现萎蔫症状；
2级：整株的1/2以上叶片出现萎蔫症状；
3级：整株死亡；
以病情指数(DI)评价各供试品种或品系的抗病程度，共分为5级，DI≤15时为强抗(HR)；15＜DI≤30为中抗(MR)，30＜DI≤45为弱抗(LR)，45＜DI≤60为感病(S)，DI＞60为易感(HS)。
具体结果见下表3：
表3不同抗性杂交组合及对照抗青枯病力的室内水培伤根接种鉴定结果
(5)田间自然接种鉴定：待鉴定的不同抗性桑树杂交品系果选69×98-8、04-77×抗选06-10、04-55×LK2、LK3×98-8、LK3×LK2、283×抗选06-10共6个供试品种，其中采用塘10×伦109作为感病对照，283×抗10作为抗病对照。6个杂交组合和抗、感对照桑品种育苗3个月后栽种于青枯病发病严重的广州市萝岗区、韶关市翁源县和茂名市化州市三个地区桑树青枯病发病严重的地块。田间设计顺序排列，每个地区设3个小区重复，每个小区中种植待鉴定6个桑树杂交组合和抗、感对照各3行，每行10棵，每个地区3个小区共种植待鉴定的每个杂交组合和抗、感对照各90棵。管理方式按照每年3造降枝养蚕方式进行管理，每造剪枝后第10天调查，连续调查3年，统计其发病及死亡株数，进行抗性评价，以病情指数(DI)评价各供试品种或品系的抗病程度，病害严重度分级标准与室内接种评价相同，以验证室内苗期伤根接种桑树病原菌快速鉴定方法的有效性。具体结果见下表4：
表4不同抗性杂交组合及对照抗青枯病力的田间自然接种鉴定结果
结果表明，6个不同抗性杂交组合及抗、感病对照桑树品种的抗青枯病力田间自然接种鉴定的病情指数与室内苗期接种鉴定的病情指数虽然有一定差异，但评价鉴定结果基本一致，同样说明利用室内水培苗期接种桑树青枯病菌进行抗病性鉴定是有效的，能够快速、全面的反映桑树品种或品系的抗青枯病能力。
以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。
Claims (6)
1.一种桑树抗青枯病能力鉴定方法，其特征是含以下步骤：
(1)桑苗的培育 培育待鉴定的不同品种或品系的桑树苗、感病对照桑树品种塘10×伦109的桑树苗和抗病对照桑树品种283×抗青10号的桑树苗；
(2)桑苗的处理 前期为苗圃育苗，后期为水培，待桑苗生长到3-5片叶，苗龄3-5个月时，将待鉴定及抗、感病对照桑苗小心移出植株，用水轻轻洗净根部育苗基质，移植于盛水容器中，水培成活一周后，用于抗病性鉴定；
(3)接种 将待鉴定的不同抗性品种或品系的桑树苗、感病对照桑树品种塘10×伦109桑树苗和抗病对照桑树品种283×抗10桑树苗侧根剪去，然后将伤根浸泡于桑树青枯病菌液中进行接种鉴定，获得不同抗病能力的桑树品种或品系。
2.根据权利要求1所述的桑树抗青枯病能力鉴定方法，其特征是：步骤(1)中培育待鉴定抗青枯病能力的不同抗性品种或品系的桑树苗、感病对照桑树品种塘10×伦109桑树苗和抗病对照桑树品种283×抗10桑树苗的过程是：将待鉴定抗青枯病能力的不同抗性品种或品系的桑种子、感病对照桑品种塘10×伦109的桑种子和抗病对照桑树品种283×抗10的桑种子播种于无青枯病发病史的苗圃中，按常规水肥条件管理。
3.根据权利要求1所述的桑树抗青枯病能力鉴定方法，其特征是：步骤(3)中桑树青枯病菌液中青枯病致病菌的浓度为3×108～1×109cfu/mL。
4.根据权利要求1所述的桑树抗青枯病能力鉴定方法，其特征是：步骤(3)中将待鉴定的不同抗性品种或品系的桑树苗、感病对照桑树品种塘10×伦109桑树苗和抗病对照桑树品种283×抗10桑树苗侧根剪去0.2～0.5cm，然后将伤根接种于待接种菌液中调节温度为28-35℃、空气相对湿度大于75％下进行接种鉴定。
5.根据权利要求1所述的桑树抗青枯病能力鉴定方法，其特征是：步骤(3)中反应不同抗病能力的桑树品种或品系的具体参数的获取过程为：从菌液处理伤根后第3天开始记录，前期每隔2天，11天后每隔3天调查记录发病情况及死亡株数，连续调查20天，计算病情指数。
6.根据权利要求5所述的桑树抗青枯病能力鉴定方法，其特征是：选取感病对照桑树品种塘10×伦109桑苗病情指数达到80及以上时的数据，通过以下公式计算病情指数DI；
桑树青枯病病害严重度分级标准
0级：叶片无萎蔫症状；
1级：整株的1/2或以下叶片出现萎蔫症状；
2级：整株的1/2以上叶片出现萎蔫症状；
3级：整株死亡；
以病情指数DI评价各供试品种或品系的抗病程度，共分为5级，DI≤15时为强抗HR；15＜DI≤30为中抗MR，30＜DI≤45为弱抗LR，45＜DI≤60为感病S，DI＞60为易感HS。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20120627 |