CN108342448A - 一种甘蔗杂交组合白条病抗性鉴定及抗病组合筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种甘蔗杂交组合白条病抗性鉴定及抗病组合筛选方法，包括配制甘蔗白条病病原菌菌悬液、甘蔗杂交组合实生苗培育、接种鉴定、病情调查。本发明通过剪叶接种方式对甘蔗杂交组合的白条病抗病性进行鉴定，该方法接近于田间人工接种白条病发病的实际情况，能直观的表现出甘蔗杂交组合对甘蔗白条病的抗性水平；接种甘蔗白条病菌后发病率显著、重演性好、操作简便，对实验设备要求不高，方便开展鉴定工作。本发明在甘蔗杂交组合实生苗移栽大田前对其进行接种，及时淘汰抗病性差的组合和单株，使抗白条病筛选关口提前，节约了土地资源和劳力物力，缩短育种年限，大大提高了抗白条病甘蔗品种选育效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种对甘蔗杂交组合的白条病抗性鉴定及抗病组合筛选方法，属于作物抗性鉴定及抗病品种选育技术领域。
背景技术
由黄单胞杆菌属的甘蔗白色条纹病菌（Xanthomonas albilineans）引致的甘蔗白条病（leaf scald）是世界范围内广泛发生的甘蔗细菌性系统病害。病原菌产生的白条毒素，能够抑制叶绿体DNA复制，阻碍叶绿体分化，导致甘蔗叶片出现白色条纹，干旱、高温等环境因素能提高该病严重度。该病害常为潜伏侵染，潜伏期不表现症状；在合适条件下，呈现慢性型或急性型病状。白条病慢性型症状表现为：发病早期叶片出现与叶脉平行的白色条纹，其数目、长度不一，或细长（1-2 mm宽），或整片叶变白，变白程度亦不尽相同，有些白中略带浅黄，有些白色组织中伴有红褐色斑点或很浅的红线，发病后期部分条纹变成红色坏死线。条纹常常沿中脉背面延伸，可扩展至叶鞘周围呈现紫色色调，蔗株生长点受抑制，易抽侧芽。有时茎秆基部或节间侧芽叶片也具有典型的细长条斑和变白现象。急性型症状的典型特征是茎秆突然萎缩枯死，同时不伴随其他症状。
早在上世纪80年代，我国台湾、福建、广东等省均有甘蔗白条病发生，近些年广西、海南蔗区也出现该病害。这将对我国的甘蔗生产和糖业的可持续发展构成严重威胁。防治甘蔗病害最经济有效的方法就是选育和推广抗病品种。鉴于我国甘蔗白条病发生有逐渐加重的趋势，抗白条病性状急需成为甘蔗育种的主要目标之一。2007年的研究文献表明，甘蔗抗白条病性状属于遗传力较高的性状，适合于有性世代选择。在育种实践中，及时淘汰杂交后代中抗性差的组合，较大程度地提高后一阶段育种群体的抗病水平。常规杂交育种程序选育抗性品种，首先要了解杂交亲本及其选配组合的抗病性，如何快速准确评价亲本和组合的抗病性，并及时挑选抗病组合是目前甘蔗育种家面对的一个瓶颈问题。因此，为了提高抗病品种选育效率，本研究建立了一套快速有效的针对甘蔗杂交组合的甘蔗白条病抗性鉴定方法，并可以在实生苗早期筛选出抗白条病材料，并将其应用于甘蔗白条病抗病育种。
发明内容
本发明目的在于提供一种简便、快速、准确地鉴定甘蔗杂交组合的白条病抗性及抗病组合筛选方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的一种甘蔗杂交组合白条病抗性鉴定及抗病组合筛选方法，其特征在于步骤如下：
（1）配制甘蔗白条病病原菌菌悬液：
取甘蔗白条病病原菌在XAS固体培养基上采用平板划线法活化两次，挑取单菌落在XAL培养液中28 ℃摇床培养12小时，将菌液离心去除上清液，用无菌水稀释为108 CFU/mL，配制成甘蔗白条病病原菌菌悬液，备用；
（2）甘蔗杂交组合实生苗培育：
将各甘蔗杂交组合实生苗假植到育苗穴盘，长至3~4叶完全叶时，备用；
（3）接种鉴定：
将步骤（1）得到的甘蔗白条病病原菌菌悬液通过剪叶接种到步骤（2）所述的各甘蔗杂交组合实生苗叶片上；将接种后的实生苗移入温室，保持室温28-32℃，湿度60-80%；
（4）病情调查：
接种3天后，开始调查甘蔗实生苗白条病发病严重度和发病率，每隔7天调查一次，调查四次，淘汰病情指数＞30%的杂交组合，病情指数≤30%的为抗白条病的杂交组合。
其中，步骤（1）所述的XAS固体培养基配制方法：取蔗糖10g、细菌级蛋白胨5 g、三水合磷酸氢二钾0.5 g、七水合硫酸镁0.25 g、亚硫酸钠0.05 g、溴化钾5 g、4 mg/ml的苯菌灵贮存液0.5 ml，溶于900 ml纯水中，调pH=6.8后定容至1 L，加入琼脂粉15 g，混匀；在121℃下灭菌20分钟；取环己酰亚胺、头孢氨苄、春雷霉素溶于水，配成重量浓度为1%的溶液，用细菌滤器过滤后制成抗生素贮存液，保存；待高压灭菌后的固体培养基凉至45-55℃时，加入抗生素贮存液，使其终浓度为环己酰亚胺100 mg/L、头孢氨苄25 mg/L、春雷霉素50 mg/L。
步骤（1）所述的XAL培养液配制方法：取蔗糖10 g、细菌级蛋白胨5 g、三水合磷酸氢二钾0.5 g、七水合硫酸镁0.25 g、亚硫酸钠0.05 g、溴化钾5 g、琼脂粉15 g、4 mg/ml的苯菌灵贮存液0.5 ml，溶于900 ml纯水中，调pH=6.8后定容至1 L；在121 ℃下灭菌20分钟；取环己酰亚胺、头孢氨苄、春雷霉素溶于水，配成重量浓度为1%的溶液，用细菌滤器过滤后制成抗生素贮存液，保存；待高压灭菌后的培养液的温度不高于55℃时，加入抗生素贮存液，使其终浓度为环己酰亚胺100 mg/L、头孢氨苄25 mg/L、春雷霉素50 mg/L。
步骤（3）所述的剪叶接种法：用无菌剪刀蘸取步骤（1）的甘蔗白条病病原菌菌悬液后，一次性剪掉叶尖，并在完全叶叶片中间剪5 mm大小的伤口；每接种一次叶片，无菌剪刀蘸取一次甘蔗白条病病原菌菌悬液；在剪切下一次叶片前，重新蘸取甘蔗白条病病原菌菌悬浮液。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明通过剪叶接种方式对甘蔗杂交组合的白条病抗病性进行鉴定，该方法接近于田间人工接种白条病发病的实际情况，能直观的表现出甘蔗杂交组合对甘蔗白条病的抗性水平。
2、本发明接种甘蔗白条病菌后发病率显著、重演性好、操作简便，对实验设备要求不高，方便开展鉴定工作。
3、本发明在甘蔗杂交组合实生苗移栽大田前对其进行接种，及时淘汰抗病性差的组合和单株，使抗白条病筛选关口提前，节约了土地资源和劳力物力，缩短育种年限，大大提高了抗白条病甘蔗品种选育效率。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述：
1、配制甘蔗白条病病原菌菌悬液
从广东湛江蔗区种植的甘蔗品种柳城07-506白条病叶片样品中，分离获得病原菌菌株XALC1。将该菌株在XAS培养基上采用平板划线法进行活化两次后，挑选单菌落在XAL培养液中28℃、200 rpm摇床培养12小时，收集菌体，用无菌水调节菌液浓度为108 CFU/mL的甘蔗白条病病原菌菌悬液。
2、甘蔗实生苗的假植
选取3个甘蔗杂交组合Ho95-988×柳城03-182、ROC22×CP84-1198、HoCP85-845×ROC20的实生苗，用常规的方法进行培育。当实生苗生长至2片完全叶时，假植到72孔（54 cm× 28 cm）育苗穴盘，每个组合实生苗60株。实生苗植株长出3-4片完全叶时进行菌液接种。
3、剪叶接种
用无菌剪刀蘸取甘蔗白条病病原菌菌悬液，一只手抓住甘蔗实生苗植株叶片，另一只手用剪刀一次性剪掉叶尖，在完全叶叶片中间剪5 mm大小的伤口。要求每接种一次叶片，无菌剪刀蘸取一次菌悬液，剪切下一次叶片前，必须重新蘸取病原菌悬浮液。接种后实生苗保持温度在28-32 ℃，湿度60-80%。
4、对实生苗进行白条病抗性评价
接种后第3天，开始调查甘蔗组合每株实生苗白条病发病严重度和发病率，并做好记录。每隔7天调查一次，调查四次。实生苗白条病发病严重度按表1标准进行评价，根据每个组合实生苗发病率和发病严重度计算病情指数。
表1 甘蔗杂交组合实生苗白条病叶片发病严重度评判标准
所述的病情指数计算公式为：
病情指数=[∑（发病等级数×相应等级的发病棵数）/（最高发病等级数×总调查棵数）]×100。
按发病等级划分标准进行分级评价，发病等级划分标准见表2，病情指数≤30%的为抗白条病的杂交组合。
表2 甘蔗杂交组合实生苗白条病抗性评价等级标准
5、调查完毕，即接种一个月后，淘汰病情指数大于30%的实生苗杂交组合HoCP85-845×ROC20，其病情指数达45%，而杂交组合Ho95-988×柳城03-182和ROC22×CP84-1198病情指数分别为25%和12%，表现出抗白条病，从中筛选出抗病的实生苗单株移栽大田。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (4)
1.一种甘蔗杂交组合白条病抗性鉴定及抗病组合筛选方法，其特征在于步骤如下：
（1）配制甘蔗白条病病原菌菌悬液：
取甘蔗白条病病原菌在XAS固体培养基上采用平板划线法活化两次，挑取单菌落在XAL培养液中28 ℃摇床培养12小时，将菌液离心去除上清液，用无菌水稀释为108 CFU/mL，配制成甘蔗白条病病原菌菌悬液，备用；
（2）甘蔗杂交组合实生苗培育：
将各甘蔗杂交组合实生苗假植到育苗穴盘，长至3~4叶完全叶时，备用；
（3）接种鉴定：
将步骤（1）得到的甘蔗白条病病原菌菌悬液通过剪叶接种到步骤（2）所述的各甘蔗杂交组合实生苗叶片上；将接种后的实生苗移入温室，保持室温28-32℃，湿度60-80%；
（4）病情调查：
接种3天后，开始调查甘蔗实生苗白条病发病严重度和发病率，每隔7天调查一次，调查四次，淘汰病情指数＞30%的杂交组合，病情指数≤30%的为抗白条病的杂交组合。
2.根据权利要求1所述的一种甘蔗杂交组合白条病抗性鉴定及抗病组合筛选方法，其特征在于步骤（1）所述的XAS固体培养基配制方法：取蔗糖10g、细菌级蛋白胨5 g、三水合磷酸氢二钾0.5 g、七水合硫酸镁0.25 g、亚硫酸钠0.05 g、溴化钾5 g、4 mg/ml的苯菌灵贮存液0.5 ml，溶于900 ml纯水中，调pH=6.8后定容至1 L，加入琼脂粉15 g，混匀；在121 ℃下灭菌20分钟；取环己酰亚胺、头孢氨苄、春雷霉素溶于水，配成重量浓度为1%的溶液，用细菌滤器过滤后制成抗生素贮存液，保存；待高压灭菌后的固体培养基凉至45-55℃时，加入抗生素贮存液，使其终浓度为环己酰亚胺100 mg/L、头孢氨苄25 mg/L、春雷霉素50 mg/L。
3.根据权利要求1所述的一种甘蔗杂交组合白条病抗性鉴定及抗病组合筛选方法，其特征在于步骤（1）所述的XAL培养液配制方法：取蔗糖10 g、细菌级蛋白胨5 g、三水合磷酸氢二钾0.5 g、七水合硫酸镁0.25 g、亚硫酸钠0.05 g、溴化钾5 g、琼脂粉15 g、4 mg/ml的苯菌灵贮存液0.5 ml，溶于900 ml纯水中，调pH=6.8后定容至1 L；在121 ℃下灭菌20分钟；取环己酰亚胺、头孢氨苄、春雷霉素溶于水，配成重量浓度为1%的溶液，用细菌滤器过滤后制成抗生素贮存液，保存；待高压灭菌后的培养液温度不高于55℃时，加入抗生素贮存液，使其终浓度为环己酰亚胺100 mg/L、头孢氨苄25 mg/L、春雷霉素50 mg/L。
4.根据权利要求1所述的一种甘蔗杂交组合白条病抗性鉴定及抗病组合筛选方法，其特征在于步骤（3）所述的剪叶接种法：用无菌剪刀蘸取步骤（1）的甘蔗白条病病原菌菌悬液后，一次性剪掉叶尖，并在完全叶叶片中间剪5 mm大小的伤口；每接种一次叶片，无菌剪刀蘸取一次甘蔗白条病病原菌菌悬液；在剪切下一次叶片前，重新蘸取甘蔗白条病病原菌菌悬浮液。
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