CN110651710A - 一种无溃疡病病原菌的猕猴桃种苗的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种无溃疡病病原菌的猕猴桃种苗的生产方法，包括：(1)外植体的选择；(2)芽的形成；(3)芽的增殖；(4)在芽伸长培养基上促进芽伸长；(5)茎尖培养诱导新芽；(6)增殖；所述茎尖培养基为MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA或MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.5～0.7mg/L TDZ；(7)筛选出无溃疡病病原菌的新芽无性系并扩繁；(8)组培苗的获得；(9)溃疡病病原菌检测与栽培。使用无溃疡病病原菌的猕猴桃种苗可以杜绝通过种苗传播溃疡病、将溃疡病病原菌带入果园，大大降低果园溃疡病的发生风险和防治成本。

Description

一种无溃疡病病原菌的猕猴桃种苗的生产方法
技术领域
本发明涉及苗木繁殖技术领域，尤其涉及一种无溃疡病病原菌的猕猴桃种苗的生产方法。
背景技术
猕猴桃含有丰富的有机和无机营养，是世界上重要水果之一。由丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae，PSA)引起的溃疡病是猕猴桃的毁灭性病害，严重威胁猕猴桃的种植业。该病传播易、发病快、致病性强、防治难度大，发病轻时导致减产、品质下降，严重时造成大量树体死亡，甚至毁灭整个果园，已被列为我国森林植物检疫性病害。
现在人工栽培的猕猴桃都可以感染溃疡病，不少重要品种，如“红阳”、“大红”、“华朴3号”、“早鲜”、“早艳”、“黄肉优系11-7”、“黄肉优系Y-HZ201201”等，对溃疡病抗性差，更易发生溃疡病。由于生产上通常是通过嫁接方法生产猕猴桃种苗，使用带溃疡病病原菌枝条做接穗的几率高，从而加速溃疡病的传播，风险大。目前，我国猕猴桃主产区都发生了溃疡病，很多果园的溃疡病感染率达到50％以上，溃疡病呈蔓延、爆发趋势，给果农和有关农业企业带来了巨大的经济损失，也严重影响了猕猴桃产业的发展。
迄今，猕猴桃溃疡病的防治尚无有效方法。药物防治是主要手段，但效果有限。过量使用农药不仅会增加成本，而且还会引起药害，影响果实品质和安全性，导致出口受阻。因此，开发一种培育和生产无溃疡病病原菌的猕猴桃种苗方法，成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有猕猴桃种苗生产技术存在的缺陷，提供了一种培育和生产无溃疡病病原菌的猕猴桃种苗方法。在新开辟的果园中种植无溃疡病病原菌的猕猴桃种苗，可以杜绝通过种苗传播溃疡病、将溃疡病病原菌带入果园，从而可以大大降低果园发生溃疡病的风险、减轻溃疡病的防治压力，节约农药和劳力成本，为生产高质量的有机猕猴桃创造条件。
本发明是这样实现的：
本发明目的之一在于提供一种无溃疡病病原菌的猕猴桃种苗的生产方法，所述方法包括如下步骤：
步骤1、外植体的选择：采集猕猴桃当年生枝条并消毒，选取带侧芽或顶芽的小段作为外植体；
步骤2、芽的形成：将步骤1所得外植体接种在茎段培养基上使其形成芽；
步骤3、芽的增殖：将步骤2所得的芽切下并转到芽增殖培养基上进行增殖；所述芽增殖培养基为MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.3～0.5mg/L BA+0.3mg/L GA3；
步骤4、芽的快速伸长：将增殖的芽继代到伸长培养基上以促进芽增殖并快速伸长；所述芽伸长培养基为MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.3mg/L BA+4～5mg/L GA3；
步骤5、茎尖培养：分离步骤4所得显著伸长芽的茎尖，在茎尖培养基上诱导出新芽；所述茎尖培养基为MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA或MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.5～0.7mg/L TDZ；
步骤6、新芽增殖培养：将步骤5所得各个新芽分别在所述的芽增殖培养基上进行增殖，同一芽增殖所形成的材料构成一个无性系；
步骤7、筛选无溃疡病病原菌的无性系并扩繁：对步骤6所得各无性系中的芽进行溃疡病病原菌检测，筛选出无溃疡病病原菌的无性系，并于所述的芽增殖培养基上进行扩繁；
步骤8、组培苗的获得：将扩繁得到的芽转到生根培养基上诱导生根，获得完整植株，即得到猕猴桃组培苗；
步骤9、组培苗溃疡病病原菌检测与驯化栽培：对步骤9所得到的猕猴桃组培苗再次进行溃疡病病原菌检测，确认无溃疡病病原菌后将猕猴桃组培苗在温室内驯化栽培。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明提供的一种无溃疡病病原菌的猕猴桃种苗的生产方法，先以果园猕猴桃当年生枝条为外植体，诱导并繁殖芽，然后利用赤霉素促进芽快速伸长，再分离伸长芽的茎尖进行脱菌培养、诱导出新芽，通过对各个新芽增殖所形成的芽进行溃疡病病原菌检测，筛选出脱菌成功的芽，最后对脱菌成功的芽进行扩繁、生根和驯化炼苗，获得可在室外栽培的种苗。同现有的嫁接繁殖方法相比，本方法最大的优点是所生产的种苗不带溃疡病病原菌，可以杜绝通过种苗传播溃疡病、将溃疡病病原菌带入果园，从而大大降低果园发生溃疡病的风险、减轻防治压力、节约农药和劳力成本，为生产高质量的有机猕猴桃创造了条件；其次是种苗均匀一致，有利于猕猴桃的标准化、规范化栽培。无溃疡病病原菌的猕猴桃种苗既可以直接用于建立果园，也可以用于建立嫁接繁殖所需的接穗圃。
附图说明
图1为实施例1中的无溃疡病病原菌的“红阳”猕猴桃种苗培育过程中的图片；其中A图为未脱菌的“红阳”猕猴桃芽研磨后涂布在LB培养基上的细菌生长情况；B图为“红阳”猕猴桃芽内部细菌转到KB培养基上的生长情况，PSA为标准溃疡病病原菌，箭头所指菌落为疑似PSA；C图为茎尖脱菌培养所形成的新芽；D图为脱菌芽所增殖的芽丛研磨后涂布在LB培养基上培养10天后的情况；E图为脱菌芽的PCR检测，泳道1和13为DNA marker，泳道2和3为PSA菌，泳道4和5为未脱菌芽，其余泳道(6-12和14-19)为细菌培养检测阴性的芽丛；F图为生根的组培苗；G图为移栽2个月后的组培苗；
图2为实施例2提供的无溃疡病病原菌的“华朴3号”猕猴桃种苗培育过程中的图片；其中A图为未脱菌的“华朴3号”猕猴桃芽研磨后涂布在LB培养基上的细菌生长情况；B图为“华朴3号”猕猴桃芽内部细菌转到KB培养基上的生长情况，PSA为标准溃疡病病原菌，箭头所指菌落为疑似PSA；C图为茎尖脱菌培养所形成的新芽；D图为脱菌芽所增殖的芽丛研磨后涂布在LB培养基上培养10天后的情况；E图为脱菌芽的PCR检测，泳道4为DNA marker，泳道1为PSA菌，泳道2和3为未脱菌芽，泳道5-19为细菌培养检测阴性的芽丛；F图为生根的组培苗；G图为移栽2个月的组培苗；
图3为实施例3提供的无溃疡病病原菌的中华猕猴桃雄株M1种苗培育过程中的图片；其中A图为未脱菌的中华猕猴桃雄株M1芽研磨后涂布在LB培养基上的细菌生长情况；B图为中华猕猴桃雄株M1芽内部细菌转到KB培养基上的生长情况，PSA为标准溃疡病病原菌，箭头所指菌落为疑似PSA；C图为茎尖脱菌培养所形成的新芽；D图为脱菌芽所增殖的芽丛研磨后涂布在LB培养基上培养10天后的情况；E图为脱菌芽的PCR检测，泳道9为DNA marker，泳道7、8、10和11为未脱菌芽，泳道1-6和12-19为细菌培养检测阴性的芽丛；F图为生根的组培苗；G图为移栽的组培苗。
具体实施方式
实施例1
一种无溃疡病病原菌的“红阳”猕猴桃种苗的生产方法，包括如下步骤：
步骤1、外植体的选择：
S1、外植体采集：在疫区果园内采集当年生枝条。
S2、外植体消毒：在实验室内，用自来水和洗涤剂清洗枝条后，在含1％有效氯的次氯酸钠溶液中浸泡15～20min，然后用无菌水漂洗3次。
步骤2、芽的形成：在超净工作台上，再将枝条切成约1～2cm长的带侧芽或顶芽的小段，接种在茎段培养基上促进芽的形成。茎段培养基为1/2MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+2mg/L 6-苄基氨基嘌呤(BA)，置于温度为25±1℃，光照强度为35～40μmol m-2s-1、光周期为16h的条件下培养。
步骤3、芽的增殖：当茎段长出芽后，将芽切下、转到芽增殖培养基上进行增殖，各个芽分别增殖，同一芽增殖所形成的材料构成一个无性系。芽增殖培养基为MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.3mg/L BA+0.3mg/L赤霉酸3(GA3)，置于温度为25±1℃，光照强度为35～40μmol m-2s-1、光周期为16h的条件下培养。
步骤4、筛选带溃疡病病原菌的无性系(该步骤并非必须步骤，也可以用未进行溃疡病病原菌检测的芽进行伸长生长，然后用于脱菌培养)：
从上述各个无性系中随机取10个芽丛，分别用无菌研钵将其磨成浆，然后用无菌药勺将浆状物涂布到适合溃疡病病原菌PSA生长的固体LB培养基上，置于生化培养箱中培养，温度为28℃。
3～5天后，在超净工作台上用无菌枪头将各芽丛在LB培养基上形成的白色细菌菌落(图1A)分别转移到适合假单胞杆菌生长的固体KB培养基上，同时将标准PSA菌划在同一平板上做对照，置于温度为28℃生化培养箱中培养。
2天后，将与PSA菌落相似的菌(图1B)分别接种到3ml液体LB培养基中，在摇床上培养至浑浊，同时培养PSA菌。培养温度为28℃，培养转速200rpm。图1B为“红阳”猕猴桃芽内部细菌转到KB培养基上的生长情况，部分细菌没有长起来，PSA为标准溃疡病病原菌，箭头所指菌落为疑似PSA。
用细菌DNA提取试剂盒提取各菌的DNA，按照文献《Rees-George J，Vanneste JL，Cornish DA，Pushparajah IPS，Yu J，Templeton MD，Everett KR.Detection ofPseudomonas syringae pv.actinidiae using polymerase chain reaction(PCR)primers based on the 16S-23S rDNA intertranscribed spacer region andcomparison with PCR primers based on other gene regions.Plant Pathology,2010,59:453–464》中的PCR方法，用PSA的特异引物PsaF1(5’-TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT-3’)和PsaR1(5’-CACGCACCCTTCAATCAGGATG-3’)进行PCR扩增，通过电泳检测各菌有无PSA的特异产物(280bp条带)来判断其是不是PSA。
步骤5、芽的快速伸长：将PSA菌检测阳性的无性系的芽切成长约1cm的小段、接种到芽伸长培养基中以促进芽增殖并快速伸长。芽伸长培养基为MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.3mg/L BA+4mg/L GA3，培养条件为温度为25±1℃、光照强度为35～40μmol m-2s-1、光周期为16h。
步骤6、茎尖培养：在超净工作台上将显著伸长的芽的顶端切下，在解剖镜下用无菌镊子、解剖刀和解剖针分离0.3mm大小的茎尖，接种在茎尖培养基上诱导新芽。茎尖培养基为MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+1mg/L BA+0.1mg/L NAA，培养条件为温度25±1℃、光照强度为35～40μmol m-2s-1、光周期为16h。
步骤7、新芽增殖培养：待新芽形成后(图1C)，对新芽进行编号，转到芽增殖培养基上进行增殖，每个月继代增殖一次，各新芽增殖的材料构成各自的无性系。
步骤8、筛选无溃疡病病原菌的无性系并扩繁：
S1、增殖4代后，在各无性系中随机取50个以上的芽丛，分别用无菌研钵研磨成浆后，尽量将所有的浆液涂布在固体LB培养基上，在28℃生化培养箱中培养10天，观察是否有内源菌生长(图1D)，图1D为脱菌芽所增殖的芽丛研磨后涂布在LB培养基上培养10天后的情况，无任何可见的菌斑。在同一无性系中，另外随机取20个芽丛，分别研磨成浆后转入20ml液体LB培养基中，在摇床上培养(温度28℃，转速200rpm)10天，观察是否有内源菌生长。
S2、在固体和液体培养都没有出现内源菌生长的无性系内，再随机取10个以上芽丛，用植物DNA提取试剂盒分别提取它们的基因组DNA，同时也提取未脱菌芽的基因组DNA。以这些DNA和PSA为模板，用PSA特异引物PsaF1和PsaR1进行PCR扩增，通过电泳检测是否有PSA的特异产物(280bp条带)(图1E)。图1E中泳道1和13为DNA marker，泳道2和3为PSA菌、泳道4和5为未脱菌芽；泳道2、3、4、5均有280bp的特异带，其余泳道(6-12和14-19)为细菌培养检测阴性的芽丛，都无280bp的特异带。
在步骤S1和S2的检测步骤中均为阴性的无性系为无PSA的无性系。将这些无性系的芽继代在芽增殖培养基上进行扩繁，每月增殖一次，平均增殖效率可达5倍以上。
步骤9、猕猴桃组培苗的获得：当芽增殖到预期数量后，将芽切成约3cm长(带顶芽)，插入生根培养基中诱导生根，一个月后得到根系完整的组培苗(图1F)。生根培养基为1/2MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.7mg/L吲哚丁酸(IBA)，培养条件为温度为25±1℃，光照强度为35～40μmol m-2s-1、光周期为16h。4周后，芽的生根率达到100％。
步骤10、溃疡病病原菌检测与驯化栽培：移栽前，按步骤6方法对组培苗再次进行溃疡病病原菌检测。确认无溃疡病病原菌后，组培苗在室内炼苗2～3天，取出、用水洗去培养基，在温室内栽入由泥炭土、蛭石和珍珠岩(体积比为7：1：2)配制的基质中(也可采用其他基质)，浇透水。温室的温度为23～28℃、相对湿度为70～80％、光照强度为60～70％自然光照。一个月后，组培苗成活率可以达到95％以上，两个月后可移到温室外栽培，生长正常(图1G)。
实施例2
一种无溃疡病病原菌的“华朴3号”猕猴桃种苗的生产方法，包括如下步骤：
步骤1、外植体的选择：
S1、外植体采集：在疫区果园内采集当年生枝条。
S2、外植体消毒：在实验室内，用自来水和洗涤剂清洗枝条后，在含1％有效氯的次氯酸钠溶液中浸泡15～20min，然后用无菌水漂洗3次。
步骤2、芽的形成：在超净工作台上，再将枝条切成约1～2cm长的带侧芽或顶芽的小段，接种在茎段培养基上促进芽的形成。茎段培养基为1/2MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+2mg/L 6-苄基氨基嘌呤(BA)，置于温度为25±1℃，光照强度为35～40μmol m-2s-1、光周期为16h的条件下培养。
步骤3、芽的增殖：当茎段长出芽后，将芽切下、转到芽增殖培养基上进行增殖，各个芽分别增殖，同一芽增殖所形成的材料构成一个无性系。芽增殖培养基为MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.4mg/L BA+0.3mg/L GA3，置于温度为25±1℃，光照强度为35～40μmolm-2s-1、光周期为16h的条件下培养。
步骤4、筛选带溃疡病病原菌的无性系(该步骤并非必须步骤，也可以用未进行溃疡病病原菌检测的芽进行伸长生长，然后用于脱菌培养)：
从上述各个无性系中随机取10个芽丛，分别用无菌研钵将其磨成浆，然后用无菌药勺将浆状物涂布到适合溃疡病病原菌PSA生长的固体LB培养基上，置于生化培养箱中培养，温度为28℃。
3～5天后，在超净工作台上用无菌枪头将各芽丛在LB培养基上形成的白色细菌菌落(图2A)分别转移到适合假单胞菌生长的固体KB培养基上，同时将标准PSA菌划在同一平板上做对照，置于温度为28℃生化培养箱中培养。
2天后，将与PSA菌落相似的菌(图2B)分别接种到3ml液体LB培养基中，在摇床上培养至浑浊，同时培养PSA菌。培养温度为28℃，培养转速200rpm。图2B为“华朴3号”猕猴桃芽内部细菌转到KB培养基上的生长情况，部分细菌没有长起来，PSA为标准溃疡病病原菌，箭头所指菌落为疑似PSA。
用细菌DNA提取试剂盒提取各菌的DNA，按照文献《Rees-George J，Vanneste JL，Cornish DA，Pushparajah IPS，Yu J，Templeton MD，Everett KR.Detection ofPseudomonas syringae pv.actinidiae using polymerase chain reaction(PCR)primers based on the 16S-23S rDNA intertranscribed spacer region andcomparison with PCR primers based on other gene regions.Plant Pathology,2010,59:453–464》中的方法，用PSA菌的特异引物PsaF1(5’-TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT-3’)和PsaR1(5’-CACGCACCCTTCAATCAGGATG-3’)进行PCR扩增，通过电泳检测各菌有无PSA的特异产物(280bp条带)来判断其是不是PSA。
步骤5、芽的快速伸长：将PSA菌检测阳性的无性系的芽切成长约1cm的小段、接种到芽伸长培养基中以促进芽增殖并快速伸长。芽伸长培养基为MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.3mg/L BA+4.5mg/L GA3，培养条件为温度为25±1℃、光照强度为35～40μmol m-2s-1、光周期为16h。
步骤6、茎尖培养：在超净工作台上，将显著伸长的芽的顶端切下，在解剖镜下用无菌镊子、解剖刀和解剖针分离0.3mm大小的茎尖，接种在茎尖培养基上诱导新芽。茎尖培养基为MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.5、0.6或0.7mg/L噻苯隆(TDZ)，培养条件为温度25±1℃、光照强度为35～40μmol m-2s-1、光周期为16h。三种浓度TDZ培养基上，茎尖培养形成新芽的比率均为100％。
步骤7、新芽增殖培养：待新芽形成后(图2C)，对新芽进行编号，转到芽增殖培养基上进行增殖，每个月继代增殖一次，各新芽增殖的材料构成各自的无性系。
步骤8、筛选无溃疡病病原菌的无性系并扩繁：
S1、增殖5代后，在各无性系中随机取50个以上的芽丛，分别用无菌研钵研磨成浆后，尽量将所有的浆液涂布在固体LB培养基上，在28℃生化培养箱中培养10天，观察是否有内源菌生长(图2D)图2D为脱菌芽所增殖的芽丛研磨后涂布在LB培养基上培养10天后的情况，无任何可见的菌斑。在同一无性系中，另外随机取20个芽丛，分别研磨成浆后转入20ml液体LB培养基中，在摇床上培养(温度28℃，转速200rpm)10天，观察是否有内源菌生长。
S2、在固体和液体培养都没有出现内源菌生长的无性系内，再随机取10个以上芽丛，用植物DNA提取试剂盒分别提取它们的基因组DNA，同时也提取未脱菌芽的基因组DNA。以这些DNA和PSA为模板，用PSA特异引物PsaF1和PsaR1进行PCR扩增，通过电泳检测是否有PSA的特异产物(280bp条带)图2E为脱菌芽的PCR检测，泳道4为DNA marker，泳道1为PSA菌、泳道2和3为未脱菌芽，均有280bp的特异带，泳道5-19为细菌培养检测阴性的芽丛，都无280bp的特异带。
在步骤S1和S2的检测步骤中均为阴性的无性系为无PSA的无性系。将这些无性系的芽继代在芽增殖培养基上进行扩繁，每月增殖一次，平均增殖效率可达6倍以上。
步骤9、猕猴桃组培苗的获得：当芽增殖到预期数量后，将芽切成大约3cm长(带顶芽)，插入生根培养基中诱导生根，一个月后得到根系完整的组培苗(图2F)。生根培养基为1/2MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.8mg/L吲哚丁酸(IBA)，培养条件为温度为25±1℃，光照强度为35～40μmol m-2s-1、光周期为16h。4周后，芽的生根率达到100％；
步骤10、溃疡病病原菌检测与驯化栽培：移栽前，按步骤6方法对组培苗再次进行溃疡病病原菌检测。确认无溃疡病病原菌后，组培苗在室内炼苗2～3天，取出、用水洗去培养基，在温室内栽入由泥炭土、蛭石和珍珠岩(7：1：2)配制的基质中(也可采用其他基质)，浇透水。温室的温度为23～28℃、相对湿度为70～80％、光照强度为60～70％自然光照。一个月后，组培苗成活率可以达到95％以上，两个月后可移到温室外栽培，生长正常(图2G)。
实施例3
一种无溃疡病病原菌的中华猕猴桃雄株M1种苗的生产方法，包括如下步骤：
步骤1、外植体的选择：
S1、外植体采集：在疫区果园内采集当年生枝条。
S2、外植体消毒：在实验室内，用自来水和洗涤剂清洗枝条后，在含1％有效氯的次氯酸钠溶液中浸泡15～20min，然后用无菌水漂洗3次。
步骤2、芽的形成：在超净工作台上，再将枝条切成约1～2cm长的带侧芽或顶芽的小段，接种在茎段培养基上促进芽的形成。茎段培养基为1/2MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+2mg/L 6-苄基氨基嘌呤(BA)，置于温度为25±1℃，光照强度为35～40μmol m-2s-1、光周期为16h的条件下培养。
步骤3、芽的增殖：当茎段长出芽后，将芽切下、转到芽增殖培养基上进行增殖，各个芽分别增殖，同一芽增殖所形成的材料构成一个无性系。芽增殖培养基为MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.5mg/L BA+0.3mg/L赤霉酸3(GA3)，置于温度为25±1℃，光照强度为35～40μmol m-2s-1、光周期为16h的条件下培养。
步骤4、筛选带溃疡病病原菌的无性系(该步骤并非必须步骤，也可以用未进行溃疡病病原菌检测的芽进行伸长生长，然后用于脱菌培养)：
从上述各个无性系中随机取10个芽丛，分别用无菌研钵将其磨成浆，然后用无菌药勺将浆状物涂布到适合溃疡病病原菌PSA生长的固体LB培养基上，置于生化培养箱中培养，温度为28℃。
3～5天后，在超净工作台上用无菌枪头将各芽丛在LB培养基上形成的白色细菌菌落(图3A)分别转移到适合假单胞杆菌生长的固体KB培养基上，同时将标准PSA菌划在同一平板上做对照，置于温度为28℃生化培养箱中培养。
2天后，将与PSA菌落相似的菌(图3B)分别接种到3ml液体LB培养基中，在摇床上培养至浑浊，同时培养PSA菌。培养温度为28℃，培养转速200rpm。图3B为中华猕猴桃雄株M1芽内部细菌转到KB培养基上的生长情况，PSA为标准溃疡病病原菌，箭头所指菌落为疑似PSA。
用细菌DNA提取试剂盒提取各菌的DNA，按照文献《Rees-George J，Vanneste JL，Cornish DA，Pushparajah IPS，Yu J，Templeton MD，Everett KR.Detection ofPseudomonas syringae pv.actinidiae using polymerase chain reaction(PCR)primers based on the 16S-23S rDNA intertranscribed spacer region andcomparison with PCR primers based on other gene regions.Plant Pathology,2010,59:453–464》中的方法，用PSA菌的特异引物PsaF1(5’-TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT-3’)和PsaR1(5’-CACGCACCCTTCAATCAGGATG-3’)进行PCR扩增，通过电泳检测各菌有无PSA的特异产物(280bp条带)来判断其是不是PSA。
步骤5、芽的快速伸长：将PSA菌检测阳性的无性系的芽切成长约1cm的小段、接种到芽伸长培养基中以促进芽增殖并快速伸长。芽伸长培养基为MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.3mg/L BA+5mg/L GA3，培养条件为温度为25±1℃、光照强度为35～40μmol m-2s-1、光周期为16h。
步骤6、茎尖培养：在超净工作台上，将显著伸长的芽顶端切下，在解剖镜下用无菌镊子、解剖刀和解剖针分离0.3mm大小的茎尖，接种在茎尖培养基上诱导新芽。茎尖培养基为MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.7mg/L噻苯隆(TDZ)，培养条件为温度25±1℃、光照强度为35～40μmol m-2s-1、光周期为16h。
步骤7、新芽增殖培养：待新芽形成后(图3C)，对新芽进行编号，转到芽增殖培养基上进行增殖，每个月继代增殖一次，各新芽增殖的材料构成各自的无性系。
步骤8、筛选无溃疡病病原菌的无性系并扩繁：
S1、增殖4～5代后，在各无性系中随机取50个以上的芽丛，分别用无菌研钵研磨成浆后，尽量将所有的浆液涂布在固体LB培养基上，在28℃生化培养箱中培养10天，观察是否有内源菌生长，图3D为脱菌芽所增殖的芽丛研磨后涂布在LB培养基上培养10天后的情况，无任何可见的菌斑；在同一无性系中，另外随机取20个芽丛，分别研磨成浆后转入20ml液体LB培养基中，在摇床上培养(温度28℃，转速200rpm)10天，观察是否有内源菌生长。
S2、在固体和液体培养都没有出现内源菌生长的无性系内，再随机取10个以上芽丛，用植物DNA提取试剂盒分别提取它们的基因组DNA，同时也提取未脱菌芽的基因组DNA。以这些DNA为模板，用PSA特异引物PsaF1和PsaR1进行PCR扩增，通过电泳检测是否有PSA的特异产物(280bp条带)，图3E为脱菌芽的PCR检测，泳道9为DNA marker，泳道7、8、10和11为未脱菌芽，均有280bp的特异带，泳道1-6和12-19为细菌培养检测阴性的芽丛，都无280bp的特异带。
在步骤S1和S2的检测步骤中均为阴性的无性系为无PSA的无性系。将这些无性系的芽继代在芽增殖培养基上进行扩繁，每月增殖一次，平均增殖效率可达5倍以上。
步骤9、猕猴桃组培苗的获得：当芽增殖到预期数量后，将芽切成大约3cm长(带顶芽)，插入生根培养基中诱导生根，一个月后得到根系完整的组培苗(图3F)。生根培养基为1/2MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+1.0mg/L吲哚丁酸(IBA)，培养条件为温度为25±1℃，光照强度为35～40μmol m-2s-1、光周期为16h。5周后，芽的生根率达到100％；
步骤10、溃疡病病原菌检测与驯化栽培：移栽前，按步骤6方法对组培苗再次进行溃疡病病原菌检测。确认无溃疡病病原菌后，组培苗在室内炼苗2～3天，取出、用水洗去培养基，在温室内栽入由泥炭土、蛭石和珍珠岩(7：1：2)配制的基质中(也可采用其他基质)，浇透水。温室的温度为23～28℃、相对湿度为70～80％、光照强度为60～70％自然光照。一个月后，组培苗成活率可达100％，两个月后可移到温室外栽培，生长正常(图3G)。
对比例1
该对比例将实施例1中的步骤5省去，即在分离茎尖前，芽没有在芽伸长培养基上培养；其他均同实施例1。
对比例2
该对比例将实施例2中的步骤5省去，即在分离茎尖前，芽没有在芽伸长培养基上培养；其他均同实施例2。
对比例3
该对比例将实施例3中的步骤5省去，即在分离茎尖前，芽没有在芽伸长培养基上培养；其他均同实施例3。
实验例
实施例1-3以及对比例1-3的茎尖培养效果指标见表1。由表1可知，本发明的实施例1-实施例3的脱菌率高达47.2～70.6％，均显著高于相应的对比例，其它指标则无显著差异。
表1-对照组和实施例组茎尖脱菌培养效果比较
Figure BDA0002203782970000141
所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种无溃疡病病原菌的猕猴桃种苗的生产方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1、外植体的选择：采集猕猴桃当年生枝条并消毒，选取带侧芽或顶芽的小段作为外植体；
步骤2、芽的形成：将步骤1所得外植体接种在茎段培养基上使其形成芽；
步骤3、芽的增殖：将步骤2所得的芽切下并转到芽增殖培养基上进行增殖；所述芽增殖培养基为MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.3～0.5mg/L BA+0.3mg/L GA3；
步骤4、芽的快速伸长：将增殖的芽继代到芽伸长培养基上以促进芽增殖并快速伸长；所述芽伸长培养基为MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.3mg/L BA+4～5mg/L GA3；
步骤5、茎尖培养：分离步骤4所得显著伸长芽的茎尖，在茎尖培养基上诱导出新芽；所述茎尖培养基为MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+1.0mg/L BA+0.1mg/L NAA或MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.5～0.7mg/L TDZ；
步骤6、新芽增殖培养：将步骤5所得各个新芽分别在所述的芽增殖培养基上进行增殖，同一芽增殖所形成的材料构成一个无性系；
步骤7、筛选无溃疡病病原菌的无性系并扩繁：对步骤6所得各无性系中的芽进行溃疡病病原菌检测，筛选出无溃疡病病原菌的无性系，并于所述的芽增殖培养基上进行扩繁；
步骤8、组培苗的获得：将扩繁得到的芽转到生根培养基上诱导生根，获得完整植株，即得到猕猴桃组培苗；
步骤9、组培苗溃疡病病原菌检测与驯化栽培：对步骤9所得到的猕猴桃组培苗再次进行溃疡病病原菌检测，确认无溃疡病病原菌后将猕猴桃组培苗在温室内驯化栽培。
2.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤1中消毒的具体步骤为：用自来水和洗涤剂清洗后，在含1％有效氯的次氯酸钠溶液中浸泡15～20min，然后用无菌水漂洗3～4次；在超净工作台上，再将枝条切成约1～2cm长的带侧芽或顶芽的小段作为外植体。
3.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤2中茎段培养基为1/2MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+2mg/L BA，置于温度为25±1℃，光照强度为35～40μmol m-2s-1、光周期为16h的条件下培养。
4.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤3中芽增殖培养条件为：温度25±1℃，光照强度35～40μmol m-2s-1、光周期16h。
5.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤4中芽伸长培养条件为：温度25±1℃，光照强度35～40μmol m-2s-1、光周期16h。
6.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤7中溃疡病病原菌的检测先采用细菌培养法检测，然后再用PCR技术进行复检。
7.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤8中生根培养基为1/2MS培养基+20g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.7～1mg/LIBA，培养条件为：温度25±1℃，光照强度35～40μmolm-2s-1、光周期16h。
8.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述步骤9中将确认无溃疡病病原菌的猕猴桃组培苗炼苗2～3天后，取出，用水洗去培养基，在温室内栽入配制的基质中，所述基质为体积比为7：1：2的泥炭土、蛭石和珍珠岩，浇透水；温室的温度为23～28℃、相对湿度为70～80％、光照强度为60～70％自然光照。
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