CN109392715A - 一种猕猴桃金玉的组培快繁方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猕猴桃金玉的组培快繁方法，涉及猕猴桃品种组培快繁方法。本方法是：①无菌苗的获得；②不定芽再生诱导；③不定芽增殖、壮苗培养；④生根培养；⑤移栽；其特征在于：包括萌发培养基、再生培养基、增殖壮苗培养基和生根培养基及相应培养条件。本发明采用四种针对性培养基对金玉进行组织培养，能在短期内实现快速繁育大量金玉猕猴桃种苗，并且通过组织培养能最大限度地保证种苗质量，提高种苗繁育速度，实现种苗工业化生产，满足生产上对金玉种苗的需求；直接组培品种种苗，建立品种采穗圃，打破传统嫁接繁殖中嫁接接穗的量的瓶颈，充分满足生产的需要。

Description

一种猕猴桃金玉的组培快繁方法

技术领域

本发明涉及一种猕猴桃品种组培快繁方法，尤其涉及一种猕猴桃金玉的组培快繁方法。

背景技术

金玉由中国科学院武汉植物园于2001-2012年从‘红阳’猕猴桃实生后代中选育，性状稳定，2013年申请农业新品种权保护。金玉果实短圆柱形，平均果重40-60克。果肉金黄色，风味浓甜，有清香，口感好。软熟的果实可溶性固形物21%，干物质22%，总糖14%，维C118毫克/100克，果实极耐储藏，植株树势较强。随着中国猕猴桃新品种选育速度的的加快，为了快速的推广新品种和保留新品种优良品质，采用猕猴桃的组织培养技术进行繁殖是最快速和有效的方法之一，目前金玉猕猴桃的产业化推广种植种苗来源主要是嫁接苗，组培育苗技术方法还未见报道，嫁接繁殖中接穗与砧木的亲和性高低、嫁接口愈合程度都直接影响嫁接成活率及后期品种接穗的生长势及丰产性，另外接穗质量及数量的限制也成为金玉大面积推广、产业化生产的一个瓶颈。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的就在于提供一种猕猴桃金玉的组培快繁方法，即直接通过组织培养方法获得品质均一、优良的离体金玉组培种苗，并通过优化离体快繁体系，实现快速繁育金玉猕猴桃优质种苗的目的，以供生产中不断增长的种苗需求。

本发明采用的技术方案如下：

以金玉一年生枝条水培萌芽为外植体，消毒后进行组织培养，获得无菌苗，以无菌苗叶柄为再生组织来源，进行诱导分化、生根培养。不定芽直接再生率高达89%，增值系数可达6.0。短期内可快速获得大量优质品种种苗，实现金玉种苗工厂化快速育苗。

具体的说，本发明包括以下步骤：

①无菌苗的获得

1）于11月底从金玉母树上剪取生长健壮腋芽饱满的一年生枝条，将枝条剪成30cm长枝段，每段5-10芽；

2）将所述枝段形态学上端用封口膜封好，形态学下端浸泡2‰蔗糖水溶液中室内培养，保持环境温度25±2℃，保证室内清洁，2-3天更换一次水溶液，两周后，腋芽萌出；

3）待腋芽芽体长至1-2cm时，取幼嫩芽体于超净工作台上，置于灭过菌的空瓶内，75%酒精表面消毒1min，倒出酒精，加入质量体积比为0.1%升汞深入消毒8-12min，升汞溶液与外植体充分接触震荡，保证消毒彻底，倒出消毒液，外植体更换入新的灭菌瓶内，无菌水震荡冲洗4-5次，再于灭菌滤纸上晾干；

4）去掉腋芽芽体基部的伤口及损伤的叶片，接种于外植体萌发培养基上；

5）28-35天后，芽体展叶，生长健壮，获得无菌苗；

②不定芽再生诱导

1）于超净工作台上切取无菌苗叶柄，切成0.5cm小段，置于再生培养基上，pH调至5.8，进行不定芽的再生诱导；

2）接种材料置于光照条件下培养；

3）35-45天后，叶柄直接再生不定芽；

③不定芽增殖、壮苗培养

再生获得不定芽在最佳不定芽再生培养基上继代一次后，将不定芽切分成单个芽体，置于增殖壮苗培养基上进行增殖壮苗培养，pH调至5.8；

④生根培养

将生长状态相对一致的高 2-3cm，具5-6片叶的不定芽切下，接种于生根培养基上进行生根培养，12-15天即现肉眼可见不定根，短粗、健壮，35-40天后根长2.5-3.5cm，3-7条根，即可移栽。

⑤移栽

1）生根培养35天后，直接取出生根瓶苗，用自来水洗净根基上的培养基；

2）种苗栽至装有营养土的小营养钵，营养钵上方加盖塑料薄膜，保证新移栽种苗所处的环境湿度为85%-90%，温度控制在25-30℃，15-18天后去掉塑料薄膜，环境湿度适当降低至60%-75%；

3）25-35天后常规水肥管理，环境温度控制在35℃以下，高温夏季需遮阴及湿帘降温；

其特征在于：

所述萌发培养基为：MS+ZT 1.0-5.0 mg/L+1%-2%蔗糖+0.8%琼脂；

所述无菌苗的获得方法中，接种材料培养条件为：光照强度2400-2600Lx，光照12h/d，培养室内温度25±2℃；

所述叶柄再生培养基为：MS+ZT 1.0-3.0 mg/L+IAA 0.1-2.0 mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂；

所述不定芽再生诱导方法中，接种材料培养条件为：光照强度2500-3000Lx，光照12h/d，培养室内温度25±2℃；

所述增殖壮苗培养基为：MS+ZT 0.5-1.8 mg/L+IAA 0.05-0.2 mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂；

所述不定芽增殖、壮苗培养方法，接种材料培养条件为：光照强度3000-3400Lx，光照12h/d，培养室内温度25±2℃；

所述生根培养基为：1/2MS+IBA 0.1-1.0 mg/L+3%蔗糖+0.8-1.5%琼脂；

所述生根培养方法中，接种材料培养条件为：光照强度3800-4000Lx，光照12h/d，培养室内温度25±2℃；

所述营养土成分为：腐殖土：珍珠岩=2：1。

本发明的创新点：本发明初期采用室内蔗糖水溶液培养的方法，来促发腋芽萌发做为外植体来源，规避了直接室外采样的污染源，极大降低了细菌、真菌类及病毒携带的风险。组织培养过程中对材料接受的光照强度作出梯度调整，对其移栽驯化起到了很好的诱导适应作用。培养后期生根阶段增加琼脂粉的使用量，更有利于发根，也更利于移栽时对植株根基部位培养基的清洗，从而减少对根部的损伤，极大提高移栽成活率。种苗不经驯化直接移栽，节约时间及人力相关资源，从很大程度上降低了生产成本。移栽初期一定时间内的温湿度的控制，有利于种苗在短期快速适应移栽后环境，既缩短了育种时间，也极大地提高了种苗移栽成活率。

本发明具有下列优点和积极效果：

①本发明采用四种针对性培养基对金玉进行组织培养，能在短期内快速繁育大量金玉猕猴桃种苗，并且通过组织培养能最大限度的保证种苗质量，提高种苗繁育速度，实现种苗工厂化生产，满足生厂上对金玉种苗的需求。

②外植体提供过程中采用水培出芽方式，能够最大程度的控制无菌苗建立过程中的污染，很大程度上提高的种苗繁育速度，缩短种苗繁育周期，降低组培成本。

③在种苗培育过程中，培养条件的变更，尤其是光照强度的增强，有利于种苗蓄积营养生长能力，增强种苗抗逆性，大大提高后期组培种苗移栽成活率。

④种苗移栽前期，对移栽环境的温湿度的严格控制，能最大程度的保证种苗移栽成活率，从而减少损失、降低生产成本。

⑤相对于以往的扦插、嫁接获得金玉种苗，组培快繁育苗更能保证种苗质量，种苗生长一致、整齐，且能在更短的时间内满足生产对种苗数量上的需求。

⑥直接组培品种种苗，建立品种采穗圃，打破传统嫁接繁殖中嫁接接穗的量的瓶颈，充分满足生产的需要。

具体实施方式

以下结合实施例详细说明。

一、实施例1

一种猕猴桃金玉的组培快繁方法，按下述步骤完成：

1、无菌苗的获得

于11月底从金玉母树上剪取生长健壮腋芽饱满的一年生枝条，剪成30cm长枝段，每段5-10芽，形态学上端用封口膜封好，形态学下端浸泡2‰蔗糖水溶液中室内培养，保持环境温度25±2℃，保证室内清洁，2-3天更换一次水溶液，两周后，腋芽萌出，待芽体长至1-2cm时，取幼嫩芽体于超净工作台上，置于灭过菌的空瓶内，75%酒精表面消毒1min，倒出酒精，加入质量体积比为0.1%升汞深入消毒10min，升汞溶液与外置体充分震荡，保证消毒彻底，倒出消毒液，外植体更换入新的灭菌瓶内，无菌水震荡冲洗4-5次，再于灭菌滤纸上晾干，去掉芽体基部的伤口及损伤的叶片，接种于外植体萌发培养基MS+ZT 4.0 mg/L+1%蔗糖+0.8%琼脂上，32天后，芽体展叶，生长健壮，获得无菌苗。接种材料于光照条件下培养，光照强度2400Lx，培养室内温度25±2℃，光照12h/d。

2、不定芽再生诱导

于超净工作台上切取无菌苗叶柄，切成0.5cm小段，置于再生培养基MS+ZT 1.5 mg/L+IAA0.8 mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂上，pH调至5.8，进行不定芽的再生诱导。接种材料置于光照条件下培养。光照强度2900Lx，培养室内温度25±2℃，光照12h/d。42天后，叶柄直接再生不定芽，数量多，且为丛芽，分化快，颜色亮绿色，不定芽直接再生可达88.5%。

3、不定芽增殖、壮苗培养

再生获得不定芽在最佳不定芽再生培养基上继代一次后，将不定芽切分成单个芽体，置于MS+ZT 0.8 mg/L+IAA 0.08 mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂培养基上进行增殖壮苗培养，pH调至5.8。光照强度3500Lx，培养室内温度25±2℃，光照12h/d。

4、生根培养

将生长状态相对一致的高 2-3cm，具5-6片叶的不定芽切下，接种于1/2MS+IBA 0.8mg/L+3%蔗糖+1.2%琼脂的生根培养基上进行生根培养，不需要调节pH。光照强度3800Lx，培养室内温度25±2℃，光照12h/d，13天即现肉眼可见不定根，短粗、健壮，35天后根长2.5-3.5cm，3-7条根，即可移栽。

5、移栽

生根培养35天后，直接取出生根瓶苗，用自来水洗净根基上的培养基，种苗栽至装有营养土的小营养钵，营养土成分为：腐殖土：珍珠岩=2:1。营养钵上方加塑料薄膜，保证新移栽种苗所处的环境湿度为90%，温度控制在25-30℃，15天后去掉塑料薄膜，环境湿度适当降低至75%。32天后常规水肥管理，环境温度控制在35℃以下，高温夏季需遮阴及湿帘降温。两个月后统计成活率高达95.3%。

二、实施例2

一种猕猴桃金玉的组培快繁方法，按下述步骤完成：

1、无菌苗的获得

于11月底从金玉母树上剪取生长健壮腋芽饱满的一年生枝条，剪成30cm长枝段，每段5-10芽，形态学上端用封口膜封好，形态学下端浸泡2‰蔗糖水溶液中室内培养，保持环境温度25±2℃，保证室内清洁，2-3天更换一次水溶液，两周后，腋芽萌出，待芽体长至1-2cm时，取幼嫩芽体于超净工作台上，置于灭过菌的空瓶内，75%酒精表面消毒1min，倒出酒精，加入质量体积比为0.1%升汞深入消毒8min，升汞溶液与外置体充分震荡，保证消毒彻底，倒出消毒液，外植体更换入新的灭菌瓶内，无菌水震荡冲洗4-5次，再于灭菌滤纸上晾干，去掉芽体基部的伤口及损伤的叶片，接种于外植体萌发培养基MS+ZT 3.0 mg/L+2%蔗糖+0.8%琼脂上，35天后，芽体展叶，生长健壮，获得无菌苗。接种材料于光照条件下培养，光照强度2600Lx，培养室内温度25±2℃，光照12h/d。

2、不定芽再生诱导

于超净工作台上切取无菌苗叶柄，切成0.5cm小段，置于再生培养基MS+ZT 2.0 mg/L+IAA1.0 mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂上，pH调至5.8，进行不定芽的再生诱导。接种材料置于光照条件下培养。光照强度2800Lx，培养室内温度25±2℃，光照12h/d。40天后，叶柄直接再生不定芽，数量多，且为丛芽，分化快，颜色亮绿色，不定芽直接再生可达89%。

3、不定芽增殖、壮苗培养

再生获得不定芽在最佳不定芽再生培养基上继代一次后，将不定芽切分成单个芽体，置于MS+ZT 1.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂培养基上进行增殖壮苗培养，pH调至5.8。光照强度3400Lx，培养室内温度25±2℃，光照12h/d。

4、生根培养

将生长状态相对一致的高 2-3cm，具5-6片叶的不定芽切下，接种于1/2MS+IBA 0.8mg/L+3%蔗糖+1.2%琼脂的生根培养基上进行生根培养。光照强度4000Lx，培养室内温度25±2℃，光照12h/d，12天即现肉眼可见不定根，短粗、健壮，35天后根长2.5-3.5cm，3-7条根，即可移栽。

5、移栽

生根培养35天后，直接取出生根瓶苗，用自来水洗净根基上的培养基，种苗栽至装有营养土的小营养钵，营养土成分为：腐殖土：珍珠岩=2:1。营养钵上方加塑料薄膜，保证新移栽种苗所处的环境湿度为90%，温度控制在25-30℃，15天后去掉塑料薄膜，环境湿度适当降低至75%。28天后常规水肥管理，环境温度控制在35℃以下，高温夏季需遮阴及湿帘降温。

两个月后统计成活率高达95.5%。

三、实施例3

一种猕猴桃金玉的组培快繁方法，按下述步骤完成：

1、无菌苗的获得

于11月底从金玉母树上剪取生长健壮腋芽饱满的一年生枝条，剪成30cm长枝段，每段5-10芽，形态学上端用封口膜封好，形态学下端浸泡2‰蔗糖水溶液中室内培养，保持环境温度25±2℃，保证室内清洁，2-3天更换一次水溶液，两周后，腋芽萌出，待芽体长至1-2cm时，取幼嫩芽体于超净工作台上，置于灭过菌的空瓶内，75%酒精表面消毒1min，倒出酒精，加入质量体积比为0.1%升汞深入消毒10min，升汞溶液与外置体充分震荡，保证消毒彻底，倒出消毒液，外植体更换入新的灭菌瓶内，无菌水震荡冲洗4-5次，再于灭菌滤纸上晾干，去掉芽体基部的伤口及损伤的叶片，接种于外植体萌发培养基MS+ZT 1.0 mg/L+2%蔗糖+0.8%琼脂上，40天后，芽体展叶，生长健壮，获得无菌苗。接种材料于光照条件下培养，光照强度2500Lx，培养室内温度25±2℃，光照12h/d。

2、不定芽再生诱导

于超净工作台上切取无菌苗叶柄，切成0.5cm小段，置于再生培养基MS+ZT 1.0 mg/L+IAA0.1 mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂上，pH调至5.8，进行不定芽的再生诱导。接种材料置于光照条件下培养。光照强度3000Lx，培养室内温度25±2℃，光照12h/d。43天后，叶柄直接再生不定芽，数量多，且为丛芽，分化快，颜色亮绿色，不定芽直接再生可达88.5%。

3、不定芽增殖、壮苗培养

再生获得不定芽在最佳不定芽再生培养基上继代一次后，将不定芽切分成单个芽体，置于MS+ZT0.5 mg/L+IAA 0.05 mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂培养基上进行增殖壮苗培养，pH调至5.8。光照强度3200Lx，培养室内温度25±2℃，光照12h/d。

4、生根培养

将生长状态相对一致的高 2-3cm，具5-6片叶的不定芽切下，接种于1/2MS+IBA 0.1mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂的生根培养基上进行生根培养，pH5.8。光照强度3800Lx，培养室内温度25±2℃，光照12h/d，15天即现肉眼可见不定根，短粗、健壮，35天后根长2.5-3.5cm，3-7条根，即可移栽。

5、移栽

生根培养35天后，直接取出生根瓶苗，用自来水洗净根基上的培养基，种苗栽至装有营养土的小营养钵，营养土成分为：腐殖土：珍珠岩=2:1。营养钵上方加塑料薄膜，保证新移栽种苗所处的环境湿度为85%，温度控制在25-30℃，18天后去掉塑料薄膜，环境湿度适当降低至60%。30天后常规水肥管理，环境温度控制在35℃以下，高温夏季需遮阴及湿帘降温。

两个月后统计成活率高达95%。

四、实施例4

一种猕猴桃金玉的组培快繁方法，按下述步骤完成：

1、无菌苗的获得

于11月底从金玉母树上剪取生长健壮腋芽饱满的一年生枝条，剪成30cm长枝段，每段5-10芽，形态学上端用封口膜封好，形态学下端浸泡2‰蔗糖水溶液中室内培养，保持环境温度25±2℃，保证室内清洁，2-3天更换一次水溶液，两周后，腋芽萌出，待芽体长至1-2cm时，取幼嫩芽体于超净工作台上，置于灭过菌的空瓶内，75%酒精表面消毒1min，倒出酒精，加入质量体积比为0.1%升汞深入消毒12min，升汞溶液与外置体充分震荡，保证消毒彻底，倒出消毒液，外植体更换入新的灭菌瓶内，无菌水震荡冲洗4-5次，再于灭菌滤纸上晾干，去掉芽体基部的伤口及损伤的叶片，接种于外植体萌发培养基MS+ZT5.0 mg/L+2%蔗糖+0.8%琼脂上，35天后，芽体展叶，生长健壮，获得无菌苗。接种材料于光照条件下培养，光照强度2400Lx，培养室内温度25±2℃，光照12h/d。

2、不定芽再生诱导

于超净工作台上切取无菌苗叶柄，切成0.5cm小段，置于再生培养基MS+ZT 3.0 mg/L+IAA2.0 mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂上，pH调至5.8，进行不定芽的再生诱导。接种材料置于光照条件下培养。光照强度2500Lx，培养室内温度25±2℃，光照12h/d。38天后，叶柄直接再生不定芽，数量多，且为丛芽，分化快，颜色亮绿色，不定芽直接再生可达86.8%。

3、不定芽增殖、壮苗培养

再生获得不定芽在最佳不定芽再生培养基上继代一次后，将不定芽切分成单个芽体，置于MS+ZT 1.8 mg/L+IAA 0.2 mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂培养基上进行增殖壮苗培养，pH调至5.8。光照强度4000Lx，培养室内温度25±2℃，光照12h/d。

4、生根培养

将生长状态相对一致的高 2-3cm，具5-6片叶的不定芽切下，接种于1/2MS+IBA 1.0mg/L+3%蔗糖+1.5%琼脂的生根培养基上进行生根培养，不需调节pH值。光照强度4000Lx，培养室内温度25±2℃，光照12h/d，15天即现肉眼可见不定根，短粗、健壮，35天后根长2.5-3.5cm，3-7条根，即可移栽。

5、移栽

生根培养35天后，直接取出生根瓶苗，用自来水洗净根基上的培养基，种苗栽至装有营养土的小营养钵，营养土成分为：腐殖土：珍珠岩=2:1。营养钵上方加塑料薄膜，保证新移栽种苗所处的环境湿度为88%，温度控制在25-30℃，16天后去掉塑料薄膜，环境湿度适当降低至70%。28天后常规水肥管理，环境温度控制在35℃以下，高温夏季需遮阴及湿帘降温。

两个月后统计成活率高达92.8%。

Claims (1)

1.一种猕猴桃金玉的组培快繁方法，包括以下步骤：

①无菌苗的获得

1）于11月底从金玉母树上剪取生长健壮腋芽饱满的一年生枝条，将枝条剪成30cm长枝段，每段5-10芽；

2）将所述枝段形态学上端用封口膜封好，形态学下端浸泡2‰蔗糖水溶液中室内培养，保持环境温度25±2℃，保证室内清洁，2-3天更换一次水溶液，两周后，腋芽萌出；

3）待腋芽芽体长至1-2cm时，取幼嫩芽体于超净工作台上，置于灭过菌的空瓶内，75%酒精表面消毒1min，倒出酒精，加入质量体积比为0.1%升汞深入消毒8-12min，升汞溶液与外植体充分接触震荡，保证消毒彻底，倒出消毒液，外植体更换入新的灭菌瓶内，无菌水震荡冲洗4-5次，再于灭菌滤纸上晾干；

4）去掉腋芽芽体基部的伤口及损伤的叶片，接种于外植体萌发培养基上；

5）28-35天后，芽体展叶，生长健壮，获得无菌苗；

②不定芽再生诱导

1）于超净工作台上切取无菌苗叶柄，切成0.5cm小段，置于再生培养基上，pH调至5.8，进行不定芽的再生诱导；

2）接种材料置于光照条件下培养；

3）35-45天后，叶柄直接再生不定芽；

③不定芽增殖、壮苗培养

再生获得不定芽在最佳不定芽再生培养基上继代一次后，将不定芽切分成单个芽体，置于增殖壮苗培养基上进行增殖壮苗培养，pH调至5.8；

④生根培养将生长状态相对一致的高 2-3cm，具5-6片叶的不定芽切下，接种于生根培养基上进行生根培养，12-15天即现肉眼可见不定根，短粗、健壮，35-40天后根长2.5-3.5cm，3-7条根，即可移栽；

⑤移栽

1）生根培养35天后，直接取出生根瓶苗，用自来水洗净根基上的培养基；

2）种苗栽至装有营养土的小营养钵，营养钵上方加盖塑料薄膜，保证新移栽种苗所处的环境湿度为85%-90%，温度控制在25-30℃，15-18天后去掉塑料薄膜，环境湿度适当降低至60%-75%；

3）25-35天后常规水肥管理，环境温度控制在35℃以下，高温夏季需遮阴及湿帘降温；

其特征在于：

所述萌发培养基为：MS+ZT 1.0-5.0 mg/L+1%-2%蔗糖+0.8%琼脂；

所述无菌苗的获得方法中，接种材料培养条件为：光照强度2400-2600Lx，光照12h/d，培养室内温度25±2℃；

所述叶柄再生培养基为：MS+ZT 1.0-3.0 mg/L+IAA 0.1-2.0 mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂；

所述不定芽再生诱导方法中，接种材料培养条件为：光照强度2500-3000Lx，光照12h/d，培养室内温度25±2℃；

所述增殖壮苗培养基为：MS+ZT 0.5-1.8 mg/L+IAA 0.05-0.2 mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂；

所述不定芽增殖、壮苗培养方法，接种材料培养条件为：光照强度3000-3400Lx，光照12h/d，培养室内温度25±2℃；

所述生根培养基为：1/2MS+IBA 0.1-1.0 mg/L+3%蔗糖+0.8-1.5%琼脂；

所述生根培养方法中，接种材料培养条件为：光照强度3800-4000Lx，光照12h/d，培养室内温度25±2℃；

所述营养土成分为：腐殖土：珍珠岩=2：1。