CN109156361A - 一种修枝荚蒾离体组培快速繁殖方法 - Google Patents

一种修枝荚蒾离体组培快速繁殖方法 Download PDF

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Abstract

一种修枝荚蒾离体组培快速繁殖方法，属于植物组织培养技术领域，解决了现有修枝荚蒾组织培养中污染率高、成活率低的问题。本发明采用植物组织培养技术，以修枝荚蒾的半木质化茎段为外植体，首先用外植体灭菌方法获得成活率高、死亡率和污染率相对较低的外植体，以MS为基本培养基，添加不同适宜种类及浓度植物激素诱导腋芽萌发，在适宜的培养条件下，再经增殖培养、生根培养及移栽，可在短时间内获得大量再生优质植株，为修枝荚蒾组织培养快速繁殖奠定了一定基础并提供了必要的技术支撑。本发明方法可以为修枝荚蒾的规模化繁育优质苗木提供技术参考，对修枝荚蒾综合开发利用具有重要意义。

Description

一种修枝荚蒾离体组培快速繁殖方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种修枝荚蒾离体组培快速繁殖方法。
背景技术
修枝荚蒾又名暖木条荚蒾，为忍冬科(Caprifoliaceae)、荚蒾属(Viburnum)、裸芽组的落叶灌木，树高多1-2m，一般不超过5m，暗灰色树皮，仅一年生小枝覆盖短绒毛，纸质的卵形或椭圆形叶片具有短绒毛。聚伞状花絮，白色辐射状花冠。核果初熟期为红色，成熟期为黑色，种子为长圆形，表面有凹槽。修枝荚蒾开花期在5-6月，果熟期在8-9月。该植物不仅可供观赏，同时果实可食用，种子能榨油，是一种油脂植物资源。修枝荚蒾对土壤要求不严格，适应环境能力较强，抗寒、耐旱，是花、果、叶均可观赏的优良绿化树种。
目前，现存的修枝荚蒾野生资源相对较少，因此培育大量优质苗木势在必行。修枝荚蒾种子休眠期长，且种皮结构坚硬致密，必需经过层积处理后才能播种，且种子发芽率低。荚蒾种子春播后大多当年并不萌发，苗木播种繁殖周期长，下一年才能出苗，从而影响下一步新品种繁育以及制种等工作，不利于其开发和利用。而采用扦插繁殖，又受扦插材料来源和季节限制，这些因素制约了修枝荚蒾苗木的快速繁育，而植物组织培养可以有效解决上述问题。鉴于此，有必要建立一种修枝荚蒾的组培快速繁殖方法，为修枝荚蒾快速繁育提供一条新途径。
植物组织培养的优点在于繁育优质苗木不受季节限制、繁殖速度快、可获得无毒苗、可周年生产等方面。采用此种方法培育出的再生植株后代遗传性状稳定，能保持优良性。但该技术同时也受诸多方面因素的影响，尤其是木本植物，要成功建立离体组培繁殖体系并不容易。
发明内容
为了解决现有修枝荚蒾组织培养中污染率高、成活率低的问题从而实现修枝荚蒾优质苗木规模化快速繁育，本发明提供一种修枝荚蒾离体组培快速繁殖方法。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的一种修枝荚蒾离体组培快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)组培外植体的选取与处理：选择生长健壮、无病虫害的当年生修枝荚蒾幼嫩枝条作为外植体，先用洗衣粉或洗洁精浸泡25～35min，再用自来水连续冲洗至少1h，最后用0.1％升汞灭菌4～12min，无菌水冲洗3～5次，获得无菌外植体；
(2)初代培养：将无菌外植体剪成1.5～2.5cm的带芽茎段，接种于初代培养基上，置于培养室内进行初代培养，使腋芽萌发和生长，培养时间为30天，培养条件为：每天保持光照14h，光照强度为2000Lx，培养温度为25℃；
(3)增殖培养：将经初代培养获得的芽苗转接到增殖培养基上，置于培养室内进行增殖培养，培养条件同步骤(2)，继代周期为30天，最终获得丛生芽苗；
(4)瓶内生根培养：选取高度为2～3cm、生长健壮的无根丛生芽苗转接到生根培养基上，置于培养室内进行生根培养，培养条件同步骤(2)，培养时间为至少30天，直至生根，获得瓶内生根的组培苗；
(5)炼苗移栽：选取根系生长良好、健壮的组培苗进行炼苗，首先打开组培瓶瓶盖，将其置于自然光照下炼苗3～5天，然后从组培瓶内取出组培苗，用清水洗净根部附着的培养基后移栽到消毒基质中，完成修枝荚蒾离体组培快速繁殖。
作为优选的实施方式，步骤(2)中，所述初代培养基的组份及含量为：MS培养基、1.0mg/L 6-BA、0.1mg/L IBA、30g/L蔗糖、8～10g/L琼脂粉，pH为5.8～6.0。
作为优选的实施方式，步骤(3)中，所述增殖培养基的组份及含量为：MS培养基、2.0mg/L 6-BA、0.2mg/LIBA、0.4mg/L GA3、30g/L蔗糖、8～10g/L琼脂粉，pH为5.8～6.0。
作为优选的实施方式，步骤(4)中，所述生根培养基的组份及含量为：1/2MS培养基、2.0mg/L IBA、30g/L蔗糖、8～10g/L琼脂粉，pH为5.8～6.0。
作为优选的实施方式，步骤(5)中，所述消毒基质包括体积比为2:1的细河沙和草炭土。
作为优选的实施方式，步骤(5)中，所述消毒基质在使用前，首先采用0.5％的KMnO4溶液进行消毒，然后再用清水冲洗3～5次。
本发明的有益效果是：本发明采用植物组织培养技术，以修枝荚蒾的半木质化茎段为外植体，首先用外植体灭菌方法获得成活率高(高于65％)、死亡率和污染率相对较低的外植体，以MS为基本培养基，添加不同适宜种类及浓度植物激素诱导腋芽萌发，在适宜的培养条件下，再经增殖培养、生根培养及移栽，可在短时间内获得大量再生优质植株，从而解决了修枝荚蒾组织培养中污染率高、成活率低等方面的技术难题，为修枝荚蒾组织培养快速繁殖奠定了一定基础并提供了必要的技术支撑。本发明方法可以为修枝荚蒾的规模化繁育优质苗木提供技术参考，对修枝荚蒾综合开发利用具有重要意义。
附图说明
图1为修枝荚蒾初代培养实物图。
图2为修枝荚蒾增殖培养实物图。
图3为修枝荚蒾生根培养实物图。
图4为修枝荚蒾炼苗移栽实物图。
图5为修枝荚蒾花(图5A)、叶(图5B)、果(图5C)和种子(图5D)实物图。
具体实施方式
本发明的一种修枝荚蒾离体组培快速繁殖方法，具体包括以下步骤：
(1)组培外植体的选取与处理：选择生长健壮、无病虫害的当年萌发的修枝荚蒾幼嫩枝条作为外植体，从田间取材，带回实验室先对外植体进行前处理：先用洗衣粉或洗洁精浸泡25～35min，初步剪截茎段和叶片，再用自来水连续冲洗至少1h以上，然后进入无菌操作室进行灭菌：用0.1％升汞灭菌4～12min(根据茎段老嫩程度，消毒时间不同)，无菌水冲洗3～5次，获得无菌外植体；
(2)初代培养：将无菌外植体剪成1.5～2.5cm左右的带芽茎段，接种于事先配制好的初代培养基(MS培养基、1.0mg/L 6-BA、0.1mg/L IBA、30g/L蔗糖、8～10g/L琼脂粉，pH为5.8～6.0)上，置于培养室内进行初代培养，使腋芽萌发和生长，培养时间为30天，培养条件为：每天保持光照14h(每天早8:00至晚22:00)，光照强度为2000Lx，培养温度为25℃；经过30天左右分化出少量丛生芽，茎段伸长生长至3～4cm；
(3)增殖培养：将经步骤(2)初代培养获得的成活且生长良好的芽苗从外植体上切下，转接到增殖培养基(MS培养基、2.0mg/L 6-BA、0.2mg/L IBA、0.4mg/L GA3、30g/L蔗糖、8～10g/L琼脂粉，pH为5.8～6.0)上，置于培养室内进行增殖培养，培养条件同步骤(2)，一般30天左右继代一次；
(4)瓶内生根培养：选取高度为2～3cm、生长健壮的无根丛生芽苗转接到生根培养基(1/2MS培养基、2.0mg/L IBA、30g/L蔗糖、8～10g/L琼脂粉，pH为5.8～6.0)上，置于培养室内进行生根培养，培养条件同步骤(2)，培养时间为至少30天，大约20天开始生根，30天可产生3～5条粗壮的不定根，生根率可达90％以上，获得瓶内生根的组培苗；
(5)炼苗移栽：选取根系生长良好、健壮的组培苗进行炼苗，首先打开组培瓶瓶盖，将其置于自然光照下3～5天进行苗木锻炼，以适应新的环境，然后从组培瓶内取出组培苗，用清水洗净根部附着的培养基后移栽到事先配制好的消毒基质(消毒基质在使用前，首先采用0.5％的KMnO4溶液进行消毒，然后再用清水冲洗3～5次，消毒基质包括体积比为2:1的细河沙和草炭土)中，完成修枝荚蒾离体组培快速繁殖。在炼苗移栽之后，要保证温度，逐渐降低湿度，光照逐渐增强；移栽15～20天组培苗可长出新根，移栽成活率达80％以上。
以吉林农业大学将果园内长势良好、无病虫害的修枝荚蒾植株的幼嫩茎枝为试验材料。下面通过实施例对本发明进行详细描述，需要指出的是实施例只是针对本发明进行进一步的阐述，而不是对本发明保护范围的限制。
实施例1外植体消毒及初代培养
选择生长健壮、无病虫害的当年萌发的修枝荚蒾幼嫩枝条或萌发条作为外植体，从田间取材，带回实验室先对外植体进行前处理：先用洗洁精浸泡30min，剪去幼枝上的叶片，留0.3～0.5cm叶柄，再用自来水连续冲洗2h，然后进入无菌操作室进行灭菌：用0.1％升汞灭菌10min，无菌水冲洗4次，获得无菌外植体；将无菌外植体剪成2cm左右的带芽茎段接种于初代培养基(初代培养基为在MS培养基中添加适宜浓度的6-BA(1.0mg/L)、IBA(0.1mg/L)蔗糖(30g/L)、琼脂粉(8～10g/L)，pH值调到5.8～6.0)上进行初代培养，使腋芽萌发和生长，培养条件为：每天保持光照14h(每天早8:00至晚22:00)，光照强度为2000Lx，培养温度为25℃；经过30天的初代培养，可分化出少量丛生芽，同时茎段伸长至3～4cm。如图1所示。
外植体经过灭菌处理后，接种在相应培养基上，观察统计其污染率、死亡率、成活率及生长情况。结果见表1。
表1不同消毒时间对外植体灭菌效果的影响
适宜的消毒时间下，无菌苗的污染率低，死亡率低，而成活率高。通过表1的数据显示，综合考虑污染率及死亡率，修枝荚蒾茎段的最佳消毒时间是10min，成活率能达到65％以上。
实施例2组培苗增殖培养
将初代培养成活的芽苗转入增殖培养基上进行继代增殖培养，每天光照14小时(每天早8:00至晚22:00)，光照强度为2000Lx，培养温度为25℃左右条件下培养。组培苗适宜的增殖培养基配方为在MS培养基中添加适宜浓度的6-BA(2.0mg/L)、IBA(0.2mg/L)、GA3(0.4mg/L)、琼脂粉(8～10g/L)、蔗糖(30g/L)，pH值调到5.8～6.0。经过多次继代培养后，形成丛生芽苗，如图2所示，继代周期为30天左右。不同基本培养基对组培苗增殖和生长的影响见表2。不同种类及浓度的生长素对组培苗增殖和生长的影响见表3。
表2不同基本培养基对组培苗增殖和生长的影响
如表2所示，基本培养基B5和N6不适于组培苗的增殖与生长，而在1/2MS培养基中的组培苗增殖系数也明显低于MS培养基中的组培苗的增殖系数，且长势不佳。
表3不同种类及浓度的生长素对组培苗增殖和生长的影响
表2和表3中，+表示组培苗长势较弱，苗枯黄矮小；++表示苗长势弱，茎细弱：+++表示苗稍挺拔健壮，长势一般，叶色黄绿；++++表示苗长势较好，茎粗壮挺拔，叶色浓绿。
如表3所示，组培苗在NAA中生长状况最差，在基部形成大量愈伤组织，不利于其生长发育，在IAA和IBA中组培苗长势明显好于NAA，但增殖系数方面，IBA的促进作用最为突出。
实施例3瓶内生根培养
将高度约为2～3cm、生长健壮的无根组培苗接种到生根培养基上进行生根培养，培养温度控制在25℃左右、光照强度2000Lx左右、光照时间为每天的早8:00至晚22:00点(14h)条件下诱导组培苗生根。最佳生根培养基为在1/2MS培养基中添加适宜浓度的IBA(2.0mg/L)、蔗糖(30g/L)、琼脂粉(8～10g/L)，pH值调到5.8～6.0。培养15～20天左右开始生根，30天可产生3～8条粗壮的不定根，如图3所示，生根率达90％以上。不同种类及浓度激素对组培苗生根的影响见表4。
表4不同种类及浓度激素对组培苗生根的影响
如表4所示，生根培养过程中，组培苗在NAA中由于基部形成大量愈伤组织，从而影响其整体长势，生根效果也受到影响，在IAA和IBA中生根率明显高于NAA。在IBA中，生根率最高可达90％以上(2.00mg/L IBA)。
实施例4炼苗移栽
修枝荚蒾在生根培养基中培养30天左右后，将根系生长良好、生长健壮的组培苗打开瓶盖，置于自然光照下炼苗4天，然后洗净根部培养基，移栽到已消毒的基质中(草炭土和细河沙的体积比为1:2)，在此期间要管理精细，保证温湿度和光照，移栽成活率达85％以上。如图4所示和图5所示。
通过上述试验可知，采用本发明的修枝荚蒾离体组培快速繁殖方法，能有效获得消毒成功的外植体，提高外植体初代培养成活率、增殖培养的增殖率、组培苗生根率以及驯化移栽成活率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种修枝荚蒾离体组培快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)组培外植体的选取与处理：选择生长健壮、无病虫害的当年生修枝荚蒾幼嫩枝条作为外植体，先用洗衣粉或洗洁精浸泡25～35min，再用自来水连续冲洗至少1h，最后用0.1％升汞灭菌4～12min，无菌水冲洗3～5次，获得无菌外植体；
(2)初代培养：将无菌外植体剪成1.5～2.5cm的带芽茎段，接种于初代培养基上，置于培养室内进行初代培养，使腋芽萌发和生长，培养时间为30天，培养条件为：每天保持光照14h，光照强度为2000Lx，培养温度为25℃；
(3)增殖培养：将经初代培养获得的芽苗转接到增殖培养基上，置于培养室内进行增殖培养，培养条件同步骤(2)，继代周期为30天，最终获得丛生芽苗；
(4)瓶内生根培养：选取高度为2～3cm、生长健壮的无根丛生芽苗转接到生根培养基上，置于培养室内进行生根培养，培养条件同步骤(2)，培养时间为至少30天，直至生根，获得瓶内生根的组培苗；
(5)炼苗移栽：选取根系生长良好、健壮的组培苗进行炼苗，首先打开组培瓶瓶盖，将其置于自然光照下炼苗3～5天，然后从组培瓶内取出组培苗，用清水洗净根部附着的培养基后移栽到消毒基质中，完成修枝荚蒾离体组培快速繁殖。
2.根据权利要求1所述的一种修枝荚蒾离体组培快速繁殖方法，其特征在于，步骤(2)中，所述初代培养基的组份及含量为：MS培养基、1.0mg/L 6-BA、0.1mg/LIBA、30g/L蔗糖、8～10g/L琼脂粉，pH为5.8～6.0。
3.根据权利要求1所述的一种修枝荚蒾离体组培快速繁殖方法，其特征在于，步骤(3)中，所述增殖培养基的组份及含量为：MS培养基、2.0mg/L 6-BA、0.2mg/LIBA、0.4mg/L GA3、30g/L蔗糖、8～10g/L琼脂粉，pH为5.8～6.0。
4.根据权利要求1所述的一种修枝荚蒾离体组培快速繁殖方法，其特征在于，步骤(4)中，所述生根培养基的组份及含量为：1/2MS培养基、2.0mg/L IBA、30g/L蔗糖、8～10g/L琼脂粉，pH为5.8～6.0。
5.根据权利要求1所述的一种修枝荚蒾离体组培快速繁殖方法，其特征在于，步骤(5)中，所述消毒基质包括体积比为2:1的细河沙和草炭土。
6.根据权利要求1所述的一种修枝荚蒾离体组培快速繁殖方法，其特征在于，步骤(5)中，所述消毒基质在使用前，首先采用0.5％的KMnO4溶液进行消毒，然后再用清水冲洗3～5次。
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