CN111771726A - 一种美味猕猴桃砧木无根组培苗的移栽方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种美味猕猴桃砧木组培苗的移栽方法，属于植物组培繁殖技术领域。该方法将增殖培养后的美味猕猴桃‘金魁’的组培丛生芽冲洗干净，切开分离成单个苗株，然后进行灭菌处理，再将未生根的单个苗株下端均匀沾满生根活根粉，直接插入填好基质的育苗穴盘中，进行正常育苗培养，两个月后移栽到苗圃。本发明采用生根剂处理代替生根培养和炼苗处理，并通过移栽过程中的控制管理，达到了较高的移栽成活率，同时大幅度缩短了猕猴桃组培繁殖时间和育苗成本。
Description
技术领域
本发明属于植物组培繁殖技术领域，涉及猕猴桃组培快繁技术，特别涉及一种美味 猕猴桃砧木无根组培苗的移栽方法。
背景技术
猕猴桃是被子植物门双子叶植物纲猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia) 多年生落叶藤本植物。猕猴桃属植物的分类学比较困难，不同品种间性状经常变异重叠， 1911年Dunn首次修订认为猕猴桃属有23种，随着时间的推移，科学工作者们逐渐发 现越来越多的种类，2002年Cui等认定猕猴桃属有66种，其中62种在中国(XinweiLi, Jianqiang Li..Advances in the study of the systematics of ActinidiaLindley[J]Frontiers of Biology in China,2009,(1):55-61)。常见的猕猴桃有中华猕猴桃、美味猕猴桃、软枣猕猴 桃、狗枣猕猴桃、硬齿猕猴桃、黄毛猕猴桃和毛花猕猴桃等等。
美味猕猴桃因适应性强、试种范围广、同多数接穗品种嫁接的亲和力强，被作为猕猴桃优良品种嫁接繁育的主要砧木类型。‘金魁’系美味猕猴桃，是湖北省农业科学院 果树茶叶研究所猕猴桃课题组从野生猕猴桃“竹溪2号”中经实生选育而来(陈庆红. 猕猴桃优良品种——金魁[J].果树实用技术与信息,2002(01):13.)，也是目前生产上广泛 应用的美味猕猴桃砧木品种。但目前生产上是以‘金魁’猕猴桃的种子繁殖得到的实生 苗作为砧木，因猕猴桃为雌雄异株植物，实生苗株间变异大，不能保持母本的优良特性， 很难生产出稳定一致的砧木，对种苗的标准化生产有较大影响，不利于猕猴桃产业高质 量发展。
近年来，猕猴桃在世界上许多国家受到广泛欢迎，为了将这种作物商业化并满足种 植材料日益增长的需求，组织和器官培养技术正被用作许多国家繁殖的替代方法。植物组织培养是在人工调控的合适的无菌条件下，将野外植物的组织部分放入培养基中进行培养，使其产生愈伤组织进而分化出器官，形成完整植株。最为重要的是，通过组织培 养技术获得的猕猴桃种苗完整保留了母本的优良形状，且可对种苗进行有效复壮，对培 育猕猴桃优质健康种苗以及推动猕猴桃种苗标准化生产奠定了基础。猕猴桃几乎所有的 组织器官都可作为外植体材料进行研究，不同类型的外植体和培养基被用作诱导愈伤组 织，形成器官和生根的效果存在差异。
目前，现有的猕猴桃组培苗需生根培养并经过炼苗驯化后才能移栽，而生根培养和 炼苗处理均耗时耗力，大幅度增加了猕猴桃组培繁殖的时间和育苗成本。
发明内容
鉴于现有技术的不足，发明人经研究美味猕猴桃‘金魁’与其他品种的物种基因型差异性，创造性地提供了一种无需生根培养和炼苗驯化处理的美味猕猴桃砧木组培苗移栽方法。
为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究，最终获得了如下技术方案：一种美味猕猴桃砧木无根组培苗的移栽方法，该方法包括：将增殖培养后的美味猕猴桃 ‘金魁’的组培丛生芽冲洗干净，切开分离成单个苗株，然后进行灭菌处理，再将未生 根的单个苗株下端均匀沾满生根活根粉，直接插入填好基质的育苗穴盘中，进行正常育 苗培养，光照强度不高于25000Lux，温度25℃，湿度不低于75％，两个月后移栽到苗 圃。
需要说明的是，本发明所采用的生根活根粉为宝来化肥(烟台)有限公司生产， 登记证号为农肥(2012)准字2471号，商品名为“一撒宝来”，含营养成分生物钾≥ 7％，黄腐酸钾≥8％，络合磷≥6％，铜、锌、铁、硼、钙、镁≥10％，含增效成分为聚合 剂、葡萄糖肽脂、吲哚丁酸钾、萘乙酸钠。
进一步优选地，如上所述美味猕猴桃砧木组培苗的移栽方法，其中的增殖培养包括 如下步骤：
(1)外植体的选取与消毒：从‘金魁’系美味猕猴桃一年生母树上剪取生长健壮，且顶芽和腋芽饱满的当年生嫩枝，长度10～15cm，每段含顶芽及3～5个腋芽，将所取 嫩枝在流水下冲洗后，剪切下带芽茎段，装入瓶中，用0.1ml/L的百时清浸泡8～15min， 再用纯净水浸洗5～6次，然后于超净工作台中，将所述茎段用1g/L升汞溶液浸泡 10～15min后，用75％酒精浸泡处理2.5～3.5min，最后用无菌水浸洗4～8次；
(2)不定芽再生诱导：于超净工作台中切取上述灭菌带芽茎段上的顶芽或腋芽，置于光照强度3000～3200Lux、光照时长12h/d、温度24℃的条件下进行培养，培养基组 成为MS+蔗糖29～31g/L+琼脂7～8g/L+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L，pH＝6.20～6.24， 培养25～30d时顶芽或腋芽再生为不定芽；
(3)不定芽增殖培养：将诱导获得的不定芽置于光照强度3000～3200Lux、光照12h/d、温度24℃条件下进行增殖培养，培养基组成为MS+蔗糖29～31g/L+琼脂7～8g/L +6-BA0.5mg/L+GA34mg/L，pH＝6.20～6.24，培养培养25～30d后，不定芽增殖系数达 4～5。
需要说明的是，本发明所采用的百时清(Bestking)属于一种杀菌灭藻剂，为上海永通生态工程股份有限公司生产，剂型为水剂，主要功能成分为阳离子表面活性剂，阳 离子表面活性剂的含量≥60.0％。
进一步优选地，如上所述美味猕猴桃砧木组培苗的移栽方法，上述步骤(1)中剪切下的带芽茎段每段长2～3cm，带一个顶芽或腋芽。
进一步优选地，如上所述美味猕猴桃砧木组培苗的移栽方法，上述步骤(2)中切取顶芽时，需切掉周围所有的小叶及绒毛，保留0.3～0.5cm，垂直插入培养瓶；切取腋 芽时，需切掉茎上端、茎下端和叶柄的切口，保留0.5～1cm，插入培养瓶，使腋芽朝上。
进一步优选地，如上所述美味猕猴桃砧木组培苗的移栽方法，上述步骤(2)、(3)按照配方配制相应培养基后，分别加热煮沸两次后进行分装，每1L培养基分装到20～22 个培养瓶中，120℃下高压灭菌20min，冷却后置入超净工作台备用。
进一步优选地，如上所述美味猕猴桃砧木组培苗的移栽方法，上述灭菌处理的步骤为：将洗净的苗株放入1000倍多菌灵中浸泡1min，晾干。
进一步优选地，如上所述美味猕猴桃砧木无根组培苗的移栽方法，上述的基质组成为：泥炭∶珍珠岩：蛭石＝8∶1∶1。
与现有技术相比，本发明涉及的美味猕猴桃组培快繁方法具有如下优点和进步性：
(1)本发明方法采用生根活根粉沾满处理代替生根培养和炼苗驯化处理，并通过移栽过程中的控制管理，达到了较高的移栽成活率，同时大幅度缩短了猕猴桃组培繁殖 时间和育苗成本。该方法简便易行，节约了组培苗生根和移栽前驯化时间，总计缩短育 苗进程60d以上，非常适合工厂化育苗的需要，是值得推广的简化育苗技术。
(2)传统的猕猴桃组培过程中，外植体在流水下冲洗后便采用酒精、升汞一次消毒，但猕猴桃的茎段上及芽上有很多短绒毛，流水冲洗后加入酒精、升汞消毒，会在外 植体表面产生很多小气泡，导致不能彻底杀菌，消毒效果大打折扣，污染率很高。本发 明通过在消毒之前加入0.1ml/L的百时清处理后，再加入酒精、升汞后，污染率极低， 甚至可达到零染菌情况发生。
(3)传统猕猴桃组培过程中，先加入酒精浸泡处理后再加入升汞溶液处理，但这种处理后褐化率很高，达到50％以上，而本发明通过先加入升汞、再加入酒精的顺序处 理外植体，有效解决了外植体褐化的问题(褐化率为0％)。
(4)外植体可以选用顶芽或腋芽，并筛选了组分科学的不定芽诱导培养基配方，使得再生诱导率显著提高至90％以上。
(5)传统猕猴桃组培过程中，在制作增殖培养基时，需要在培养基灭菌冷却到40℃左右时加入GA3，但琼脂培养基在35℃时就开始凝固，整个灌装过程时间短、程序繁琐， 很容易染菌，不适应工厂化大规模生产应用。本发明采用在培养基灭菌前一次性加入一 定量的GA3，再进行高温灭菌，解决了必须等到培养基冷却至40℃以下再灌装带来的各 种问题，不仅简化了工序、节约了时间，而且减少了污染，适合工厂化生产的需要。
附图说明
图1是本发明‘金魁’猕猴桃组培的丛生芽诱导及分化初期示意图。
图2是本发明‘金魁’猕猴桃组培的丛生芽分化阶段示意图。
图3是本发明‘金魁’猕猴桃组培的丛生芽增殖阶段示意图。
图4是本发明‘金魁’猕猴桃组培的丛生芽增壮阶段示意图。
图5是本发明‘金魁’猕猴桃组培的无菌苗生根示意图。
具体实施方式
以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发 明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在 本发明的保护范围之内。
实施例1外植体处理
将野外收集的枝条在流水下冲洗30min，置于超净工作台上，用体积分数为75％的酒精表明消毒3min,无菌水冲洗4次，用0.1％的HgCI2溶液进行消毒，时间设置为4、6、 8、10、12min，无菌水冲洗4次。灭菌茎段剪成1.5cm长度，每个茎段带一个腋芽，垂 直插入培养基中，培养基为MS培养基添加0.2mg/LNAA和2mg/L6-BA。30天后统 计污染率。同时探索先升汞后酒精消毒试验，时间设置不变。试验结果见表1。
将野外收集的枝条在流水下冲洗30min，添加0.1ml/L的百时清浸泡10min(以 不添加百时清为对照)，用无菌水冲洗3次，置于超净工作台上，用0.1％的HgCI2溶液 进行消毒8min，无菌水冲洗4次,用体积分数为75％的酒精表明消毒3min,无菌水冲洗4 次。灭菌茎段剪成1.5cm长度，每个茎段带一个腋芽，垂直插入培养基中，培养基为MS 培养基添加0.2mg/L NAA和2mg/L 6-BA。30天后统计污染率。试验结果见表2。
表1用0.1％的HgCI2消毒时间对猕猴桃芽成活的影响
注：同列不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)，下同。
表2添加0.1ml/L的百时清对外植体成活的影响
| 处理 | 污染率/％ | 成活率/％ |
| 1(添加0.1ml/L的百时清) | 2.23 | 96.67 |
| CK(不添加百时清) | 43.06 | 51.06 |
带芽茎段接入培养基5-7天后，侧芽出现膨大、变绿，随后10天内伸长、长出叶 片，形成小茎。但是，培养过程中，从第5天开始，陆续开始出现细菌污染，大多数为 黄色，少数为白色。从试验结果可看出，无论是先用酒精消毒后再用升汞消毒一定时间， 还是先用升汞消毒一定时间再用酒精消毒，随着消毒时间增长，污染率降低，成活率先 增后减。值得注意的是，先用酒精消毒再用升汞消毒的5个处理出现了不同程度的褐化， 褐化率高达50％，而先升汞后酒精消毒处理的外植体未出现褐化。其中以先升汞消毒8min、后酒精消毒3min的处理综合表现最佳，既能保持较高的成活率，又能保持较低 的污染率。在此基础上，添加0.1ml/L的百时清浸泡10min后，升汞消毒8min、酒精 消毒3min，污染率明显降低，成活率大大提高。
实施例2不定芽再生诱导
于超净工作台中切取上述灭菌嫩枝段的顶芽或腋芽作为外植体。切取顶芽时尽量切 掉周围所有的小叶及绒毛，保留0.3-0.5cm左右垂直插入芽诱导培养基中；腋芽取芽 时切掉三段切口(茎上端、茎下端、叶柄)，保留0.5～1cm左右，插入芽诱导培养基， 使腋芽朝上。芽诱导培养基为MS培养基添加0.2mg/LNAA和1～5mg/L6-BA。每个培 养瓶中1个茎段，每个处理10瓶，重复3次。置于光照强度3000～3200Lux、光照时长 12h/d、温度24℃的条件下进行培养。30天后统计成活率，调查是否有褐化、玻璃化等 现象。试验结果见表3。
表3不同质量体积比6-BA对不定芽诱导的影响
注：不定芽诱导率％＝(有不定芽产生的茎段/接种数)*100％
由表3可以看出，在NAA的添加量确定为0.2mg/L的情况下，随着6-BA浓度的增 加，不定芽诱导率增高，当6-BA的添加量为2mg/L时，不定芽的诱导率达到最大值 93.33％，后随着浓度的增加，不定芽诱导率显著降低。‘金魁’猕猴桃不定芽诱导培养 基最佳配方为MS+0.2mg/LNAA+2.0mg/L6-BA.
实施例3不定芽增殖培养
以MS为基本培养基，分别添加6-BA和GA3处理。6-BA的浓度梯度设置为0.3mg/L、0.5mg/L、0.7mg/L，GA3的处理分为灭菌前加入和灭菌后加入两种，灭菌前的浓度梯度 设置为1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L，灭菌后的浓度梯度设置为0.1mg/L、0.2mg/L、 0.3mg/L、0.4mg/L(滤器过滤后加入)。每瓶3-4个茎段，每个处理10瓶，重复3次。 置于光照强度3000～3200Lux、光照12h/d、温度24℃条件下，进行不定芽的增殖培养 30天后统计增殖系数，调查是否有褐化、玻璃化等现象。试验结果见表4.
表4不同质量体积比6-BA和GA3对芽增殖的影响
从表4可以看出，两种处理方式中随着GA3浓度的增大，增殖系数越大，6-BA浓度变化对增殖系数影响不大，但当6-BA浓度低于0.5mg.L-1时，植株木质化明显。最佳 增殖培养基为MS++0.5mg/L6-BA+4.0mg/LGA3(培养基高温灭菌前加入),植株生长 健壮，且增殖系数较高。此外，培养基加入GA3后进行高温灭菌，无须等到培养基冷却 到40℃以下进行分装，节约了时间，简化了工序，更有利于工厂化育苗操作。
实施例4移栽
采用实施例3组培增殖培养后的美味猕猴桃丛生芽，即无根组培苗，经过一定处理后直接插入基质，具体操作如下：
1)生根粉处理：将增殖培养后的美味猕猴桃丛生芽组培苗取出，用流水将培养基质洗净。将洗净的丛生芽用无菌刀片切开分离成单个苗株，放入1000倍多菌灵溶液中 浸泡1min，晾干，然后将苗株下端均匀沾满生根活根粉(宝来化肥(烟台)有限公司 生产，登记证号为农肥(2012)准字2471号，商品名为“一撒宝来”，通用名为大量 元素水溶肥料：含营养成分生物钾≥7％，黄腐酸钾≥8％，络合磷≥6％，铜、锌、铁、 硼、钙、镁≥10％，含增效成分聚合剂、葡萄糖肽脂、吲哚丁酸钾、萘乙酸钠)。
2)穴盘移栽：将沾满生根粉的无根苗株直接插入事先填好基质的50孔育苗穴盘中， 无根苗株埋入基质中1cm左右。基质配比为丹麦品氏纯泥炭土∶珍珠岩：蛭石＝8∶1： 1，其中进口泥炭为丹麦品氏纯泥炭土，pH5.5，短纤维0-10mm。
3)环境控制：无根苗株移入穴盘后，进入正常温室生产管理，光照强度不高于25000 Lux，温度不高于25℃，湿度不低于75％。
4)苗圃移栽：10d左右开始生根，1个月须根即可长满孔穴，2个月即可移栽到苗圃，同时统计移栽成活率(见表5)。
同时设置对比例，采用组织培养并完成生根过程的美味猕猴桃组培苗(已达到出瓶 标准)，即有根组培苗，将有根组培苗置于温室大棚内3d，光照8000～10000Lux，温 度25℃，进行驯化处理，然后取出，用流水将培养基质洗净，将植株置于1000倍多菌 灵溶液中浸泡1min进行灭菌处理，后将苗株移栽到育苗穴盘中，根部埋入基质中(丹 麦品氏纯泥炭土∶珍珠岩：蛭石＝8∶1：1)，在栽好苗株的穴盘上覆盖一层无纺布，同 时保持无纺布湿润，5～7d后缓苗结束，移除无纺布，并控制环境条件为：前期13～16d， 光照6000～8000Lux，温度22～24℃，湿度96～98％；中期13～16d，光照8000～15000Lux， 温度24～28℃，湿度76～78％；后期根据苗株长势，逐步提高光照强度，待植株健壮且 生长稳定后，进入正常温室生产管理，光照强度不高于25000Lux，温度不高于30℃， 湿度不低于75％。2个月后，组培苗生长健壮后即可移栽到苗圃园，同时统计移栽成活 率(见表5)。
表5不同种类组培苗移栽后生长情况调查
| 移栽苗种类 | 成活率/％ | 60d株高/cm | 60d地径/cm |
| 无根组培苗 | 94.33 | 8.55 | 0.27 |
| 有根组培苗 | 88.67 | 8.09 | 0.21 |
从表5可以看出，本发明的无根组培苗的移栽成活率高达94.33％，明显高于有根组培苗移栽，同时在生长势方面表现出显著优势，美味猕猴桃无根组培苗移栽60d后的 株高和地径均明显优于有根组培苗。更为重要的是，无根组培苗丛生芽无须生根培养， 经灭菌后直接移栽，大大缩短了组织培养阶段时间，提高了育苗效率，同时猕猴桃组培 生根培养环节所需条件繁琐，操作复杂，该环节的省略更是简化了操作、降低了成本， 对猕猴桃工厂化育苗的推进具有重要意义。
Claims (7)
1.一种美味猕猴桃砧木无根组培苗的移栽方法，其特征在于，该方法包括：将增殖培养后的美味猕猴桃‘金魁’的组培丛生芽冲洗干净，切开分离成单个苗株，然后进行灭菌处理，再将未生根的单个苗株下端均匀沾满生根活根粉，直接插入填好基质的育苗穴盘中，进行正常育苗培养，光照强度不高于25000Lux，温度25℃，湿度不低于75％，两个月后移栽到苗圃。
2.根据权利要求1所述美味猕猴桃砧木组培苗的移栽方法，其特征在于，所述的增殖培养包括如下步骤：
(1)外植体的选取与消毒：从‘金魁’系美味猕猴桃一年生母树上剪取生长健壮，且顶芽和腋芽饱满的当年生嫩枝，长度10～15cm，每段含顶芽及3～5个腋芽，将所取嫩枝在流水下冲洗后，剪切下带芽茎段，装入瓶中，用0.1ml/L的百时清浸泡8～15min，再用纯净水浸洗5～6次，然后于超净工作台中，将所述茎段用1g/L升汞溶液浸泡10～15min后，用75％酒精浸泡处理2.5～3.5min，最后用无菌水浸洗4～8次；
(2)不定芽再生诱导：于超净工作台中切取上述灭菌带芽茎段上的顶芽或腋芽，置于光照强度3000～3200Lux、光照时长12h/d、温度24℃的条件下进行培养，培养基组成为MS+蔗糖29～31g/L+琼脂7～8g/L+6-BA 2mg/L+NAA 0.2mg/L，pH＝6.20～6.24，培养25～30d时顶芽或腋芽再生为不定芽；
(3)不定芽增殖培养：将诱导获得的不定芽置于光照强度3000～3200Lux、光照12h/d、温度24℃条件下进行增殖培养，培养基组成为MS+蔗糖29～31g/L+琼脂7～8g/L+6-BA0.5mg/L+GA34mg/L，pH＝6.20～6.24，培养培养25～30d后，不定芽增殖系数达4～5。
3.根据权利要求2所述美味猕猴桃砧木组培苗的移栽方法，其特征在于，步骤(1)中剪切下的带芽茎段每段长2～3cm，带一个顶芽或腋芽。
4.根据权利要求2所述美味猕猴桃砧木组培苗的移栽方法，其特征在于，步骤(2)中切取顶芽时，需切掉周围所有的小叶及绒毛，保留0.3～0.5cm，垂直插入培养瓶；切取腋芽时，需切掉茎上端、茎下端和叶柄的切口，保留0.5～1cm，插入培养瓶，使腋芽朝上。
5.根据权利要求2所述美味猕猴桃砧木组培苗的移栽方法，其特征在于，步骤(2)、(3)按照配方配制相应培养基后，分别加热煮沸两次后进行分装，每1L培养基分装到20～22个培养瓶中，120℃下高压灭菌20min，冷却后置入超净工作台备用。
6.根据权利要求1所述美味猕猴桃砧木组培苗的移栽方法，其特征在于，所述灭菌处理的步骤为：将洗净的苗株放入1000倍多菌灵中浸泡1min，晾干。
7.根据权利要求1所述美味猕猴桃砧木组培苗的移栽方法，其特征在于，所述的基质组成为：丹麦品氏纯泥炭土：珍珠岩：蛭石＝8：1：1。
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