CN108719069A - 一种成年雄性毛白杨组培幼化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种成年雄性毛白杨组培幼化方法，属于毛白杨无性繁殖技术领域，所述成年雄性毛白杨组培幼化方法包括以下步骤：以树龄为30～200年的雄性毛白杨成年优树的根萌条茎段为外植体进行基础培养获得生长良好的无菌苗；然后将无菌苗剪成1.0～1.5cm大小的带芽茎段，接种至增殖培养基中进行2～4代继代培养，获得无菌壮苗；对无菌苗进行生根培养，获得无菌育成苗；最后对无菌育成苗进行炼苗培养，获得幼化的育成苗，完成成年雄性毛白杨的组培幼化。本发明的方法能实现成年毛白杨繁殖体的幼化，高效诱导再生，可大量繁殖造林，同时保持母树的优良性状，避免苗木发生成熟效应，苗木质量差等问题，对生产实践具有重要的指导意义。

Description

一种成年雄性毛白杨组培幼化方法

技术领域

本发明属于毛白杨无性繁殖技术领域，具体涉及一种成年雄性毛白杨组培幼化方法。

背景技术

杨树是我国乃至世界上通过无性繁殖的主要造林树种之一，毛白杨(Populustomentosa)是优良用材和园林绿化树种，在中国北方有广泛栽培。毛白杨属于雌雄异株，雌株年年飞絮造成了很大的环境问题，因此研究雄性毛白杨的繁殖技术意义重大。

目前，对毛白杨进行无性繁殖的常用方法为扦插，但该方法不易生根，成活率不稳定，其他的方法有埋条、埋根、嫁接等，但上述方法所用材料比较多，费时费工，不能满足大量生产的需求。使用组培技术培育的无菌壮苗既能进行大量繁殖造林，又可保证母树性状的优良性，对于生产实践具有重要的指导意义。但是，目前在毛白杨组织培养生产过程中，对繁殖材料的幼化性问题未能给予足够的重视，为了达到快速出苗，早获利的目的，组织培养大多直接从母树上采枝条或利用水培枝条催芽后取茎尖或带腋芽的茎段作外植体，这样的外植体其幼年性难以保证，在继代过程中容易老化，且不利于以后的生长和进行遗传转化操作，这对林业生产造成了巨大的经济损失。因此，了解成年树木繁殖材料的幼化规律，采取措施实现成熟树木繁殖体的幼化，对成年雄性毛白杨组培技术有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种成年雄性毛白杨组培幼化方法，该方法具有繁殖效率高、重现性好的优点。

本发明提供一种成年雄性毛白杨组培幼化方法，包括以下步骤：1)取雄性毛白杨成年优树的根萌条茎段为外植体；所述根萌条茎段长度为1～2cm，所述根萌条茎段带1～2个芽；2)将步骤1)所述根萌条茎段接种至MS培养基进行基础培养获得生长良好的无菌苗；3)将步骤2)所述无菌苗剪成1.0～1.5cm大小的带芽茎段，接种至增殖培养基中进行2～4代继代培养，获得无菌壮苗；所述无菌壮苗的高度为2～4cm；4)将步骤3)中所述无菌壮苗接种在生根培养基中进行生根培养，获得无菌育成苗；所述生根培养时间为7～14d；5)将步骤4)中所述无菌育成苗进行炼苗培养，获得幼化的育成苗，完成成年雄性毛白杨的组培幼化；所述炼苗培养时间为14～28d；所述雄性毛白杨成年优树的树龄为30～200年。

优选的，步骤1)中所述根萌条采用当年生根萌条。

优选的，步骤2)中所述培养的时间为20～40d。

优选的，所述增殖培养基为包括6-BA和NAA的MS培养基；所述6-BA浓度为0.1～1.5mg/L；所述NAA浓度为0.01～0.15mg/L。

优选的，所述继代培养过程中每代继代培养的时间为30～65d。

优选的：所述生根培养基为包括NAA的1/2MS培养基；所述NAA的浓度为0.001～0.100mg/L。

优选的，步骤1)至步骤5)中所需的光照条件独立为：光照时间12～14h/d，光照强度2000～2500lx。

优选的，所述炼苗培养的湿度为60％～80％。

优选的步骤4)所述获得的无菌育成苗的根系长度为1～5cm。

优选的，所述雄性毛白杨成年优树的树龄为200年。

本发明的有益效果是：本发明通过多次继代培养，实现成年雄性毛白杨的幼化，增殖系数由最初1代的0.93增至4代的4.85，茎高生长量≥3cm苗的数量比例也由最初1代的2.23％显著增至4代的63.45％，幼化效果明显。本发明采用组织培养方式实现对成年优树雄性毛白杨的幼化繁殖，既保留了成年优树稳定的性状，又可以将200年生的树木，继代幼化到同30年生树木一样的生长力，从而达到了选优和幼化双重目的。并且该方法不受季节及生长时间限制，可以高效诱导雄性毛白杨再生，在短期内可获得大量苗木，便于无性系的扩大繁殖。此外，本发明利用幼化的成年优树无菌壮苗既能进行大量繁殖造林，又可避免母株年龄带来的成熟效应，苗木质量差等问题，同时保持母树性状的优良性，对于生产实践具有重要的指导意义，从源头上保证雄性毛白杨苗木的质量。

附图说明

图1为200年生成年优树雄性毛白杨组培无性系继代培养周期变化情况；

图2为200年生成年优树雄性毛白杨组培无性系继代培养各代的瓶苗增殖情况。

具体实施方式

本发明提供了一种成年雄性毛白杨组培幼化方法，包括以下步骤：1)取雄性毛白杨成年优树的根萌条茎段为外植体；所述根萌条茎段长度为1～2cm，所述根萌条茎段带1～2个芽；2)将步骤1)所述根萌条茎段接种至MS培养基进行基础培养获得生长良好的无菌苗；3)将步骤2)所述无菌苗剪成1.0～1.5cm大小的带芽茎段，接种至增殖培养基中进行2～4代继代培养，获得无菌壮苗；所述无菌壮苗的高度为2～4cm；4)将步骤3)中所述无菌壮苗接种在生根培养基中进行生根培养，获得无菌育成苗；所述生根培养时间为7～14d；5)将步骤4)中所述无菌育成苗进行炼苗培养，获得幼化的育成苗，完成成年雄性毛白杨的组培幼化；所述炼苗培养时间为14～28d；所述雄性毛白杨成年优树的树龄为30～200年。

在本发明中，所涉及的所有培养过程均按照如下培养条件进行：所述培养温度优选为23～27℃，更优选的为25℃；所述培养光照时间优选为12～14h/d；所述培养光照强度优选为2000～2500lx，更优选为2300。

在本发明中，取雄性毛白杨成年优树的根萌条茎段为外植体；所述根萌条茎段长度为1～2cm，所述根萌条茎段带1～2个芽。

本发明中，所述雄性毛白杨成年树龄优选为30～200年，更优选为200年；优树的评价标准为雄性毛白杨的生长状况，通过树高、胸径、通直度、尖削度、冠形、树皮特征及是否具有病虫害等方面对其进行评价。选出生长较快，生长势旺的不飞絮，未早衰及园林绿化效果佳优株；优选的同一区域选择1～2棵，以避免优树选择的重复性。

本申请中，所述根萌条的处理方法包括以下步骤：a)采集当年生根萌条，根萌条为半木质化枝条，随采随用；b)去掉根萌条顶部和底部不饱满芽，保留中段根萌条；c)对中段根萌条进行分剪、冲洗；d)移至操作台中进行灭菌消毒；e)最后剪切成1～2cm根萌条茎段备用；所述步骤a)中根萌条采集时间优选为春季；步骤c)中根萌条的分剪长度优选为3～5cm，更优选为4cm；步骤d)中根萌条灭菌的消毒剂优选为次氯酸钠、升汞或酒精，更优选为体积浓度为10％的次氯酸钠或体积浓度为0.1％的升汞；当用体积浓度为10％的次氯酸钠灭菌时，采用次氯酸钠浸泡根萌条，所述浸泡的时间优选为10～20min，更优选15min；当用体积浓度为0.1％的升汞的灭菌时，采用升汞浸泡根萌条，所述浸泡的时间优选为3～10min，更优选为7min。

在本申请中，将步骤1)所述根萌条茎段接种至MS培养基进行基础培养获得生长良好的无菌苗；所述基础培养时间优选为20～40d，更优选为30d；所述培养器皿优选为广口瓶；所述根萌条茎段每瓶接种个数优选为1～3个；本申请中，对基础培养的培养湿度没有特殊限制。

本发明在获得无菌苗后，将所述无菌苗剪成1.0～1.5cm大小的带芽茎段，接种至增殖培养基中进行2～4代继代培养，获得无菌壮苗。本发明中，所述无菌壮苗的高度优选为2～4cm，更优选为3cm；所述增殖培养基优选为包括6-BA和NAA的MS培养基；所述6-BA浓度优选为0.1～1.5mg/L，更优选为0.7mg/L；所述NAA浓度优选为0.01～0.15mg/L，更优选为0.01mg/L；

本发明中，当无菌苗转入增殖培养基后，移入增殖培养基上的无性系记为1代，持续观察各代无性系生长情况，当生长势递增并出现峰值，且峰值持续，此时无性系即为无菌壮苗，可对其进行扩繁和生产；所述无性系生长情况包括：取大于1.0cm的可接芽作为有效芽计算增殖系数，分别记录瓶苗高度≥3cm和≤3cm的数量以及观察增殖培养无性系瓶苗的茎高生长量。本发明中，所述继代培养过程中每代继代培养的时间优选为30～65d，并且继代培养时间随代数的提高逐渐缩短；所述无菌壮苗继代培养代数优选为4代；所述生长势递增并出现峰值的无性系增殖系数优选范围为3.77～4.85，茎高≥3cm苗的百分比优选范围为33.33％～62.34％。

本发明在获得无菌壮苗后，将所述无菌壮苗接种在生根培养基中进行生根培养，获得无菌育成苗；所述生根培养时间为7～14d，更优选为10d。本发明中，所述生根培养基优选为包括NAA的1/2MS培养基；所述NAA的浓度优选为0.001～0.100mg/L，更优选为0.01mg/L。

本发明在获得无菌育成苗后，将所述无菌育成苗进行炼苗培养，获得幼化的育成苗，完成成年雄性毛白杨的组培幼化；所述炼苗培养时间为14～28d，更优选为21d；所述炼苗培养的培养湿度优选为60％～80％，更优选为75％；所述获得的无菌育成苗的根系长度优选为1～5cm，更优选为5cm；所述炼苗培养采用的培养基优选为无菌土；所述炼苗培养的培养环境优选为温室培养。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的成年雄性毛白杨组培幼化方法进行详细的描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1一种成年雄性毛白杨组培幼化方法，包括以下步骤：

1)采集北京地区30年生的雄性毛白杨成年优树当年生的根萌条，根萌条需木质化程度适中(半木质化)，去掉根萌条顶部和底部不饱满芽，取中段根萌条分剪为3cm后用自来水进行冲洗，冲洗干净后的根萌条移至操作台，采用10％次氯酸钠浸泡灭菌10min，然后，将消毒后的根萌条剪切成2cm小段，根萌条茎段带1个芽，得到外植体；

2)将外植体接种至MS培养基进行基础培养，培养条件如下：培养温度为23℃，光照时间为12h/d，培养光照强度为2000lx；培养的时间为20d，经上述培养获得生长良好的无菌苗；

3)将无菌苗剪成1.0cm大小的带芽茎段，接种至包括0.7mg/L6-BA和0.01mg/LNAA的MS培养基中进行3代继代培养，第1代培养60d后转接第2代，第2代培养60d后转接第3代，再经第3代培养55d后获得无菌壮苗，除培养时间外，其他培养条件参照基础培养的培养条件；

4)选取3cm高的无菌壮苗接种在包括0.01mg/LNAA的1/2MS培养基中进行生根培养，培养10d，获得无菌育成苗，其他培养条件参照基础培养的培养条件；

5)选取根系长度为4cm的无菌育成苗，进行组培室开盖炼苗，不直接打开，仅松开即可，使其适应外界的湿度和光照，于24℃的条件下培养5天后，进行移栽处理，移栽苗培养湿度为75％，其他培养条件参照基础培养的培养条件，培养15d，获得幼化的育成苗，完成成年雄性毛白杨的组培幼化。

实施例2一种成年雄性毛白杨组培幼化方法，包括以下步骤：

1)采集北京大兴区前辛房村的200年生的雄性毛白杨为对象，取其当年生的根萌条作为繁殖体，根萌条需木质化程度适中(半木质化)，去掉根萌条顶部和底部不饱满芽，取中段根萌条分剪为4cm后用自来水进行冲洗，冲洗干净后的根萌条移至操作台，采用0.1％升汞溶液浸泡灭菌7min，然后，将消毒后的根萌条剪切成2cm小段，根萌条茎段带2个芽，得到外植体；

2)将外植体接种至MS培养基进行基础培养，培养条件如下：培养温度为25℃，光照时间为13h/d，培养光照强度为2200lx；培养的时间为30d，经上述培养获得生长良好的无菌苗；

3)将无菌苗剪成1.5cm大小的带芽茎段，接种至包括0.7mg/L6-BA和0.01mg/LNAA的MS培养基中进行4代继代培养，第1代培养63d后转接第2代，第2代培养60d后转接第3代，第3代培养57d后转接第4代，第4代培养44d获得无菌壮苗，除培养时间外，其他培养条件参照基础培养的培养条件；

4)选取3cm高的无菌壮苗接种在包括0.01mg/LNAA的1/2MS培养基中进行生根培养，培养10d，获得无菌育成苗，其他培养条件参照基础培养的培养条件；

5)选取根系长度为5cm的无菌育成苗，进行组培室开盖炼苗，不直接打开，仅松开即可，使其适应外界的湿度和光照，于25℃的条件下培养4d后，进行移栽处理，移栽苗培养湿度为75％，其他培养条件参照基础培养的培养条件，培养14～28d，获得幼化的育成苗，完成成年雄性毛白杨的组培幼化。

实施例3 200年生雄性毛白杨组培无性系继代培养周期及生长情况

在实施例2中，当芽转入增殖培养基后，移入增殖培养基上的无性系记为1代，持续观察各代无性系生长情况，继代培养阶段大于1.0cm的可接芽作为有效芽计算增殖系数，并记录瓶苗高度≥3cm和≤3cm的数量以及观察增殖培养无性系瓶苗的茎高生长量，当其生长稳定时，可视之为一个继代周期。

由附图1可知：随着继代次数的增加，继代周期由第1代的63d，逐渐缩短至第4代的44d，生长周期缩短了19d，说明其生长有加快的趋势。可见，根萌条虽然是一株树上发育最年轻的部位，但是由于其母本的年龄较高，也会表现出一定的成熟性，初期生长势较弱。随着继代次数的增加，生长周期缩短，表明通过组培多次继代能够起到一定的幼化作用。

从表1可看出，200年生雄性毛白杨在继代过程中，随着继代次数增加，增殖系数由1代的0.93提升至4代的4.85，茎高生长量≤3cm苗的数量各代间差异不显著，但在茎高生长量≥3cm苗的数量上，4代的3.06显著高于3代的1.48，而3代又显著高于1、2代，从茎高生长量≥3cm苗的数量百分比上也可以看出4代的62.34％显著高于其他各代的生长量所占的百分数，说明多次继代能使成年毛白杨发生幼化，繁殖系数逐渐增高，生长良好，幼化效果明显(如附图2)。

表1 200年生雄性毛白杨不同继代次数芽增殖系数及有效增殖苗数量

注：表中数据为平均值±标准差；同列不同小写字母表示不同处理之间在0.05水平存在显著差异(n＝3)；下同。

实施例4 200年生雄性毛白杨组培无性系各代的生长情况30年生雄性毛白杨1代生长情况对比结果

将实施例2中200年生的雄性毛白杨组培无性系各代的生长情况与实施例中30年生的雄性毛白杨1代的生长情况进行对比，对比结果见表2。

表2200年生雄性毛白杨组培无性系各代的生长情况30年生雄性毛白杨1代生长情况对比

从表2可看出，200年生雄性毛白杨增殖系数及茎高生长量随着继代次数增加差异显著性增加，增殖系数由0.93提升至3.77，茎高生长量≥3cm苗的数量百分比也从2.23％增至38.3％；并且说明其在一定程度上发生了幼化，且效果明显。经比较发现，当繁育到第3代时，其增殖系数可以达到30年生继代1代的水平，也就是说200年生雄性毛白杨可以通过本发明的方法幼化到30年生雄性毛白杨的生长力情况。

由上述实施例可知，本发明提供的成年雄性毛白杨组培幼化方法采用雄性毛白杨成年优树的根萌条作为繁殖体，随着继代次数的增加，生长周期缩短，增值系数增加，苗高生长量≥3cm苗的数量百分比也有所提高，各代间差异性显著增高，生长趋势明显加快，幼化效果显著。因此，本发明能够实现成年雄性毛白杨的幼化和高效繁殖。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种成年雄性毛白杨组培幼化方法，包括以下步骤：

1)取雄性毛白杨成年优树的根萌条茎段为外植体；所述根萌条茎段长度为1～2cm，所述根萌条茎段带1～2个芽；

2)将步骤1)所述根萌条茎段接种至MS培养基进行基础培养获得生长良好的无菌苗；

3)将步骤2)所述无菌苗剪为长度1.0～1.5cm的带芽茎段，接种所述带芽茎段至增殖培养基中进行2～4代继代培养，获得无菌壮苗；所述无菌壮苗的高度为2～4cm；

4)将步骤3)中所述无菌壮苗接种在生根培养基中进行生根培养，获得无菌育成苗；所述生根培养时间为7～14d；

5)将步骤4)中所述无菌育成苗进行炼苗培养，获得幼化的育成苗，完成雄性毛白杨的组培幼化；所述炼苗培养时间为14～28d；

所述雄性毛白杨成年优树的树龄为30～200年。

2.根据权利要求1所述的雄性毛白杨组培幼化方法，其特征在于，步骤1)中所述根萌条采用当年生根萌条。

3.根据权利要求1所述的成年雄性毛白杨组培幼化方法，其特征在于，步骤2)中所述基础培养的时间为20～40d。

4.根据权利要求1所述的成年雄性毛白杨组培幼化方法，其特征在于，所述增殖培养基为包括6-BA和NAA的MS培养基；所述增殖培养基中6-BA的浓度为0.1～1.5mg/L；所述增殖培养基中NAA的浓度为0.01～0.15mg/L。

5.根据权利要求1所述的成年雄性毛白杨组培幼化方法，其特征在于，所述继代培养过程中每代继代培养的时间为40～65d。

6.根据权利要求1所述的成年雄性毛白杨组培幼化方法，其特征在于：所述生根培养基为包括NAA的1/2MS培养基；所述生根培养基中NAA的浓度为0.001～0.100mg/L。

7.根据权利要求1所述的成年雄性毛白杨组培幼化方法，其特征在于，步骤1)至步骤5)中所需的光照条件独立为：光照时间12～14h/d，光照强度2000～2500lx。

8.根据权利要求1所述的成年雄性毛白杨组培优化方法，其特征在于，所述炼苗培养的湿度为60％～80％。

9.根据权利要求1或8所述的成年雄性毛白杨组培优化方法，其特征在于，步骤4)所述获得的无菌育成苗的根系长度为1～5cm。

10.根据权利要求1所述的成年雄性毛白杨组培优化方法，其特征在于，所述雄性毛白杨成年优树的树龄为200年。