CN104115752B - 一种中山杉品种118的组织培养繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中山杉品种118的组织培养繁殖方法，该方法包括以下步骤：(1)外植体选取及消毒的过程；(2)将1/2MS培养基进行改良；(3)将处理后的外植体切割并进行茎段初代诱导培养，高压静电场HVEF处理；(4)将步骤(3)中所得不定芽进行继代增殖培养；(5)将步骤(4)中所得无根试管苗进行生根诱导培养；(6)对步骤(5)中得到的无菌苗进行驯化炼苗并移栽。采用该发明的组织培养繁殖方法对中山杉118进行育苗，育苗时间短，且增殖率为89-92倍，生根率为90％，平均生根数为4.0-4.1条，炼苗成活率达到95％，能够高效的得到中山杉118种苗，很大程度满足了市场对中山杉118种苗的需求。
Description
技术领域
本发明涉及一种中山杉品种118(Taxodiumhybrids‘zhongshansha118’)的组织培养的繁殖方法，属于木本植物种苗繁殖的技术领域。
背景技术
中山杉(Taxodiumhybrids‘zhongshansha’)为杉科(Taxodiaceae)落羽杉属(Taxodium)。中山杉为半常绿高大乔木，树体高大雄伟，树型优美，是落羽杉(T.distichum)、池杉(T.ascendens)、墨西哥落羽杉(T.mucronatum)三个树种的优良种间杂交种，由江苏省中国科学院植物研究所多年选育而成。中山杉具有生长速度快，耐水湿，耐盐碱，病虫害少，抗风性强等优点，因此是优良的滩涂盐碱地的绿化树种。
由于中山杉的树干纹理直，结构细致，材质轻柔，耐腐防蛀，因此广泛用于建筑，桥梁，造船，家具等方面，所以杉树在中国的建材市场占据广阔的市场。
通过对中山杉302(♀)与墨西哥落羽杉()回交一代苗期生长的筛选，选出了具有潜在推广价值的新无性系：BCF1118。同时通过外部形态，同工酶和RAPD这3种方法对杂交后代进行杂交鉴定，确定他们是中山杉302与墨西哥落羽杉的杂交种。BCF1118无性系的株高和地径的生长量大于母本中山302，同时具有耐盐碱特性，是优良的无性系，作为速生用材树种潜力更大。2004年“中山杉118”通过江苏省林业局林木新品种审定委员会认定，目前已分别在江苏和浙江建立中山杉良种苗木生产基地，得到了林业园林和公路等绿化部门的广泛关注。
目前，绝大多数杉科树种以种子繁殖和扦插育苗为主，但往往面临种子缺乏，发芽率偏低等困难，而且实生苗变异大，母株优良性状得不到保持；扦插生根情况不稳定，早期造林成活率低。
中山杉118是落羽杉属BCF1代杂交种，如果采用种子播种繁殖，后代植株表型易产生分离，导致中山杉118的优良性状无法保存；扦插繁殖需要中山杉118提供大量的插条，因此繁殖材料受到极大的限制；嫁接繁殖需要大量砧木且技术要求高，人工成本高。利用组织培养方法培养繁育中山杉118幼苗，仅需要少量的带芽茎段为外植体，其优点扩繁速度快，成本低，能够在短时间内提供大量优质的幼苗。发明专利CN102283126B公开了中山杉302(中山杉118的母本)组织培养增殖方法，但是由于中山杉118是落羽杉属F2代杂交种与中山杉302的基因型及植株的代谢产物存在不同，因此不能通过简单地照搬用于中山杉118。
针对以上的现状，本发明提供了一种中山杉118的组织培养繁殖方法，其操作简单易行，大大提高了增殖率和增殖速度，从而获得优质的中山杉种苗，从而解决了中山杉118在城市园林绿化，公路绿化，生态建设等方面的需求。
发明内容
本发明的目的在于解决中山杉118种苗的来源，并提供一种繁殖速度快，种苗优质的中山杉118组织培养繁殖方法。
为达到上述目的，本发明提供了一种中山杉118组织培养的繁殖方法，具体步骤如下所述：
(1)外植体选取与消毒：选取春季中山杉118带有腋芽刚萌动的枝条作为外植体，用自来水冲洗枝条，以去除枝条表面的污垢，然后去除多余的叶片，并进行消毒：①用中性洗衣粉洗涤，再流水冲洗2h，滤纸吸干表面水分；②在超净工作台上先用70％酒精浸泡20～30s，无菌水冲洗3次，每次振荡3～5min；③立即转入1‰的升汞溶液中消毒7-10min，最后用无菌水洗涤3～5次，每次振荡3～5min。
(2)改良1/2MS培养基的制备：用Ca(NO3)2.4H2O228mg/L代替原1/2MS培养基中的CaCl2.2H2O，用K2SO4730mg/L代替原1/2MS培养基中的KNO3，同时加入活性炭，浓度为：1500mg/L，其他组分均无变化。
(3)不定芽的诱导：取步骤(1)中消毒后的外植体，切割成0.6-0.8cm长的茎段，每个茎段至少带一腋芽，接种于诱导培养基，进行不定芽的诱导，培养温度为23±3℃，首先暗培养24h，然后光照培养20-25天(光照时间为14小时/天，光照强度为1500-2000lx)，湿度为50％～65％。不定芽诱导培养基为改良的1/2MS培养基，添加的激素剂量为：所述改良1/2MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L+KT300.8mg/L。
(4)高压静电场HVEF处理，利用高压静电场仪器，进行静电场处理，强度为15KV/cm，时间25分钟；
(5)继代增殖：将经高压静电场处理的不定芽接入继代增殖培养基，进行继代培养25-30天，培养温度为23±3℃，光照时间为14小时/天，光照强度为1500-2000lx，湿度为50％～65％。继代增殖培养基为改良的1/2MS培养基，添加的激素剂量为：所述改良1/2MS+6-BA4.0mg/L+IBA0.5mg/L+ZT0.3mg/L+GA30.5mg/L；
(6)生根培养：将步骤(5)获得的中山杉无根试管苗进行切繁(每株均有一个不定芽)，接入生根培养基中进行生根培养15-20天，培养温度为23±3℃，光照时间为14小时/天，光照强度为1500-2000lx；所述的生根培养基为改良1/2MS培养基并添加激素NAA和IBA：改良1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L。
(7)无菌苗的炼苗：将步骤(6)产生的中山杉118带根无菌苗的培养瓶瓶盖打开，室内培养5-7天，然后移入采用多菌灵消毒的基质中，组培苗上方使用带孔PVC膜覆盖保湿，炼苗容器采用50孔的穴盘，放在通风阴凉处培养25-30天，培养到第15天将PVC膜移除，换用遮光率75％-80％的遮阳网；所述的基质成分为体积比2∶1∶1的泥炭土、蛭石、珍珠岩。
根长1-2cm、苗高3-4cm的组培苗经室内炼苗7天后移栽，成活率达95％。
上述诱导培养基，继代增殖培养基，生根培养基中菌含有琼脂7.0-8.0g/L，蔗糖30g/L，PH值为：5.8-6.0。
本发明中山杉118组织培养的繁殖方法具有以下优点：
1.选取外植体时间
木本植物外植体本身的生理状况、休眠深度与植株再生能力是密切相关的。根据我们的试验，选取春季中山杉118带有刚萌动的腋芽枝条作为外植体利于腋芽的萌动，比其他时间容易得到成活率较高的外植体。
2、MS改良
在原MS培养基上培养时，外植体不定芽不易分化出枝梢，外植体上只爆芽而不伸长，将MS培养基改良后，改变了NPK比例，用Ca(NO3)2.4H2O代替原MS培养基中的CaCl2.2H2O，用K2SO4730mg/L代替原1/2MS培养基中的KNO3，另外添加活性炭1500mg/L能够显著促进不定芽的分化及生长(见表1)，其中改良WPM为按照CN201110200456，中山杉302培养的方法进行改良(用Ca(NO3)2.4H2O684mg/L和KNO3380mg/L代替原WPM培养基中的K2SO4和CaCl2.2H2O)
表1基本培养基的筛选
3不定芽诱导生长周期中因受损伤、营养状况、环境因子的限制和影响呈S型生长曲线，但是静电场的处理影响了膜的通透性及其它极性分子的运动，改善了细胞的吸收和转运物质能力，从而能够促进组织的生长，使得继代延迟期缩短，很快进入对数生长期。利用静电场处理，不同的强度和时间组合会产生不同的效果，如果处理电场强度过大，或处理时间过长，会使得植物细胞受到伤害甚至死亡，而电场强度过小或时间过短，又会造成处理效果不明显，本申请发明人经过大量实验得出对中山杉118采用强度为15KV/cm，时间25分钟的静电场处理可以显著改善生长状况，鲜重增加明显，单因子实验表明，生长速度增加34.3％，大大促进了细胞的分裂和生长，缩短了离体培养的时间。
4.一直以来对于如何利用植物组织培养，分化，再生植株，提高植物的繁殖数量是组织培养研究工作者的研究重点，同时也是技术难点，其中激素的类别及浓度的使用更是培养基的重要组成部分。我们通过大量的试验，筛选出中山杉118培养基类型：
即诱导培养基为：改良1/2MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L+KT300.8mg/L；
继代增殖培养基为：改良1/2MS+6-BA4.0mg/L+IBA0.5mg/L+ZT0.3mg/L+GA30.5mg/L；
生根培养基为：改良1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L。
使用其培养基及特定激素水平能够提高外植体的萌发率、诱导率
采用本发明的组织培养繁殖方法，最终增殖率为89-92倍；其中采用继代增殖培养基，增殖倍数为8倍；采用诱导培养基，不定芽诱导率为94％，采用生根培养基，生根率为90％，平均生根数为4条；炼苗成活率达到95％。
5.由于中山杉118外植体诱导的愈伤底部有褐化的现象，影响不定芽的再生。因此在试验当中我们在1/2MS培养基，添加适量的活性炭，用来吸附植株分泌的有害次级代谢产物，使植物保持旺盛的生长活力，一定程度的起到了遏制植株褐化的作用(见表2)。
表2生根基本培养基的筛选
具体实施方式
实施例1
(1)2012年4月30日，选取春季中山杉118带有腋芽刚萌动的枝条作为外植体，用自来水冲洗枝条，去除枝条表面的污垢，然后去除多余的叶片，并进行消毒：①用中性洗衣粉洗涤，再流水冲洗2h，滤纸吸干表面水分；②在超净工作台上先用70％酒精浸泡20～30s，无菌水冲洗3次，每次振荡3～5min；③立即转入1‰的升汞溶液中消毒7-10min，最后用无菌水洗涤3～5次，每次振荡3～5min。
(2)改良1/2MS培养基的制备：用Ca(NO3)2.4H2O228mg/L代替原1/2MS培养基中的CaCl2.2H2O，用K2SO4730mg/L代替原1/2MS培养基中的KNO3，同时加入活性炭，浓度为：1500mg/L，其他组分均无变化。
(3)不定芽的诱导：取步骤(1)中消毒后的外植体，切割成0.6cm长的茎段，每个茎段至少带一腋芽，接种于诱导培养基，进行不定芽的诱导，培养温度为23±3℃，首先暗培养24h，然后光照培养22天(光照时间为14小时/天，光照强度为1500-2000lx)，湿度为65％。不定芽诱导培养基为改良的1/2MS培养基，添加的激素剂量为：所述改良1/2MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L+KT300.8mg/L。
(4)高压静电场HVEF处理，利用高压静电场仪器，进行静电场处理，强度为15KV/cm，时间25分钟；
(5)继代增殖：将经高压静电场处理的不定芽接入继代增殖培养基，进行继代培养25天，培养温度为23±3℃，光照时间为14小时/天，光照强度为1500-2000lx，湿度为65％。继代增殖培养基为改良的1/2MS培养基，添加的激素剂量为：所述改良1/2MS+6-BA4.0mg/L+IBA0.5mg/L+ZT0.3mg/L+GA30.5mg/L；
(6)生根培养：将步骤(5)获得的中山杉无根试管苗进行切繁(每株均有一个不定芽)，接入生根培养基中进行生根培养18天，培养温度为23±3℃，光照时间为14小时/天，光照强度为1500-2000lx；所述的生根培养基为改良1/2MS培养基并添加激素NAA和IBA：改良1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L。
(7)无菌苗的炼苗：将步骤(6)产生的中山杉118带根无菌苗的培养瓶瓶盖打开，室内培养5-7天，然后移入采用多菌灵消毒的基质中，组培苗上方使用带孔PVC膜覆盖保湿，炼苗容器采用50孔的穴盘，放在通风阴凉处培养25-30天，培养到第15天将PVC膜移除，换用遮光率75％的遮阳网；所述的基质成分为体积比2∶1∶1的泥炭土、蛭石、珍珠岩。
根长1-2cm、苗高3-4cm的组培苗经室内炼苗7天后移栽，成活率达95％。
上述诱导培养基，继代增殖培养基，生根培养基中菌含有琼脂7.0g/L，蔗糖30g/L，PH值为：5.8。
采用上述方法进行中山杉118的组织培养繁殖，成功获得含根组培种苗，增殖倍数为：89倍；不定芽诱导率为：94％；生根率为：90％，平均生根数为：4.0条；炼苗成活率达到95％，因此通过此方法能够高效快速的得到中山杉118的种苗，从而解决了中山杉118的市场需求。
实施例2
(1)2013年4月26日，选取春季中山杉118带有腋芽刚萌动的枝条作为外植体，用自来水冲洗枝条，去除枝条表面的污垢，然后去除多余的叶片，并进行消毒：①用中性洗衣粉洗涤，再流水冲洗2h，滤纸吸干表面水分；②在超净工作台上先用70％酒精浸泡20～30s，无菌水冲洗3次，每次振荡3～5min；③立即转入1‰的升汞溶液中消毒7-10min，最后用无菌水洗涤3～5次，每次振荡3～5min。
(2)改良1/2MS培养基的制备：用Ca(NO3)2.4H2O228mg/L代替原1/2MS培养基中的CaCl2.2H2O，用K2SO4730mg/L代替原1/2MS培养基中的KNO3，同时加入活性炭，浓度为：1500mg/L，其他组分均无变化。
(3)不定芽的诱导：取步骤(1)中消毒后的外植体，切割成0.8cm长的茎段，每个茎段至少带一腋芽，接种于诱导培养基，进行不定芽的诱导，培养温度为23±3℃，首先暗培养24h，然后光照培养25天(光照时间为14小时/天，光照强度为1500-2000lx)，湿度为50％。不定芽诱导培养基为改良的1/2MS培养基，添加的激素剂量为：所述改良1/2MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L+KT300.8mg/L。
(4)高压静电场HVEF处理，利用高压静电场仪器，进行静电场处理，强度为15KV/cm，时间25分钟；
(5)继代增殖：将经高压静电场处理的不定芽接入继代增殖培养基，进行继代培养30天，培养温度为23±3℃，光照时间为14小时/天，光照强度为1500-2000lx，湿度为50％。继代增殖培养基为改良的1/2MS培养基，添加的激素剂量为：所述改良1/2MS+6-BA4.0mg/L+IBA0.5mg/L+ZT0.3mg/L+GA30.5mg/L；
(6)生根培养：将步骤(5)获得的中山杉无根试管苗进行切繁(每株均有一个不定芽)，接入生根培养基中进行生根培养20天，培养温度为23±3℃，光照时间为14小时/天，光照强度为1500-2000lx；所述的生根培养基为改良1/2MS培养基并添加激素NAA和IBA：改良1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L。
(7)无菌苗的炼苗：将步骤(6)产生的中山杉118带根无菌苗的培养瓶瓶盖打开，室内培养5-7天，然后移入采用多菌灵消毒的基质中，组培苗上方使用带孔PVC膜覆盖保湿，炼苗容器采用50孔的穴盘，放在通风阴凉处培养25-30天，培养到第15天将PVC膜移除，换用遮光率75％的遮阳网；所述的基质成分为体积比2∶1∶1的泥炭土、蛭石、珍珠岩。
根长1-2cm、苗高3-4cm的组培苗经室内炼苗7天后移栽，成活率达95％。
上述诱导培养基，继代增殖培养基，生根培养基中菌含有琼脂8.0g/L，蔗糖30g/L，PH值为：5.8。
采用上述方法进行中山杉118的组织培养繁殖，成功获得含根组培种苗，增殖倍数为：92倍；不定芽诱导率为：94％；生根率为：90％，平均生根数为：4.1条；炼苗成活率达到95％，因此通过此方法能够高效快速的得到中山杉118的种苗，从而解决了中山杉118的市场需求。
以上虽然已以较佳实施例公开了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采用等同替换或者等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种中山杉品种118组织培养的繁殖方法，其特征在于所述繁殖方法包括如下步骤：
(1)外植体选取与消毒：选取春季中山杉118带有腋芽的枝条作为外植体，进行消毒处理；
(2)改良1/2MS培养基的制备：用Ca(NO3)2·4H2O228mg/L代替原1/2MS培养基中的CaCl2·2H2O，用K2SO4730mg/L代替原1/2MS培养基中的KNO3，同时加入活性炭，浓度为：1500mg/L，其他组分均无变化；
(3)不定芽的诱导：取步骤(1)中消毒后的外植体，切割成0.6-0.8cm长的茎段，每个茎段至少带一腋芽，接种于诱导培养基，进行不定芽的诱导，培养温度为23±3℃，首先暗培养24h，然后光照培养20-25天，光照时间为14小时/天，光照强度为1500-2000lx，湿度为50％～65％；其中，不定芽诱导培养基为：所述改良1/2MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L+KT300.8mg/L；
(4)高压静电场HVEF处理：利用高压静电场仪器，进行静电场处理，强度为15KV/cm，时间25分钟；
(5)继代增殖：将经高压静电场处理的不定芽接入继代增殖培养基，进行继代培养25-30天，培养温度为23±3℃，光照时间为14小时/天，光照强度为1500-2000lx，湿度为50％～65％；所述继代增殖培养基为：所述改良1/2MS+6-BA4.0mg/L+IBA0.5mg/L+ZT0.3mg/L+GA30.5mg/L；
(6)生根培养：接入生根培养基中进行生根培养15-20天，培养温度为23±3℃，光照时间为14小时/天，光照强度为1500-2000lx；其中，生根培养基为：所述改良1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L；
(7)无菌苗的炼苗：将步骤(6)产生的中山杉118带根无菌苗的培养瓶瓶盖打开，室内培养5-7天，然后移入采用多菌灵消毒的基质中；所述基质由体积比为2∶1∶1的泥炭土、蛭石以及珍珠岩组成。
2.根据权利要求1所述中山杉品种118组织培养的繁殖方法，其特征在于：所述步骤(1)中外植体的消毒过程：①用中性洗衣粉洗涤，再流水冲洗2h，滤纸吸干表面水分；②在超净工作台上先用70％酒精浸泡20～30s，无菌水冲洗3次，每次振荡3～5min；③立即转入1‰的升汞溶液中消毒7-10min，最后用无菌水洗涤3～5次，每次振荡3～5min。
3.根据权利要求1所述中山杉品种118组织培养的繁殖方法，其特征在于：所述诱导培养基、继代增殖培养基、生根培养基中均含有琼脂7g/L、蔗糖30g/L，且pH值为5.8。
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