CN104126492B - 一种中山杉品种136的离体繁殖方法 - Google Patents

一种中山杉品种136的离体繁殖方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种中山杉品种136的离体繁殖方法，该方法包括以下步骤：(1)外植体选取及消毒的过程；(2)将1/2MS培养基进行改良；(3)将处理后的外植体切割并进行茎段初代诱导培养，高压静电场HVEF处理；(4)将步骤(3)中所得不定芽进行继代增殖培养；(5)将步骤(4)中所得无根试管苗进行生根诱导培养；(6)对步骤(5)中得到的无菌苗进行驯化炼苗并移栽。采用该发明的组织培养繁殖方法对中山杉136进行育苗，育苗时间短，且增殖率为88-93倍，生根率为89％，平均生根数为4.1条，炼苗成活率达到95％，能够高效的得到中山杉136种苗，很大程度满足了市场对中山杉136种苗的需求。

Description

一种中山杉品种136的离体繁殖方法
技术领域
本发明涉及一种中山杉品种136(Taxodiumhybrids‘zhongshansha136’)的离体繁殖方法，属于木本植物种苗繁殖的技术领域。
背景技术
中山杉(Taxodiumhybrids‘zhongshansha’)为杉科(Taxodiaceae)落羽杉属(Taxodium)。中山杉为半常绿高大乔木，树体高大雄伟，树型优美，是落羽杉(T.distichum)、池杉(T.ascendens)、墨西哥落羽杉(T.mucronatum)三个树种的优良种间杂交种，由江苏省中国科学院植物研究所多年选育而成。中山杉具有生长速度快，耐水湿，耐盐碱，病虫害少，抗风性强等优点，因此是优良的滩涂盐碱地的绿化树种。
由于中山杉的树干纹理直，结构细致，材质轻柔，耐腐防蛀，因此广泛用于建筑，桥梁，造船，家具等方面，所以杉树在中国的建材市场占据广阔的市场。
20世纪80年代从落羽杉♀×墨西哥落羽杉♂杂交组合中选育出了第1代杂种落羽杉-中山杉302等速生、耐盐碱无性系；90年代又从中山杉302♀×墨西哥落羽杉♂杂交组合中选育出了第2代中山杉136、9、146等无性系。其中中山杉302和136号先后被审(认)定为国家级林木良种。136、146号被江苏省林业局认定为林木良种。9号被国家林业局授权新品种保护权。2004年“中山杉136”通过江苏省林业局林木新品种审定委员会认定，目前已分别在江苏和浙江建立中山杉良种苗木生产基地，得到了林业园林和公路等绿化部门的广泛关注。
中山杉136为中山杉二代无性系中较为突出的品种。一年四季的枝叶颜色比较丰富，呈现绿——红(枝)——黄——红(叶)的颜色变化趋势，并且已经作为本领域的常规技术术语以及常规的试验材料在本领域广泛应用。然而，有关中山杉二代品种，尤其涉及中山杉136的快速繁殖研究，国内外报道较少。目前研究主要集中在扦插繁殖上，而扦插繁殖受母本材料来源的限制很大。母本材料具有大量插穗，是扦插快繁生产的前提条件，这对于杂交选育的木本植物新品种来说，显然是不现实的。因此，通过组培快繁是解决中山杉新优无性系扩繁的首选途径。
中山杉136是中山杉二代杂交种，如果采用种子播种繁殖，后代植株表型易产生分离，导致中山杉136的优良性状无法保存；扦插繁殖需要中山杉136提供大量的插条，因此繁殖材料受到极大的限制；嫁接繁殖需要大量砧木且技术要求高，人工成本高。利用组织培养方法培养繁育中山杉136幼苗，仅需要少量的带芽茎段为外植体，其优点扩繁速度快，成本低，能够在短时间内提供大量优质的幼苗。发明专利CN102283126B公开了中山杉302(中山杉136的母本)组织培养增殖方法，但是由于中山杉136是落羽杉属F2代杂交种与中山杉302的基因型及植株的代谢产物存在不同，因此不能通过简单地照搬用于中山杉136。
针对以上的现状，本发明提供了一种中山杉136的离体繁殖方法，其操作简单易行，大大提高了增殖率和增殖速度，从而获得优质的中山杉种苗，从而解决了中山杉136在城市园林绿化，公路绿化，生态建设等方面的需求。
发明内容
本发明的目的在于解决中山杉136种苗的来源，并提供一种繁殖速度快，种苗优质的中山杉136离体繁殖方法。
为达到上述目的，本发明提供了一种中山杉136的离体繁殖方法，具体步骤如下所述：
(1)外植体选取与消毒：选取春季中山杉136带有腋芽刚萌动的枝条作为外植体，用自来水冲洗枝条，以去除枝条表面的污垢，然后去除多余的叶片，并进行消毒：①用中性洗衣粉洗涤，再流水冲洗2h，滤纸吸干表面水分；②在超净工作台上先用70％酒精浸泡20～30s，无菌水冲洗3次，每次振荡3～5min；③立即转入1‰的升汞溶腋中消毒7-10min，最后用无菌水洗涤3～5次，每次振荡3～5min。
(2)改良1/2MS培养基的制备：用Ca(NO3)2.4H2O260mg/L代替原1/2MS培养基中的CaCl2.2H2O，用K2SO4560mg/L代替原1/2MS培养基中的KNO3，同时加入活性炭，浓度为：1500mg/L，其他组分均无变化。
(3)不定芽的诱导：取步骤(1)中消毒后的外植体，切割成0.6-0.8cm长的茎段，每个茎段至少带一腋芽，接种于诱导培养基，进行不定芽的诱导，培养温度为23±3℃，首先暗培养24h，然后光照培养20-25天(光照时间为14小时/天，光照强度为1500-2000lx)，湿度为50％～65％。不定芽诱导培养基为改良的1/2MS培养基，添加的激素剂量为：所述改良1/2MS+6-BA0.8mg/L+IBA0.3mg/L+GA30.5mg/L。
(4)高压静电场HVEF处理，利用高压静电场仪器，进行静电场处理，强度为15KV/cm，时间30分钟；
(5)继代增殖：将经高压静电场处理的不定芽接入继代增殖培养基，进行继代培养25-30天，培养温度为23±3℃，光照时间为14小时/天，光照强度为1500-2000lx，湿度为50％～65％。继代增殖培养基为改良的1/2MS培养基，添加的激素剂量为：所述改良1/2MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.5mg/L+ZT0.2mg/L+GA30.5mg/L；
(6)生根培养：将步骤(5)获得的中山杉无根试管苗进行切繁(每株均有一个不定芽)，接入生根培养基中进行生根培养15-20天，培养温度为23±3℃，光照时间为14小时/天，光照强度为1500-2000lx；所述的生根培养基为改良1/2MS培养基并添加激素NAA和IBA：改良1/2MS+NAA0.8mg/L+IBA0.3mg/L。
(7)无菌苗的炼苗：将步骤(6)产生的中山杉136带根无菌苗的培养瓶瓶盖打开，室内培养5-7天，然后移入采用多菌灵消毒的基质中，组培苗上方使用带孔PVC膜覆盖保湿，炼苗容器采用50孔的穴盘，放在通风阴凉处培养25-30天，培养到第15天将PVC膜移除，换用遮光率75％-80％的遮阳网；所述的基质成分为体积比2∶1∶1的泥炭土、蛭石、珍珠岩。
根长1-2cm、苗高3-4cm的组培苗经室内炼苗7天后移栽，成活率达95％。
上述诱导培养基，继代增殖培养基，生根培养基中菌含有琼脂7.0-8.0g/L，蔗糖30g/L，PH值为：5.8-6.0。
本发明中山杉136离体繁殖方法具有以下优点：
1.选取外植体时间
木本植物外植体本身的生理状况、休眠深度与植株再生能力是密切相关的。根据我们的试验，选取春季中山杉136带有刚萌动的腋芽枝条作为外植体利于腋芽的萌动，比其他时间容易得到成活率较高的外植体。
2、MS改良
在原MS培养基上培养时，外植体不定芽不易分化出枝梢，外植体上只爆芽而不伸长，将MS培养基改良后，改变了NPK比例，用Ca(NO3)2.4H2O260mg/L代替原1/2MS培养基中的CaCl2.2H2O，用K2SO4560mg/L代替原1/2MS培养基中的KNO3.另外添加活性炭1500mg/L，能够显著促进不定芽的分化及生长(见表1)，其中改良WPM为按照CN201110200456，中山杉品种302培养的方法进行改良(用Ca(NO3)2.4H2O684mg/L和KNO3380mg/L代替原WPM培养基中的K2SO4和CaCl2.2H2O)
表1基本培养基的筛选
3不定芽诱导生长周期中因受损伤、营养状况、环境因子的限制和影响呈S型生长曲线，但是静电场的处理影响了膜的通透性及其它极性分子的运动，改善了细胞的吸收和转运物质能力，从而能够促进组织的生长，使得继代延迟期缩短，很快进入对数生长期。利用静电场处理，不同的强度和时间组合会产生不同的效果，如果处理电场强度过大，或处理时间过长，会使得植物细胞受到伤害甚至死亡，而电场强度过小或时间过短，又会造成处理效果不明显，本申请发明人经过大量实验得出对中山杉136采用强度为15KV/cm，时间30分钟的静电场处理可以显著改善生长状况，鲜重增加明显，单因子实验表明，生长速度增加31.7％，大大促进了细胞的分裂和生长，缩短了离体培养的时间。
4.一直以来对于如何利用植物组织培养，分化，再生植株，提高植物的繁殖数量是组织培养研究工作者的研究重点，同时也是技术难点，其中激素的类别及浓度的使用更是培养基的重要组成部分。我们通过大量的试验，筛选出中山杉136培养基类型：
即诱导培养基为：改良1/2MS+6-BA0.8mg/L+IBA0.3mg/L+GA30.5mg/L；
继代增殖培养基为：改良1/2MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.5mg/L+ZT0.2mg/L+GA30.5mg/L；
生根培养基为：改良1/2MS+NAA0.8mg/L+IBA0.3mg/L。
使用其培养基及特定激素水平能够提高外植体的萌发率、诱导率
采用本发明的组织培养繁殖方法，最终增殖率为88-93倍；其中采用继代增殖培养基，增殖倍数为8-9倍；采用诱导培养基，不定芽诱导率为92％，采用生根培养基，生根率为89％，平均生根数为4.1条；炼苗成活率达到95％。
5.由于中山杉136外植体诱导的愈伤底部有褐化的现象，影响不定芽的再生。因此在试验当中我们在1/2MS培养基，添加适量的活性炭，用来吸附植株分泌的有害次级代谢产物，使植物保持旺盛的生长活力，一定程度的起到了遏制植株褐化的作用(见表2)。
表2生根基本培养基的筛选
具体实施方式
实施例1
(1)2012年4月03日，选取春季中山杉136带有腋芽刚萌动的枝条作为外植体，用自来水冲洗枝条，去除枝条表面的污垢，然后去除多余的叶片，并进行消毒：①用中性洗衣粉洗涤，再流水冲洗2h，滤纸吸干表面水分；②在超净工作台上先用70％酒精浸泡20～30s，无菌水冲洗3次，每次振荡3～5min；③立即转入1‰的升汞溶液中消毒7-10min，最后用无菌水洗涤3～5次，每次振荡3～5min。
(2)改良1/2MS培养基的制备：用Ca(NO3)2.4H2O260mg/L代替原1/2MS培养基中的CaCl2.2H2O，用K2SO4560mg/L代替原1/2MS培养基中的KNO3，同时加入活性炭，浓度为：1500mg/L，其他组分均无变化。
(3)不定芽的诱导：取步骤(1)中消毒后的外植体，切割成0.6cm长的茎段，每个茎段至少带一腋芽，接种于诱导培养基，进行不定芽的诱导，培养温度为23±3℃，首先暗培养24h，然后光照培养22天(光照时间为14小时/天，光照强度为1500-2000lx)，湿度为65％。不定芽诱导培养基为改良的1/2MS培养基，添加的激素剂量为：改良1/2MS+6-BA0.8mg/L+IBA0.3mg/L+GA30.5mg/L。
(4)高压静电场HVEF处理，利用高压静电场仪器，进行静电场处理，强度为15KV/cm，时间30分钟；
(5)继代增殖：将经高压静电场处理的不定芽接入继代增殖培养基，进行继代培养25天，培养温度为23±3℃，光照时间为14小时/天，光照强度为1500-2000lx，湿度为65％。继代增殖培养基为改良的1/2MS培养基，添加的激素剂量为：所述改良1/2MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.5mg/L+ZT0.2mg/L+GA30.5mg/L；
(6)生根培养：将步骤(5)获得的中山杉无根试管苗进行切繁(每株均有一个不定芽)，接入生根培养基中进行生根培养18天，培养温度为23±3℃，光照时间为14小时/天，光照强度为1500-2000lx；所述的生根培养基为改良1/2MS培养基并添加激素NAA和IBA：改良1/2MS+NAA0.8mg/L+IBA0.3mg/L。
(7)无菌苗的炼苗：将步骤(6)产生的中山杉136带根无菌苗的培养瓶瓶盖打开，室内培养5-7天，然后移入采用多菌灵消毒的基质中，组培苗上方使用带孔PVC膜覆盖保湿，炼苗容器采用50孔的穴盘，放在通风阴凉处培养25-30天，培养到第15天将PVC膜移除，换用遮光率75％的遮阳网；所述的基质成分为体积比2∶1∶1的泥炭土、蛭石、珍珠岩。
根长1-2cm、苗高3-4cm的组培苗经室内炼苗7天后移栽，成活率达95％。
上述诱导培养基，继代增殖培养基，生根培养基中菌含有琼脂7.0g/L，蔗糖30g/L，PH值为：5.8。
采用上述方法进行中山杉136的组织培养繁殖，成功获得含根组培种苗，增殖倍数为：88倍；不定芽诱导率为：92％；生根率为：89％，平均生根数为：4.1条；炼苗成活率达到95％，因此通过此方法能够高效快速的得到中山杉136的种苗，从而解决了中山杉136的市场需求。
实施例2
(1)2013年3月27日，选取春季中山杉136带有腋芽刚萌动的枝条作为外植体，用自来水冲洗枝条，去除枝条表面的污垢，然后去除多余的叶片，并进行消毒：①用中性洗衣粉洗涤，再流水冲洗2h，滤纸吸干表面水分；②在超净工作台上先用70％酒精浸泡20～30s，无菌水冲洗3次，每次振荡3～5min；③立即转入1‰的升汞溶液中消毒7-10min，最后用无菌水洗涤3～5次，每次振荡3～5min。
(2)改良1/2MS培养基的制备：用Ca(NO3)2.4H2O260mg/L代替原1/2MS培养基中的CaCl2.2H2O，用K2SO4560mg/L代替原1/2MS培养基中的KNO3，同时加入活性炭，浓度为：1500mg/L，其他组分均无变化。
(3)不定芽的诱导：取步骤(1)中消毒后的外植体，切割成0.8cm长的茎段，每个茎段至少带一腋芽，接种于诱导培养基，进行不定芽的诱导，培养温度为23±3℃，首先暗培养24h，然后光照培养25天(光照时间为14小时/天，光照强度为1500-2000lx)，湿度为65％。不定芽诱导培养基为改良的1/2MS培养基，添加的激素剂量为：所述改良1/2MS+6-BA0.8mg/L+IBA0.3mg/L+GA30.5mg/L。
(4)高压静电场HVEF处理，利用高压静电场仪器，进行静电场处理，强度为15KV/cm，时间30分钟；
(5)继代增殖：将经高压静电场处理的不定芽接入继代增殖培养基，进行继代培养30天，培养温度为23±3℃，光照时间为14小时/天，光照强度为1500-2000lx，湿度为50％。继代增殖培养基为改良的1/2MS培养基，添加的激素剂量为：所述改良1/2MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.5mg/L+ZT0.2mg/L+GA30.5mg/L；
(6)生根培养：将步骤(5)获得的中山杉无根试管苗进行切繁(每株均有一个不定芽)，接入生根培养基中进行生根培养20天，培养温度为23±3℃，光照时间为14小时/天，光照强度为1500-2000lx；所述的生根培养基为改良1/2MS培养基并添加激素NAA和IBA：改良1/2MS+NAA0.8mg/L+IBA0.3mg/L。
(7)无菌苗的炼苗：将步骤(6)产生的中山杉136带根无菌苗的培养瓶瓶盖打开，室内培养5-7天，然后移入采用多菌灵消毒的基质中，组培苗上方使用带孔PVC膜覆盖保湿，炼苗容器采用50孔的穴盘，放在通风阴凉处培养25-30天，培养到第15天将PVC膜移除，换用遮光率75％的遮阳网；所述的基质成分为体积比2∶1∶1的泥炭土、蛭石、珍珠岩。
根长1-2cm、苗高3-4cm的组培苗经室内炼苗7天后移栽，成活率达95％。
上述诱导培养基，继代增殖培养基，生根培养基中菌含有琼脂8.0g/L，蔗糖30g/L，PH值为：5.8。
采用上述方法进行中山杉136的组织培养繁殖，成功获得含根组培种苗，增殖倍数为：93倍；不定芽诱导率为：92％；生根率为：89％，平均生根数为：4.1条；炼苗成活率达到95％，因此通过此方法能够高效快速的得到中山杉136的种苗，从而解决了中山杉136的市场需求。
以上虽然已以较佳实施例公开了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采用等同替换或者等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种中山杉品种136的离体繁殖方法，其包括如下步骤：
(1)外植体选取与消毒：选取春季中山杉136带有腋芽的枝条作为外植体，进行消毒处理；
(2)改良1/2MS培养基的制备：用Ca(NO3)2.4H2O260mg/L代替原1/2MS培养基中的CaCl2.2H2O，用K2SO4560mg/L代替原1/2MS培养基中的KNO3，同时加入活性炭，浓度为：1500mg/L，其他组分均无变化；
(3)不定芽的诱导：取步骤(1)中消毒后的外植体，切割成0.6-0.8cm长的茎段，每个茎段至少带一腋芽，接种于诱导培养基，进行不定芽的诱导，培养温度为23±3℃，首先暗培养24h，然后光照培养20-25天，光照时间为14小时/天，光照强度为1500-2000lx，湿度为50％～65％；其中，不定芽诱导培养基为所述改良1/2MS+6-BA0.8mg/L+IBA0.3mg/L+GA30.5mg/L；
(4)高压静电场HVEF处理：利用高压静电场仪器，进行静电场处理，强度为15KV/cm，时间30分钟；
(5)继代增殖：将经高压静电场处理的不定芽接入继代增殖培养基，进行继代培养25-30天，培养温度为23±3℃，光照时间为14小时/天，光照强度为1500-2000lx，湿度为50％～65％；所述继代增殖培养基为所述改良1/2MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.5mg/L+ZT0.2mg/L+GA30.5mg/L；
(6)生根培养：接入生根培养基中进行生根培养15-20天，培养温度为23±3℃，光照时间为14小时/天，光照强度为1500-2000lx；所述的生根培养基为所述改良1/2MS+NAA0.8mg/L+IBA0.3mg/L；
(7)无菌苗的炼苗：将步骤(6)产生的中山杉136带根无菌苗的培养瓶瓶盖打开，室内培养5-7天，然后移入采用多菌灵消毒的基质中，所述基质由体积比为2∶1∶1的泥炭土、蛭石以及珍珠岩组成。
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