CN102283126A - 一种中山杉品种302的组织培养繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中山杉品种302的组织培养的繁殖方法，该方法包括以下步骤：(1)选取外植体并进行消毒；(2)将原WPM培养基进行改良；(3)将处理后的外植体切割后，进行茎段初代诱导培养；(4)将步骤(3)中所得新梢进行继代增殖培养；(5)将步骤(4)中所得无根试管苗进行生根诱导培养；(6)对步骤(5)中得到的无菌苗进行驯化炼苗培养。采用该繁殖方法对中山杉302进行育苗，增殖率为102-110倍，且育苗时间短。

Description

一种中山杉品种302的组织培养繁殖方法

技术领域

本发明具体涉及一种中山杉品种302(Taxodium hybrids‘Zhongshansha302’)的组织培养的繁殖方法，属于木本植物种苗繁殖的技术领域。

背景技术

中山杉(Taxodium hybrids‘Zhongshansha’)，杉科(Taxodiaceae)，落羽杉属(Taxodium)种间杂交优良无性系的总称，由落羽杉(T.distichum)、池杉(T.ascendens)、墨西哥落羽杉(T.mucronatum)三个树种种间杂交培育而成。半常绿高大乔木，主干突出，树冠圆锥形或伞状卵形，紧凑丰满。树叶密集，羽状复叶，条形，长0.6～1.0厘米，螺旋状散生在小枝上，不成二列。雌雄异花，同株。雌球花着生在新枝顶部，单个或2～3个簇生，成熟时呈球形，长3.5～5.0mm。雄球花着生在小枝上，成熟时呈椭圆形，长3.0～5.0mm。花期4月下旬，球果熟期10月。中山杉一年四季的枝叶颜色比较丰富，呈现绿——红(枝)——黄——红(叶)的颜色变化趋势。

中山杉无性系品种较为丰富，主要有：一代品种中山杉302；二代品种中山杉118、149和146；三代品种“杂交墨杉”中山杉502。中山杉为速生树种，耐水湿、耐盐碱、抗风性强，病虫害少，生长速度快，为优良的盐碱地绿化树种。

其中一代品种中山杉302，由南京中科院植物研究所陈永辉等用落羽杉♀和墨西哥落羽杉♂杂交，获得杂种优良无性系中山杉302，该植物品种于2002年通过国家林业局林木品种审定委员会审定，成为全国首批通过国家审定的16个林木良种之一，并且已经作为本领域的常规技术术语以及常规的试验材料在本领域广泛应用。然而，有关中山杉及落羽杉属植物，尤其涉及中山杉302的快速繁殖研究，国内外报道较少。目前研究主要集中在扦插繁殖上，而扦插繁殖受母本材料来源的限制很大。母本材料具有大量插穗，是扦插快繁生产的前提条件，这对于杂交选育的木本植物新品种来说，显然是不现实的。因此，通过组织培养繁殖是解决中山杉新优无性系扩繁的首选途径。落羽杉属及相近属树种的组织培养繁殖研究非常少。许秀玉等以墨西哥落羽杉的幼苗为起始外植体，研究其离体培养及再生体系的建立，得出了诱导培养基、伸长培养基和生根培养基(墨西哥落羽杉离体培养及再生体系的建立，林业科学，2007年第43卷第10期，40-44页)，但是该方法成活率低，仅仅为20％左右。楼文阜等以东方杉大树基部当年生的幼嫩萌枝为外植体，进行了组织培养技术研究，得出了芽增殖、芽伸长和生根培养基，及炼苗方法，然而由于东方杉和中山杉培养繁殖等方面存在较大的差异，发明人将其应用与中山杉并不合适，其增殖率很低，不能满足需求(东方杉的组织培养繁殖技术研究，上海农业学报，2007年第23卷第2期，17-23页)。陆小青等选用中山杉302的枝条扦插定向栽培技术来育苗，并未研究中山杉的组织培养繁殖方法(中山杉302、401优良无性系定向栽培技术，林业实用技术，2006年第6期)。发明专利CN101347099A公开了一种落羽杉的离体快速增殖方法，但是该方法选用成熟种子并且通过复杂工艺取得成熟胚，取材方式复杂，培养过程繁琐，并且仅仅适用于落羽杉种系的增殖，而不能通过简单地改动照搬用于中山杉种系。

目前关于中山杉的组织培养快繁研究在国内外尚属空白，本发明提供了一种中山杉302组织培养的繁殖方法，其操作简单快捷，大大提高了增殖率和增殖速度，从而能够解决了中山杉302在城市园林绿化、水源涵养、水土保持、绿色景观通道、生态建设等方面需求。

发明内容

本发明解决的技术问题是为了提高中山杉302组织培养的增殖率和增殖速度。

为了达到上述目的，本发明提供了一种中山杉品种302组织培养的繁殖方法，包括如下步骤：

(1)外植体的选取与消毒：选取当年生顶稍作为外植体，采样时间为当枝条由绿完全转红后第15天至第35天，自来水冲洗干净后，进行消毒；

(2)改良WPM培养基的制备：用Ca(NO₃)₂.4H₂O 684mg/L和KNO₃ 380mg/L代替原WPM培养基中的K₂SO₄和CaCl₂.2H₂O，其他组分均无变化，大量元素含有NH₄NO₃ 400mg/L、MgSO₄.7H₂O 370mg/L、Ca(NO₃)₂.4H₂O 556mg/L和KH₂PO₄ 170mg/L，微量元素含有H₃BO₃ 6.2mg/L、MnSO₄.H₂O 16.9mg/L、ZnSO₄.7H₂O 8.6mg/L、Na₂MoO₄.2H₂O 0.25mg/L和CuSO₄.5H₂O0.025mg/L，有机成分含有肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆辛0.5mg/L、盐酸噻胺1.0mg/L和甘氨酸2.0，铁盐为Na₂.EDTA 37.3mg/L和FeSO₄.7H₂O 27.8mg/L。

(3)不定芽的诱导：取步骤(1)中处理得到的外植体，切割为0.5-1.0cm长的茎段，将茎段接种于诱导培养基中进行不定芽的诱导，培养温度为20-26℃，首先在黑暗中培养20-26小时，然后进行正常培养20-25天；所述正常培养条件为：光照时间为10-16小时/天，光照强度为1600-2000Lx；所述诱导培养基为改良WPM培养基并添加激素玉米素、IBA和GA₃；所述诱导培养基中玉米素浓度为0.5mg/L，IBA浓度为0.2mg/L，GA₃浓度为1.0mg/L；

(4)继代增殖：将步骤(3)中得到的不定芽分化出的枝条接入继代增殖培养基中，进行继代培养25-35天，培养温度为20-26℃，光照时间为10-16小时/天，光照强度为1600-2000Lx；所述继代增殖培养基为改良WPM培养基并添加激素玉米素和IBA；所述继代增殖培养基中玉米素浓度为0.3mg/L，IBA浓度为0.2mg/L；

(5)根的诱导：将步骤(4)中所得中山杉302无根试管苗进行切割后，接入生根培养基中进行生根培养15-20天，培养温度为20-26℃，光照时间为10-16小时/天，光照强度为1600-2000Lx；所述生根培养基为1/2MS培养基并添加激素IBA；所述生根培养基中IBA浓度为3.0mg/L；

(6)无菌苗的炼苗：将步骤(4)所得中山杉302带根无菌苗的培养瓶瓶盖打开，露天培养2-3天，然后移入采用多菌灵(稀释浓度2g/L)消毒的基质中，组培苗上方使用带孔PVC膜覆盖保湿，炼苗容器采用50孔穴盘，放在通风阴凉处培养25-30d，培养到第15天将PVC膜移除，换用折光率75％的遮阳网；所述基质成分为体积比1∶1的泥炭土与珍珠岩。

上述诱导培养基、继代增殖培养基、生根培养基中均含有琼脂6.0-7.0g/L(优选6.5g/L)、蔗糖25-35g/L(优选30g/L)，且pH值为5.8-6.2。

步骤(1)中外植体的选取与消毒的具体过程为：选取当年生茎段作为外植体，用清水冲洗干净，用毛刷蘸少许洗衣粉将其表面刷洗干净，再用自来水漂洗3-5次，然后用“安利(Amway)”洗液震荡漂洗30分钟，接着用自来水流水冲洗30分钟，84消毒液(稀释50倍)摇床上振荡消毒10分钟。流水冲洗20-30分钟后，于无菌操作台上用75％乙醇消毒50-60秒，立即倒入0.1％的升汞消毒12分钟，最后用无菌水洗涤4次，每次振荡3-5分钟；

步骤(3)中最佳的正常培养时间为20天；步骤(4)中最佳继代增殖培养时间为30天；步骤(5)中最佳生根培养时间为15天；步骤(6)中最佳驯苗时间为30天。

本发明中山杉302组织培养的繁殖方法具有以下优点：

1、选取外植体时间

木本植物外植体本身的生理状况、休眠深度与植株再生是密切相关的。在最佳取样时间之前采样，外植体培养时玻璃化现象严重，不利于不定芽的诱导，而在最佳取样时间之后采样，外植体污染率显著增加，不利于建立无菌系。发明人通过反复试验验证选取当年生顶稍作为外植体，采样时间为当枝条由绿完全转红后第15天至第35天，其玻璃化现象较轻，且诱导率最高。

2、WPM改良

在原WPM培养基上培养时，外植体不定芽不易分化出枝梢，外植体上只爆芽而不伸长，而在MS培养基上，不定芽分化为叶芽，发育成羽状复叶，对继代增值没有作用。将WPM培养基改良后，改变了NPK比例，用Ca(NO₃)₂.4H₂O 684mg/L和KNO₃ 380mg/L代替原WPM培养基中的K₂SO₄和CaCl₂.2H₂O，能够显著促进不定芽的分化及生长。

3诱导之前先经过一段时间的暗培养，使外植体迅速分裂，然后光诱导培养，其萌发率能达到最好效果，另外，本申请发明人经过大量反复操作试验得到了对中山杉302品种的最佳诱导、增殖培养基及其激素水平，即诱导培养基为：改良WPM+玉米素0.5mg/L+IBA 0.2mg/L+GA₃1.0mg/L；增殖培养基为：改良WPM+玉米素0.3mg/L+IBA 0.2mg/L；使用其培养基及特定激素水平能够使外植体的萌发率、诱导率达到最高水平。

4、采用本发明的中山杉302培养繁殖方法，最终增殖率为102-110倍；其中采用继代增殖培养基，增殖倍数为10倍；采用诱导培养基，不定芽诱导率为80％，平均诱导可伸长的侧枝数为3.4；采用生根培养基，生根率为80％-90％，平均生根数为3.3条；炼苗成活率达到90％。

具体实施方式

外植体取样时间筛选实施例

以中山杉302枝条由绿色开始变为红色为起始时间(完全变红需要约7天时间)，开始每隔7天取样一次，至枝条完全变为红色后第49天止(即第9次取样)。将外植体消毒后接与诱导培养基，观察诱导情况，统计诱导率及污染率。

试验观察发现，前3次取样，即枝条开始变红至完全变红后第7天，由于外植体材料幼嫩，在茎段腋芽隐芽处长出愈伤，并且呈玻璃化，因此诱导率非常低。随着枝条的发育，在第4至7次，外植体诱导情况良好，在培养基上生长正常，无玻璃化愈伤，诱导率也比较高。在枝条变红后的第28天开始，由于枝条老化，携带病菌增多，开始出现污染。在前期(即第6、7次取样)污染率低，影响较小。但在枝条变红后的第42天开始，污染率无法控制，不适宜再取外植体。(参见表1)

因此，中山杉302的外植体选材时间为当枝条由绿完全转红后第15天至第35天，枝条颜色变化比较容易观察，可作为区分枝条发育情况、选取外植体的参照时间点。

表1 外植体取样时间的筛选

基本培养基筛选实施例

选取外植体切割成1.0cm左右的小段，接入添加玉米素0.5mg/L、IBA0.2mg/L和GA₃浓度为1.0mg/L的1/2MS、MS、WPM和改良WPM 4种基本培养基中进行初代培养35天，统计诱导率，新稍长度，不定芽分化情况。培养温度26℃，光照时间16小时/天，光照强度为2000Lx。

试验发现，4种基本培养基中诱导效果最好的为改良WPM，在该培养基上外植体诱导率达到85％，不定芽可以分化出可伸长的有分支的嫩梢。而在其他3种培养基上，均分化不出具有分支的嫩梢，因而不能进行继代增殖。

表2 基本培养基的筛选

激素组合筛选实施例

选取外植体切割成1.0cm左右的小段，分别接入含有不同激素水平的改良WPM培养基中进行初代培养35天，统计诱导率，新稍长度，不定芽分化情况。培养温度26℃，光照时间16小时/天，光照强度为2000Lx。

试验结果发现，选取激素为玉米素、IBA、GA且浓度分别为0.5mg/L、IBA0.2mg/L、1.0mg/L诱导率最高。

表3 激素组合筛选

方法实施例一

1、2010年5月30日，即中山杉302枝条由绿完全变红后的第15天，选取10枝健壮无病虫害的当年生新稍(顶稍)，剪去侧枝小枝，并将新稍上所有叶片剪去一半。

2、将外植体用清水冲洗干净，用毛刷蘸少许洗衣粉将其表面刷洗干净，再用自来水漂洗3次，然后用“安利”洗液震荡漂洗30分钟，接着用自来水流水冲洗30分钟，84消毒液(稀释50倍)摇床上振荡消毒10分钟。流水冲洗20分钟后，于无菌操作台上用75％乙醇消毒50秒，立即倒入0.1％的升汞消毒12分钟，最后用无菌水洗涤4次，每次振荡3分钟。将消毒后的外植体切割为0.5-1.0cm长的小段，共切取茎段100段，接种于诱导培养基改良WPM+玉米素0.5mg/L+IBA 0.2mg/L+GA₃1.0mg/L中进行初代诱导培养，控制培养温度在26℃，首先在黑暗中培养26小时，然后进行光照培养20天，光照时间16小时/天，光照强度为2000Lx。

3、外植体接入培养基15天后，腋芽开始萌动。至25天时，萌发率达80％，共获得80株不带根的初代无菌苗，每株无菌苗带有7-8个复叶或新稍，其中3-4个为有分支新稍，其余为羽状复叶。新稍平均长度6.5cm。将新稍从主干上切下，去掉嫩头，切为1cm左右的茎段，共得到茎段250段。接入继代增殖培养基改良WPM+玉米素0.3mg/L+IBA 0.2mg/L中，培养条件同上。培养15天后，腋芽隐芽开始陆续出梢，30天后，诱导率达到70％，即175段在继代增殖培养基上分化出了新的嫩梢。平均增殖率达到10倍，即每株继代苗上平均可切出1cm茎段10段。

4、将继代增殖得到的继代无菌苗切为1cm长的茎段，得到茎段1750段。进行第2次继代，15天后腋芽开始出梢，30天后得到无菌苗1400株(即诱导率达到80％)。

5、将经过2次继代的无菌苗接入生根壮苗培养基1/2MS+IBA3.0mg/L，培养条件同上。培养10天后开始生根，15天后生根率达81％，平均生根数达到3.3条。至此获得含根无菌苗1134株。

6、将所得1134株中山杉302带根无菌苗的培养瓶瓶盖打开，露天培养2天，然后移入采用多菌灵(稀释浓度2g/L)消毒的基质中，栽培基质成分为体积比1∶1的泥炭土与珍珠岩，组培炼苗容器上方使用带孔PVC膜覆盖保湿，炼苗容器采用50孔穴盘，放在通风阴凉处培养，培养到第15天将PVC膜移除，换用折光率75％的遮阳网，30天后成活率达到90％。共获得成苗1020株。

以上培养基中还添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l，同时控制培养基pH为5.8-6.2。

方法实施例二

1、2010年6月19日，即中山杉302枝条由绿完全变红后的第35天，选取10枝健壮无病虫害的当年生新稍(顶稍)，剪去侧枝小枝，并将新稍上所有叶片剪去一半。

2、将外植体用清水冲洗干净，用毛刷蘸少许洗衣粉将其表面刷洗干净，再用自来水漂洗5次，然后用“安利”洗液震荡漂洗30分钟，接着用自来水流水冲洗30分钟，84消毒液(稀释50倍)摇床上振荡消毒10分钟。流水冲洗30分钟后，于无菌操作台上用75％乙醇消毒60秒，立即倒入0.1％的升汞消毒12分钟，最后用无菌水洗涤4次，每次振荡5分钟。将消毒后的外植体切割为0.5-1.0cm长的小段，共切取茎段100段，接种于诱导培养基改良WPM+玉米素0.5mg/L+IBA 0.2mg/L+GA₃1.0mg/L中进行初代诱导培养，控制培养温度在26℃，首先在黑暗中培养26小时，然后进行光照培养20天，光照时间16小时/天，光照强度为2000Lx。

3、外植体接入培养基15天后，腋芽开始萌动。至25天时，污染10株，萌发率达85％，共获得76株不带根的初代无菌苗，每株无菌苗带有7-8个复叶或新稍，其中3-4个为有分支新稍，其余为羽状复叶。新稍平均长度6.5cm。将新稍从主干上切下，去掉嫩头，切为1cm左右的茎段，共得到茎段240段。接入继代增殖培养基改良WPM+玉米素0.3mg/L+IBA 0.2mg/L中，培养条件同上。培养15天后，腋芽隐芽开始陆续出梢，30天后，诱导率达到70％，即168段在继代增殖培养基上分化出了新的嫩梢。平均增殖率达到10倍，即每株继代苗上平均可切出1cm茎段10段。

4、将继代增殖得到的继代无菌苗切为1cm长的茎段，得到茎段1680段。进行第2次继代，15天后腋芽开始出梢，30天后得到无菌苗1344株(即诱导率达到80％)。

5、将经过2次继代的无菌苗接入生根壮苗培养基1/2MS+IBA3.0mg/L，培养条件同上。培养10天后开始生根，15天后生根率达90％，平均生根数达到3.3个。至此获得含根无菌苗1210株。

6、将所得1210株中山杉302带根无菌苗的培养瓶瓶盖打开，露天培养3天，然后移入采用多菌灵(稀释浓度2g/L)消毒的基质中，基质成分为体积比1∶1的泥炭土与珍珠岩，组培苗上方使用带孔PVC膜覆盖保湿，驯化容器采用周转箱，放在通风阴凉处培养，培养到第15天将PVC膜移除，换用折光率75％的遮阳网，30天后成活率达到91％。共获得成苗1100株。

以上培养基中还添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l，同时控制培养基pH为5.8-6.2。

Claims (7)

1.一种中山杉302组织培养的繁殖方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)外植体的选取与消毒：选取当年生顶稍作为外植体，采样时间为当枝条由绿完全转红后第15天至第35天，自来水冲洗干净后，进行消毒；

(2)改良WPM培养基的制备：用Ca(NO₃)₂.4H₂O 684mg/L和KNO₃380mg/L代替原WPM培养基中的K₂SO₄和CaCl₂.2H₂O；

(3)不定芽的诱导：取步骤(1)中处理得到的外植体，切割为0.5-1.0cm长的茎段，接种于诱导培养基中进行不定芽的诱导，培养温度为20-26℃，首先在黑暗中培养20-26小时，然后进行正常培养20-25天；所述正常培养条件为：光照时间为10-16小时/天，光照强度为1600-2000lx；

(4)继代增殖：将步骤(3)中得到的不定芽分化出的枝条接入继代增殖培养基，进行继代培养25-35天，培养温度为20-26℃，光照时间为10-16小时/天，光照强度为1600-2000lx；

(5)根的诱导：将步骤(4)中所得中山杉无根试管苗进行切割后，接入生根培养基中进行生根培养15-20天，培养温度为20-26℃，光照时间为10-16小时/天，光照强度为1600-2000Lx；

(6)无菌苗的驯化炼苗：将步骤(4)所得中山杉带根无菌苗的培养瓶瓶盖打开，露天培养2-3天，然后移入采用多菌灵(稀释浓度2g/L)消毒的基质中，组培苗上方使用带孔PVC膜覆盖保湿，驯化容器采用50孔穴盘，放在通风阴凉处培养25-30天，培养到第15天将PVC膜移除，换用折光率75％的遮阳网；所述基质成分为体积比1∶1的泥炭土与珍珠岩；

上述诱导培养基、继代增殖培养基、生根培养基中均含有琼脂6.0-7.0g/L、蔗糖25-35g/L，且pH值为5.8-6.2。

2.根据权利要求1所述中山杉302组织培养的繁殖方法，其特征在于：步骤(3)中所述诱导培养基为改良WPM培养基并添加激素玉米素、IBA和GA₃；所述诱导培养基中玉米素浓度为0.5mg/L，IBA浓度为0.2mg/L，GA₃浓度为1.0mg/L。

3.根据权利要求1所述中山杉302组织培养的繁殖方法，其特征在于：步骤(4)中所述继代增殖培养基为改良WPM培养基并添加激素玉米素和IBA；所述继代增殖培养基中玉米素浓度为0.3mg/L，IBA浓度为0.2mg/L。

4.根据权利要求1所述中山杉302组织培养的繁殖方法，其特征在于：步骤(5)中所述生根培养基为1/2MS培养基并添加激素IBA；所述生根培养基中IBA浓度为3.0mg/L。

5.根据权利要求1所述中山杉302组织培养的繁殖方法，其特征在于：所述步骤(3)中的正常培养时间为20天；所述步骤(4)中的继代增殖培养时间为30天；所述步骤(5)中的生根培养时间为15天；所述步骤(6)中的驯化时间为30天。

6.根据权利要求1至5任一所述中山杉302组织培养的繁殖方法，其特征在于：所述步骤(1)中进行消毒过程为：用清水冲洗干净，用毛刷蘸少许洗衣粉将其表面刷洗干净，再用自来水漂洗3-5次，然后用“安利”洗液震荡漂洗30分钟，接着用自来水流水冲洗30分钟，稀释50倍的84消毒液摇床上振荡消毒10分钟，流水冲洗20-30分钟后，于无菌操作台上用75％乙醇消毒50-60秒，立即倒入0.1％的升汞消毒12分钟，最后用无菌水洗涤4次，每次振荡3-5分钟。

7.根据权利要求1至5任一所述中山杉302组织培养的繁殖方法，其特征在于：所述诱导培养基、继代增殖培养基、生根培养基中均含有琼脂6.5g/L、蔗糖30g/L，且pH值为6.0。