CN109258425A - 一种提高蛇足石杉中石杉碱甲含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高蛇足石杉中石杉碱甲含量的方法，包括对蛇足石杉植株黑暗环境预处理，再利用组合光对预处理的蛇足石杉植株进行光诱导培养，所述的组合光包括白光、红光和/或蓝光。该方法可以显著提高蛇足石杉中石杉碱甲的含量，方法简单易行，为快速提高蛇足石杉的石杉碱甲的含量提供新方法。

Description

一种提高蛇足石杉中石杉碱甲含量的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高蛇足石杉中石杉碱甲含量的方法。
背景技术
蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb.)Trev.)为石松目(Lycopodiales)石杉科(Lycopodiaceae)石杉属(Lycopodium L.)多年生草本蕨类植物。蛇足石杉的主要分布区位于我国中亚热带和南亚热带所在的地理区域，幅员面积260×10％m2，实际分布生境总面积约39x107mP；性喜阴温，所适应的生态环境为中亚热带常绿國叶林和南亚热带季风常绿叶林及其次生生态系统。蛇足石杉在民间主要用于治疗跌打肿痛、内伤出血、毒虫毒蛇咬伤、烧伤烫伤等病症。1927年我国科技工作者报道了从该植物中分离的石杉碱甲具有横纹肌松弛作用，之后的大量研究发现石杉碱甲是一种高效、低毒、可逆和高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂。现在，被石杉碱甲及经作为治疗阿尔茨海默病(AD，Alzheimer disease)的药物，同时在美国被用做益智的营养保健品。
然而，蛇足石杉自然资源严重短缺。蛇足石杉生长缓慢，野生状态其的繁殖主要以孢子繁殖为主，孢子萌发周期长，萌发后属地下生配子体，需6-15年才能成熟。因此极大地限制了蛇足石杉野生资源的再生。蛇足石杉中的石杉碱甲含量又很低(0.007％)，再加上其全合成石杉碱甲步骤繁琐、价格昂贵且有副作用。目前，石杉碱甲的提取主要依赖于野生资源，提取率仅为0.006％-0.1％，因而大量的市场需求、受限的自然资源和自身生长繁殖的限制。因此，为了获取这种资源，人们疯狂的从自然界索取蛇足石杉野生资源，导致其已处于灭绝的边缘；同时，蛇足石杉生长地生态环境也遭到破坏。为了缓解这种供需矛盾，很多研究者已经开始对其生殖繁殖进行研究。
但是，即使未来蛇足石杉的大规模繁殖已经解决，其生长缓慢，最主要是其中的功能成分石杉碱甲含量非常低，这必将成为使用这一资源的限制性因素。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高蛇足石杉中石杉碱甲含量的方法，可用于快速提高蛇足石杉植株中石杉碱甲的含量，从而节约蛇足石杉资源，也为进一步研究石杉碱甲的生物调控提供依据。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
一种提高蛇足石杉中石杉碱甲含量的方法，其特征在于，包括对蛇足石杉植株黑暗环境预处理，再利用组合光对预处理的蛇足石杉植株进行光诱导培养，所述的组合光包括白光、红光和/或蓝光。
进一步地，所述组合光的光照强度为3500Lux。
进一步地，所述的组合光的光照周期为每24h给光8-24h。
具体地，所述的黑暗环境预处理是将蛇足石杉植株培养在青苔基质中，然后将其放置在黑暗的环境中培养。
更具体地，所述的黑暗环境预处理时间为3-6周。
进一步地，所述的光诱导培养是对预处理的蛇足石杉植株喷洒酒精，然后用组合光培养。
进一步地，所述的酒精的浓度为70-100％。
更进一步地，所述的预处理和光诱导培养温度均为25±5℃，湿度均为60％。
本发明进行蛇足石杉插条生根的方法，具有以下优点：
本发明通过对蛇足石杉植株黑暗处理，再用酒精喷洒及不同组合的光质照射，达到了快速提高蛇足石杉植株中石杉碱甲的含量的目的，方法简单易行，为快速提高蛇足石杉的石杉碱甲的含量提供新方法。
具体实施方式
蛇足石杉的主要分布区位于我国中亚热带和南亚热带所在的地理区域，幅员面积260×10％m2，实际分布生境总面积约39x107mP；性喜阴温，所适应的生态环境为中亚热带常绿國叶林和南亚热带季风常绿叶林及其次生生态系统。本发明中的蛇足石杉采集地主要集中于江西、云南、湖北、浙江等地，是指其蛇足石杉根茎叶俱全，无枯萎，无折断；MS液体培养基也称MS培养基。MS培养基是常用的基本培养基，是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。
测定蛇足石杉植株中石杉碱甲的含量高效液相色谱检测，步骤如下：精确称取石杉碱甲标准品2.50mg于25mL容量瓶中以无水乙醇溶解并定容,得到标准品溶液。样品的制备方法如下，取蛇足石杉全株于60℃下烘干至恒重，粉碎后用研钵研成粉末，精确称取粉末0.12g置于5mL离心管中，加入3mL 2％酒石酸溶液，密封，在70MHz下超声3h后12 000×g离心5min，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤即得样品液。色谱条件如下，色谱柱为DiamonsilC18不锈钢柱(250mm×4.6mm,5μm)(Dikma),流动相为甲醇-0.8％醋酸铵溶液(v/v＝40:60)，流速为0.8mL·min-1，检测波长为308nm，柱温为25℃，进样量为10μL。按上述色谱条件进样，记录石杉碱甲峰面积，用外标法计算样品中石杉碱甲的含量，重复3次取平均值。
以下结合实施例和对比例对本发明作进一步的详细说明。
对比例1：
在野外采集生长良好的蛇足石杉植株，将植株的根部培养在用水浸湿至饱和状态的青苔基质中，1周后，经测定蛇足石杉植株中石杉碱甲的含量为0.016％。
实施例2：
在野外采集生长良好的蛇足石杉植株，将植株根部培养在用水浸湿至饱和状态的青苔基质中，然后将其放置在黑暗的环境中预处理3-6周，然后放置到白光下培养，光强度3500Lux，温度25±5℃，湿度60％。1周后测定蛇足石杉植株中石杉碱甲的含量如下表1。
表1不同黑暗处理时间对蛇足石杉中石杉碱甲含量的影响
黑暗处理时间(周) 3 4 5 6
石杉碱甲含量(％) 0.018 0.026 0.021 0.021
实施例3：
步骤一，蛇足石杉植株的预处理
在野外采集生长良好的蛇足石杉植株，将植株根部培养在用水浸湿至饱和状态的青苔基质中，然后将其放置在黑暗的环境中预处理4周，预处理温度25±5℃，湿度60％。
步骤二，蛇足石杉植株的诱导
取经过预处理蛇足石杉植株，用70％酒精喷洒其叶片表面至有以肉眼可见一层水膜为止，然后放置在白光的环境中培养，光照周期为每24小时给光8-24小时，光照强度3500Lux，培养的温度和湿度同步骤一。1周后测定蛇足石杉植株中石杉碱甲的含量如表2。
表2不同白光光照周期对蛇足石杉中石杉碱甲含量的影响
光周期(小时) 8 16 24
石杉碱甲含量(％) 0.033 0.047 0.045
实施例4：
步骤一，蛇足石杉植株的预处理
同实施例3。
步骤二，蛇足石杉植株的诱导
取经过预处理蛇足石杉植株，用70-100％酒精喷洒其叶片表面至肉眼可见有一层水膜为止，然后放置在白光的环境中培养，光照周期为每24小时给光16小时，光照强度3500Lux，培养的温度和湿度同步骤一。1周后测定蛇足石杉植株中石杉碱甲的含量如表3。
表3不同酒精浓度对蛇足石杉中石杉碱甲含量的影响
酒精浓度(％) 70 80 90 100
石杉碱甲含量(％) 0.045 0.051 0.059 0.044
实施例5：
步骤一，蛇足石杉植株的预处理
同实施例3。
步骤二，蛇足石杉植株的诱导
取经过预处理蛇足石杉植株，用90％酒精喷洒其叶片表面至肉眼可见有一层水膜为止，然后放置在白光、红光或蓝光单独环境中，或者两两组合光照的环境中培养，光照周期为每16小时，光照强度3500Lux，培养的温度和湿度同步骤一。1周后测定蛇足石杉植株中石杉碱甲的含量如表4。
表4不同光质组合对蛇足石杉中石杉碱甲含量(％)的影响

Claims (8)

1.一种提高蛇足石杉中石杉碱甲含量的方法，其特征在于，包括对蛇足石杉植株黑暗环境预处理，再利用组合光对预处理的蛇足石杉植株进行光诱导培养，所述的组合光包括白光、红光和/或蓝光。
2.如权利要求1所述的提高蛇足石杉中石杉碱甲含量的方法，其特征在于，所述组合光的光照强度为3500Lux。
3.如权利要求1或2所述的提高蛇足石杉中石杉碱甲含量的方法，其特征在于，所述的组合光的光照周期为每24h给光8-24h。
4.如权利要求1所述的提高蛇足石杉中石杉碱甲含量的方法，其特征在于，所述的黑暗环境预处理是将蛇足石杉植株培养在青苔基质中，然后将其放置在黑暗的环境中培养。
5.如权利要求1或2所述的提高蛇足石杉中石杉碱甲含量的方法，其特征在于，所述的黑暗环预处理时间为3-6周。
6.如权利要求1所述的提高蛇足石杉中石杉碱甲含量的方法，其特征在于，所述的光诱导培养是对预处理的蛇足石杉植株喷洒酒精，然后用组合光培养。
7.如权利要求6所述的提高蛇足石杉中石杉碱甲含量的方法，其特征在于，所述的酒精的浓度为70-100％。
8.如权利要求1所述的提高蛇足石杉中石杉碱甲含量的方法，其特征在于，所述的预处理和光诱导培养温度均为25±5℃，湿度均为60％。
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