CN103875532A - 一种杰兔越橘组织培养的增殖培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种杰兔越橘组织培养的增殖培养基：改良WPM培养基+玉米素2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH为4.8-5.0；每升改良WPM培养基中含大量元素：1071.6mg硝酸钾、370mg硫酸镁、96mg氯化钙、170mg磷酸二氢钾；铁盐：37.3mg乙二胺四乙酸二钠、27.8mg硫酸亚铁；微量元素：22.3mg硫酸锰、8.6mg硫酸锌、0.025mg硫酸铜、0.25mg钼酸钠、6.2mg硼酸；有机物：0.5mg烟酸、0.5mg盐酸硫胺素、0.5mg盐酸毗哆醇、l00mg肌醇、2mg甘氨酸，采用该培养基30d增殖倍数达到9.8倍。
Description
技术领域
本发明涉及一种改良的越橘增殖培养基。
背景技术
越橘是杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)灌木类小浆果果树。其果实为蓝色或红色，酸甜适中，具有极高的营养价值和医疗保健作用，特别是抗氧化能力为所有果品蔬菜之首，对防止人体细胞衰老,预防老年性疾病(心脏病、白内障、癌症、记忆力衰退等)具有特殊功效，但常规繁殖方法不能满足快速发展的需要。采用组织培养离体快繁越桔的研究已有报道，但由于木本植物组培生长速度慢，仍然影响了越橘的快速发展，优化越橘培养基配方显得极其重要。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种既能提高杰兔越橘的增殖倍数，又能缩短增殖周期，且增殖苗生长健壮的杰兔越橘增殖的培养基及其制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种杰兔越橘组织培养的增殖培养基，包括如下组分：改良WPM培养基+玉米素0.5-0.8mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂8-9 g·L-1，pH为4.8-5.0
上述改良WPM基本培养基包括如下组分：
大量元素：1071.6 mg·L-1硝酸钾、 370 mg·L-1硫酸镁、96 mg·L-1氯化钙、 170mg磷酸二氢钾；
微量元素：22.3 mg·L-1硫酸锰、8.6 mg·L-1硫酸锌、0.025 mg·L-1硫酸铜、0.25mg钼酸钠、6.2 mg·L-1硼酸；
铁盐：37.3 mg·L-1乙二胺四乙酸二钠、27.8 mg·L-1硫酸亚铁；
有机物：0.5 mg·L-1烟酸、0.5 mg·L-1盐酸硫胺素、0.5 mg·L-1盐酸毗哆醇、l00 mg·L-1肌醇、2 mg·L-1甘氨酸；
蔗糖30 g·L-1，琼脂8-9 g·L-1；
玉米素0.5-0.8 mg·L-1 ；
其余为蒸馏水，pH为4.8-5.0。
上述越橘组织培养的增殖培养基的制备方法，该方法包括如下步骤：
（1）配制改良WPM培养基：
(11)50倍大量元素母液的配制：分别称取KNO3，53.58g；MgSO4，18.5g；然后用纯水溶解后定容至1000ml，配成母液Ⅰ；
称取CaCl2·2H2O，4.8g，用纯水溶解后定容至1000ml，配成母液ⅡⅤ；Ⅳ
称取KH2PO4，8.5g用纯水溶解后定容至1000ml为母液Ⅲ；
使用时配制每升增殖培养基取母液Ⅰ，母液Ⅱ，母液Ⅲ各20ml；
(12)200倍的微量元素母液的配制：称取MnSO4·H2O，4.46g；ZnSO4·7H2O，1.72
g；H3BO3 1.24g；Na2MoO4·2H2O 0.05g；CuSO4·5H2O 0.005g，用纯水溶解后定容至1000ml保存，使用时配制每升增殖培养基取5ml；
(13)200倍的EDTA-铁盐母液的配制：称取5.56gFeSO4·7H2O和7.46gNa2-EDTA试剂分别溶解，混合定容至1000mL，使用时配制每升增殖培养基取2.5ml；
(14)200倍的有机成分母液的配制：称取0.4g甘氨酸，0.01gVbl，0.01gVb6，0.01g烟酸，20g肌醇溶解后混合定容至1000ml，使用时配制每升增殖培养基取5ml；
(15)激素母液的配制：称取0.05gZR先用少量乙醇溶解，然后加水定容至100ml，使用时配制每升增殖培养基取1ml；
(2)按上述步骤（11）至步骤（15）中配制每升增殖培养基的用量加入后，再加入琼脂8g，蔗糖30g，加热溶解后定容至1L，用0.lmol·L-1盐酸调pH至4.8-5.0，灭菌；待培养基温度降至60-70℃时，在接种台上采用过滤灭菌法添加玉米素母液，母液浓度为0.5mg/ml,每升培养基加1-1.6ml玉米素母液，然后在接种台上分装培养基。
本发明的改良WPM培养基增殖方法为：
将无菌苗在超净台上接种至配制好的灭菌的增殖培养基上，在光照强度3000Lux的条件下培养，培养条件为：温度27-30℃，光照时间为16小时。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：
1. 组成培养基较传统培养基成分减少。
2. 采用该培养基进行增殖，增殖周期短，增殖倍数高。
3. 增殖苗健壮。
具体实施方式：
以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。
实施例1：
将杰兔越橘接种于改良的WPM的增殖培养基中，其培养基成分和含量包括：
大量元素：1071.6 mg·L-1硝酸钾、 370 mg·L-1硫酸镁、96 mg·L-1氯化钙、 170mg磷酸二氢钾；
微量元素：22.3 mg·L-1硫酸锰、8.6 mg·L-1硫酸锌、0.025 mg·L-1硫酸铜、0.25mg钼酸钠、6.2 mg·L-1硼酸；
铁盐：37.3 mg·L-1乙二胺四乙酸二钠、27.8 mg·L-1硫酸亚铁；
有机物：0.5 mg·L-1烟酸、0.5 mg·L-1盐酸硫胺素、0.5 mg·L-1盐酸毗哆醇、l00 mg·L-1肌醇、2 mg·L-1甘氨酸；
蔗糖30 g·L-1，琼脂8 g·L-1；
玉米素0.5 mg·L-1 ；
其余为蒸馏水，pH为5.0；
制备方法如下：
（1）配制改良WPM培养基：
(11)50倍大量元素母液的配制：分别称取KNO3，53.58g；MgSO4，18.5g；然后用纯水溶解后定容至1000ml，配成母液Ⅰ；
称取CaCl2·2H2O，4.8g，用纯水溶解后定容至1000ml，配成母液ⅡⅤ；Ⅳ
称取KH2PO4，8.5g用纯水溶解后定容至1000ml为母液Ⅲ；
使用时配制每升增殖培养基取母液Ⅰ，母液Ⅱ，母液Ⅲ各20ml；
(12)200倍的微量元素母液的配制：称取MnSO4·H2O，4.46g；ZnSO4·7H2O，1.72
g；H3BO3 1.24g；Na2MoO4·2H2O 0.05g；CuSO4·5H2O 0.005g，用纯水溶解后定容至1000ml保存，使用时配制每升增殖培养基取5ml；
(13)200倍的EDTA-铁盐母液的配制：称取5.56gFeSO4·7H2O和7.46gNa2-EDTA试剂分别溶解，混合定容至1000mL，使用时配制每升增殖培养基取2.5ml；
(14)200倍的有机成分母液的配制：称取0.4g甘氨酸，0.01g盐酸硫胺素，0.01g盐酸吡哆醇，0.01g烟酸，20g肌醇溶解后混合定容至1000ml，使用时配制每升增殖培养基取5ml；
(15)激素母液的配制：称取0.05gZR先用少量乙醇溶解，然后加水定容至100ml，使用时配制每升增殖培养基取1ml；
(2)按上述步骤（11）至步骤（15）中配制每升增殖培养基的用量加入后，再加入琼脂8g，蔗糖30g，加热溶解后定容至1L，用0.lmol·L-1盐酸调pH至5.0，灭菌；待培养基温度降至60℃时，在接种台上采用过滤灭菌法添加玉米素母液，母液浓度为0.5mg/ml,每升培养基加1ml玉米素母液，然后在接种台上分装培养基。
将无菌苗在超净台上接种至配制好的灭菌的增殖培养基上，在光照强度3000Lux的条件下培养，培养条件为：温度27-30℃，每日光照时间为16小时。
30天后统计发现植株生长健壮，叶片呈绿色，植株增殖倍数达9.8。
实施例2：
将杰兔越橘接种于改良的WPM的增殖培养基中，其培养基成分和含量包括：
大量元素：1071.6 mg·L-1硝酸钾、 370 mg·L-1硫酸镁、96 mg·L-1氯化钙、 170mg磷酸二氢钾；
微量元素：22.3 mg·L-1硫酸锰、8.6 mg·L-1硫酸锌、0.025 mg·L-1硫酸铜、0.25mg钼酸钠、6.2 mg·L-1硼酸；
铁盐：37.3 mg·L-1乙二胺四乙酸二钠、27.8 mg·L-1硫酸亚铁；
有机物：0.5 mg·L-1烟酸、0.5 mg·L-1盐酸硫胺素、0.5 mg·L-1盐酸毗哆醇、l00 mg·L-1肌醇、2 mg·L-1甘氨酸；
蔗糖30 g·L-1，琼脂9 g·L-1；
玉米素0.6 mg·L-1 ；
其余为蒸馏水，pH为4.8；
制备方法如下：
（1）配制改良WPM培养基：
(11)50倍大量元素母液的配制：分别称取KNO3，53.58g；MgSO4，18.5g；然后用纯水溶解后定容至1000ml，配成母液Ⅰ；
称取CaCl2·2H2O，4.8g，用纯水溶解后定容至1000ml，配成母液ⅡⅤ；Ⅳ
称取KH2PO4，8.5g用纯水溶解后定容至1000ml为母液Ⅲ；
使用时配制每升增殖培养基取母液Ⅰ，母液Ⅱ，母液Ⅲ各20ml；
(12)200倍的微量元素母液的配制：称取MnSO4·H2O，4.46g；ZnSO4·7H2O，1.72
g；H3BO3 1.24g；Na2MoO4·2H2O 0.05g；CuSO4·5H2O 0.005g，用纯水溶解后定容至1000ml保存，使用时配制每升增殖培养基取5ml；
(13)200倍的EDTA-铁盐母液的配制：称取5.56gFeSO4·7H2O和7.46gNa2-EDTA试剂分别溶解，混合定容至1000mL，使用时配制每升增殖培养基取2.5ml；
(14)200倍的有机成分母液的配制：称取0.4g甘氨酸，0.01g盐酸硫胺素，0.01g盐酸吡哆醇，0.01g烟酸，20g肌醇溶解后混合定容至1000ml，使用时配制每升增殖培养基取5ml；
(15)激素母液的配制：称取0.05gZR先用少量乙醇溶解，然后加水定容至100ml，使用时配制每升增殖培养基取1ml；
(2)按上述步骤（11）至步骤（15）中配制每升增殖培养基的用量加入后，再加入琼脂9g，蔗糖30g，加热溶解后定容至1L，用0.lmol·L-1盐酸调pH至4.8，灭菌；待培养基温度降至70℃时，在接种台上采用过滤灭菌法添加玉米素母液，母液浓度为0.5mg/ml,每升培养基加1.2ml玉米素母液，然后在接种台上分装培养基。
使用方法：将无菌苗在超净台上接种至配制好的灭菌的增殖培养基上，在光照强度3000Lux的条件下培养，培养条件为：温度27-30℃，每日光照时间为16小时。
30天后统计发现植株生长健壮，叶片呈绿色，植株增殖倍数达9.2。
实施例3：
将“杰兔”越橘接种于改良的WPM的增殖培养基中，其培养基成分和含量包括：
大量元素：1071.6 mg·L-1硝酸钾、 370 mg·L-1硫酸镁、96 mg·L-1氯化钙、 170mg磷酸二氢钾；
微量元素：22.3 mg·L-1硫酸锰、8.6 mg·L-1硫酸锌、0.025 mg·L-1硫酸铜、0.25mg钼酸钠、6.2 mg·L-1硼酸；
铁盐：37.3 mg·L-1乙二胺四乙酸二钠、27.8 mg·L-1硫酸亚铁；
有机物：0.5 mg·L-1烟酸、0.5 mg·L-1盐酸硫胺素、0.5 mg·L-1盐酸毗哆醇、l00 mg·L-1肌醇、2 mg·L-1甘氨酸；
蔗糖30 g·L-1，琼脂8 g·L-1；
玉米素0.8 mg·L-1 ；
其余为蒸馏水，pH为4.9；
制备方法如下：
（1）配制改良WPM培养基：
(11)50倍大量元素母液的配制：分别称取KNO3，53.58g；MgSO4，18.5g；然后用纯水溶解后定容至1000ml，配成母液Ⅰ；
称取CaCl2·2H2O，4.8g，用纯水溶解后定容至1000ml，配成母液ⅡⅤ；Ⅳ
称取KH2PO4，8.5g用纯水溶解后定容至1000ml为母液Ⅲ；
使用时配制每升增殖培养基取母液Ⅰ，母液Ⅱ，母液Ⅲ各20ml；
(12)200倍的微量元素母液的配制：称取MnSO4·H2O，4.46g；ZnSO4·7H2O，1.72
g；H3BO3 1.24g；Na2MoO4·2H2O 0.05g；CuSO4·5H2O 0.005g，用纯水溶解后定容至1000ml保存，使用时配制每升增殖培养基取5ml；
(13)200倍的EDTA-铁盐母液的配制：称取5.56gFeSO4·7H2O和7.46gNa2-EDTA试剂分别溶解，混合定容至1000mL，使用时配制每升增殖培养基取2.5ml；
(14)200倍的有机成分母液的配制：称取0.4g甘氨酸，0.01g盐酸硫胺素，0.01g盐酸吡哆醇，0.01g烟酸，20g肌醇溶解后混合定容至1000ml，使用时配制每升增殖培养基取5ml；
(15)激素母液的配制：称取0.05g玉米素，先用少量乙醇溶解，然后加水定容至100ml，使用时配制每升增殖培养基取1ml；
(2)按上述步骤（11）至步骤（15）中配制每升增殖培养基的用量加入后，再加入琼脂8g，蔗糖30g，加热溶解后定容至1L，用0.lmol·L-1盐酸调pH至4.9，灭菌；待培养基温度降至70℃时，在接种台上采用过滤灭菌法添加玉米素母液，母液浓度为0.5mg/ml,每升培养基加1.6ml玉米素母液，然后在接种台上分装培养基。
使用方法：将无菌苗在超净台上接种至配制好的灭菌的增殖培养基上，在光照强度3000Lux的条件下培养，培养条件为：温度27-30℃，每日光照时间为16小时。
30天后统计发现植株生长健壮，叶片呈绿色，植株增殖倍数达9.6。
对照例：
将杰兔越橘接种于传统的WPM的增殖培养基中，其培养基成分和含量包括：
大量元素：1071.6 mg·L-1硝酸钾、 900mg·L-1硫酸钾、370mg·L-1硫酸镁、96 mg·L-1氯化钙、 556 mg·L-1硝酸钙、170 mg·L-1磷酸二氢钾；
微量元素：22.3 mg·L-1硫酸锰、8.6 mg·L-1硫酸锌、0.025 mg·L-1硫酸铜、0.25 mg·L-1钼酸钠、6.2mg·L-1硼酸；
铁盐：37.3 mg·L-1乙二胺四乙酸二钠、27.8 mg·L-1硫酸亚铁；
有机物：0.5 mg·L-1烟酸、0.5 mg·L-1盐酸硫胺素、0.5 mg·L-1盐酸毗哆醇、l00 mg·L-1肌醇、2 mg·L-1甘氨酸；
蔗糖30 g·L-1，琼脂7 g·L-1
玉米素0.5mg·L-1 ；
其余为蒸馏水，pH为5.4；
制备方法如下：
（1）配制改良WPM培养基：
(11)50倍大量元素母液的配制：分别称取KNO3，53.58g；K2SO4，45g；MgSO4，18.5g；然后用纯水溶解后定容至1000ml，配成母液Ⅰ；
称取CaCl2·2H2O，4.8g；Ca（NO3）2·4H2O，27.8g；用纯水溶解后定容至1000ml，配成母液ⅡⅤ；Ⅳ
称取KH2PO4，8.5g用纯水溶解后定容至1000ml为母液Ⅲ；
使用时配制每升增殖培养基取母液Ⅰ，母液Ⅱ，母液Ⅲ各20ml；
(12)200倍的微量元素母液的配制：称取MnSO4·H2O，4.46g；ZnSO4·7H2O，1.72
g；H3BO3 1.24g；Na2MoO4·2H2O 0.05g；CuSO4·5H2O 0.005g，用纯水溶解后定容至1000ml保存，使用时配制每升增殖培养基取5ml；
(13)200倍的EDTA-铁盐母液的配制：称取5.56gFeSO4·7H2O和7.46gNa2-EDTA试剂分别溶解，混合定容至1000mL，使用时配制每升增殖培养基取2.5ml；
(14)200倍的有机成分母液的配制：称取0.4g甘氨酸，0.01g盐酸硫胺素，0.01g盐酸吡哆醇，0.01g烟酸，20g肌醇溶解后混合定容至1000ml，使用时配制每升增殖培养基取5ml；
(15)激素母液的配制：称取0.05g玉米素，先用少量乙醇溶解，然后加水定容至100ml，使用时配制每升增殖培养基取1ml；
(2)按上述步骤（11）至步骤（15）中配制每升增殖培养基的用量加入后，再加入琼脂7g，蔗糖30g，加热溶解后定容至1L，用0.lmol·L-1盐酸调pH至5.4，灭菌；待培养基温度降至60℃时，在接种台上采用过滤灭菌法添加玉米素母液，母液浓度为0.5mg/ml,每升培养基加1ml玉米素母液，然后在接种台上分装培养基。
使用方法：将无菌苗在超净台上接种至配制好的灭菌的增殖培养基上，在光照强度3000Lux的条件下培养，培养条件为：温度25-27℃，每日光照时间为16小时。
30天后统计发现植株生长缓慢，叶片偏黄，植株增殖倍数为4.4。
Claims (4)
1.一种杰兔越橘组织培养的增殖培养基，其特征在于，包括如下组分：改良WPM培养基+玉米素0.5-0.8mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂8-9 g·L-1，pH为4.8-5.0。
2.根据权利要求1所述的杰兔越橘组织培养的增殖培养基，其特征在于：所述的改良WPM基本培养基包括如下组分：
大量元素：1071.6 mg·L-1硝酸钾、 370 mg·L-1硫酸镁、96 mg·L-1氯化钙、 170mg磷酸二氢钾；
微量元素：22.3 mg·L-1硫酸锰、8.6 mg·L-1硫酸锌、0.025 mg·L-1硫酸铜、0.25mg钼酸钠、6.2 mg·L-1硼酸；
铁盐：37.3 mg·L-1乙二胺四乙酸二钠、27.8 mg·L-1硫酸亚铁；
有机物：0.5 mg·L-1烟酸、0.5 mg·L-1盐酸硫胺素、0.5 mg·L-1盐酸毗哆醇、l00 mg·L-1肌醇、2 mg·L-1甘氨酸；
蔗糖30 g·L-1，琼脂8 g·L-1，玉米素0.5 mg·L-1 ；
其余为蒸馏水，pH为4.8-5.0。
3.权利要求1所述的杰兔越橘组织培养的增殖培养基的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
（1）配制改良WPM培养基：
(11)50倍大量元素母液的配制：分别称取KNO3，53.58g；MgSO4，18.5g；然后用纯水溶解后定容至1000ml，配成母液Ⅰ；
称取CaCl2·2H2O，4.8g，用纯水溶解后定容至1000ml，配成母液ⅡⅤ；Ⅳ
称取KH2PO4，8.5g用纯水溶解后定容至1000ml为母液Ⅲ；
使用时配制每升增殖培养基取母液Ⅰ，母液Ⅱ，母液Ⅲ各20ml；
(12)200倍的微量元素母液的配制：称取MnSO4·H2O，4.46g；ZnSO4·7H2O，1.72
g；H3BO3 1.24g；Na2MoO4·2H2O 0.05g；CuSO4·5H2O 0.005g，用纯水溶解后定容至1000ml保存，使用时配制每升增殖培养基取5ml；
(13)200倍的EDTA-铁盐母液的配制：称取5.56gFeSO4·7H2O和7.46gNa2-EDTA试剂分别溶解，混合定容至1000mL，使用时配制每升增殖培养基取2.5ml；
(14)200倍的有机成分母液的配制：称取0.4g甘氨酸，0.01g盐酸硫胺素，0.01g盐酸吡哆醇，0.01g烟酸，20g肌醇溶解后混合定容至1000ml，使用时配制每升增殖培养基取5ml；
(15)激素母液的配制：称取0.05g玉米素，先用少量乙醇溶解，然后加水定容至100ml，使用时配制每升增殖培养基取1ml；
(2)按上述步骤（11）至步骤（15）中配制每升增殖培养基的用量加入后，再加入琼脂8g，蔗糖30g，加热溶解后定容至1L，用0.lmol·L-1盐酸调pH至4.8-5.0，灭菌；待培养基温度降至60-70℃时，在接种台上采用过滤灭菌法添加玉米素母液，母液浓度为0.5mg/ml,每升培养基加1-1.6ml玉米素母液，然后在接种台上分装培养基。
4.权利要求1所述杰兔越橘组织培养的增殖培养基的使用方法，其特征在于，将无菌苗在超净台上接种至配制好的灭菌的增殖培养基上，在光照强度3000Lux的条件下培养，培养条件为：温度27-30℃，每日光照时间为16小时。
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