CN104381127B - 一种获得红色马铃薯突变体的方法及所用诱变培养基 - Google Patents
一种获得红色马铃薯突变体的方法及所用诱变培养基 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种获得红色马铃薯突变体的方法及所用诱变培养基，属于农业生物技术领域。本发明的诱变培养基是在再生培养基的基础上添加30-40mg/L的平阳霉素。本发明获得红色马铃薯突变体的方法，是将紫色马铃薯方片置于诱变培养基培养15天，然后移至再生培养基上培养；培养条件：22±2℃、光照强度700lx、光照时间8h/d、相对湿度65-75%。采用本发明的诱导培养基及诱导方法，诱导15天后，则能诱导紫色马铃薯发生突变，通过进一步培养则能获得能够结出红色块茎的马铃薯再生苗。
Description
技术领域
本发明涉及一种获得红色马铃薯突变体的方法及所用诱变培养基，属于农业生物技术领域。
背景技术
马铃薯是世界第四大粮食作物，也是我国食物安全体系的重要组成部分。马铃薯营养丰富，有“地下苹果”之称。马铃薯含有丰富的抗氧化剂，主要的氧化剂是酚类，抗坏血酸，类胡萝卜素，生育酚，α-硫辛酸，和硒。多酚类的抗氧化剂主要是L-酪氨酸，咖啡酸，绿原酸等。而彩色马铃薯除了含有上述抗氧剂外，还富含具有明显抗氧化作用的保健型天然花青素色素，它的含量是普通白肉马铃薯的两至三倍，甚至更高。另外，彩色马铃薯不仅具有普通马铃薯的优良特性，并且肉质鲜艳，外观诱人，逐渐受到人们的喜爱。除原产地安第斯外，其他地区的彩色马铃薯资源很少，中国也不例外，并且种植品种单一，主要为黄色薯肉的马铃薯品种。由于中国国情的需要，前期的育种目标主要以高产为主。近年来，随着生活水平的提高，人们开始选择更为健康的饮食，逐渐关注具有营养保健作用的彩色马铃薯品种。我国通过品种引进等方式获得了彩色马铃薯品种，但是这些品种数量很少，且多为晚熟品种，在我国表现为产量和品质较低。所以通过诱变途径获得新的彩色马铃薯品种可以丰富马铃薯市场，满足人们的需要。
目前诱变马铃薯突变体的主要采用EMS诱变和辐照技术，由于EMS具有极强的毒性，并且所获的变异株容易恢复，所以应用受到限制。而辐照技术多产生负面的变异，正面的变异很少。
发明内容
为了获得彩色马铃薯的突变体，本研究利用紫色马铃薯薯块为材料，采用离体诱变技术与平阳霉素再生技术相结合的方式，获得了红皮红肉的马铃薯突变体。
本发明技术方案如下：
一种诱变培养基，在每升再生培养基的基础上添加30-40mg平阳霉素；
所述再生培养基包括无机物、有机物、植物激素、蔗糖和倍力凝；
所述无机物包括浓度范围在165-2108mg/L的大量元素氮、磷、钾、硫、钙、镁的硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、氯化物，浓度范围在0.025-38mg/L的微量元素碘、硼、锰、锌、钠、铜、铁、钼、钴；
所述有机物包括谷氨酰胺、水解酪蛋白、酵母提取物、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸中的一种或两种以上；
所述植物激素包括玉米素、萘乙酸、6-苄氨基腺嘌呤、激动素、吲哚丁酸中的一种或两种以上。
上述诱变培养基，优选的，所用再生培养基由以下组分组成；
（1）无机物
大量元素
硝酸钾1900-2108mg/L
硝酸铵1600-1700mg/L
磷酸二氢钾165-175mg/L
硫酸镁360-380mg/L
氯化钙430-450mg/L；
微量元素
碘化钾0.8-0.9mg/L
硼酸5.5-6.5mg/L
硫酸锰16-17.5mg/L
硫酸锌9-10mg/L
钼酸钠0.2-0.3mg/L
硫酸铜0.02-0.03mg/L
氯化钴0.02-0.03mg/L
硫酸亚铁27-28mg/L
乙二胺四乙酸二钠37-38mg/L；
（2）有机物
水解酪蛋白0-300mg/L
酵母提取物0-500mg/L
水解乳蛋白0-500mg/L
肌醇80-120mg/L
烟酸0.4-0.6mg/L
盐酸吡哆醇0.4-0.6mg/L
盐酸硫胺素0.05-0.15mg/L
甘氨酸1-2mg/L；
（3）植物激素
6-苄氨基腺嘌呤1-4mg/L
萘乙酸0.001-0.1mg/L
激动素0-2.0mg/L
玉米素1-4mg/L
吲哚乙酸0.5-2mg/L
（4）蔗糖25-35g/L；
（5）倍力凝3.5-4.5g/L。
更优选的，所用再生培养基由以下组分组成；
（1）无机物
大量元素
硝酸钾2108mg/L
硝酸铵1650mg/L
磷酸二氢钾170mg/L
硫酸镁370mg/L
氯化钙440mg/L；
微量元素
碘化钾0.83mg/L
硼酸6.0mg/L
硫酸锰16.9mg/L
硫酸锌9.6mg/L
钼酸钠0.25mg/L
硫酸铜0.025mg/L
氯化钴0.025mg/L
硫酸亚铁27.8mg/L
乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；
（2）有机物
水解酪蛋白100mg/L
酵母提取物250mg/L
水解乳蛋白100mg/L
肌醇100mg/L
烟酸0.5mg/L
盐酸吡哆醇0.5mg/L
盐酸硫胺素0.1mg/L
甘氨酸2mg/L；
（3）植物激素
6-苄氨基腺嘌呤1.0mg/L
萘乙酸0.005mg/L
激动素0.5mg/L
玉米素4mg/L
吲哚乙酸1mg/L
（4）蔗糖30g/L；
（5）倍力凝4g/L。
上述诱变培养基，其中平阳霉素的浓度优选为37.5mg/L。
上述诱变培养基配制方法：按照配方准确称量各组分，加去离子水充分溶解，定容，调整pH至5.8-6.0，分装，121℃灭菌15分钟；所用试剂为分析纯。
上述诱变培养基，是在再生培养基的基础上添加了特定量的平阳霉素。没有添加平阳霉素的再生培养基，仅能够将马铃薯茎块培育出没有发生突变的再生苗；而添加了平阳霉素的诱导培养基，诱导15天后，则能诱导紫色马铃薯发生突变，通过进一步培养则能获得能够结出红色块茎的马铃薯再生苗。而且，本发明通过进一步研究发现，激素种类和水平、平阳霉素的浓度和诱导时间决定了诱导结果；如果激素种类和水平、平阳霉素的浓度任何一因素超出本发明所限定的范围则无法获得目标再生苗“能够结出红色马铃薯的再生苗”。
一种获得红色马铃薯突变体的方法，
将紫色马铃薯方片置于诱变培养基培养15天，然后移至再生培养基上培养；培养条件：22±2℃、光照强度700lx、光照时间8h/d、相对湿度65-75%；
所述再生培养基为本发明上述的任意一种再生培养基；
所述诱变培养基为本发明上述的任意一种诱变培养基。
所述培养条件是指诱变培养条件和再生培养条件。
上述方法，在再生培养基上的培养时间根据再生苗的生长态势而定。本发明中，在再生培养基上的培养时间为两个月。
本发明的方法，采用先诱变培养15天，然后再在再生培养基上培养；二者的顺序不能颠倒，否则无法获得目标再生苗。诱变培养的时间也不能改变，否则也无法获得目标再生苗。本发明的光照培养条件，显著提高了再生苗数量。
上述方法，其具体步骤为：
待处理样品的准备：取收获30天、还未发芽的紫色马铃薯块茎为材料；先用自来水将其表面冲洗干净，然后用自来水连续冲洗30分钟以上，接着用0.1%的升汞或次氯酸钠溶液表面灭菌10分钟，最后在无菌条件下用无菌水彻底冲洗3-5次；在无菌条件下，用解剖刀将紫色马铃薯块茎的皮切掉，切掉薯皮的厚度在1mm以上；然后将中间的薯肉切成长0.5cm、宽0.5cm、厚度0.1cm的方片，即得紫色马铃薯方片；
块茎切片接种：将紫色马铃薯方片放置在本发明的块茎诱导突变体的培养基上，在温度为22±2℃,光照强度700lx，光照时间8h/d，相对湿度65-75%的培养室内培养15天后移至再生培养基上。
将切掉薯皮的厚度限定在1mm以上，是为了防止块茎的芽眼组织的存在。
附图说明
图1为紫色马铃薯及其红色突变体（红色马铃薯）的外貌图；
图2为紫色马铃薯及其红色突变体（红色马铃薯）的切面图。
具体实施方式
实施例1
称取：
（1）无机物：硝酸钾2108mg，硝酸铵1650mg，磷酸二氢钾170mg，硫酸镁370mg，氯化钙440mg，碘化钾0.83mg，硼酸6.0mg，硫酸锰16.9mg，硫酸锌9.6mg，钼酸钠0.25mg，硫酸铜0.025mg，氯化钴0.025mg，硫酸亚铁27.8mg，乙二胺四乙酸二钠37.3mg；
（2）有机物：水解酪蛋白100mg，酵母提取物250mg，水解乳蛋白100mg，肌醇100mg，烟酸0.5mg，盐酸吡哆醇0.5mg，盐酸硫胺素0.1mg，甘氨酸2mg；
（3）植物激素：6-苄氨基腺嘌呤1.0mg，萘乙酸0.005mg，激动素0.5mg，吲哚乙酸1.0mg，玉米素4mg；
（4）蔗糖30g；
（5）倍力凝4g；
配制方法：将称取的各组分加去离子水充分溶解，定容至1L，调整pH至5.8-6.0，分装，121℃灭菌15分钟，得再生培养基；
还可以先将称取的无机物、有机物和植物激素加去离子水充分溶解配成母液，再加入其余组分充分溶解，定容1L，调整pH至5.8-6.0，分装，灭菌得再生培养基。
实施例2
称取：
（1）无机物：硝酸钾1900mg，硝酸铵1650mg，磷酸二氢钾170mg，硫酸镁370mg，氯化钙440mg，碘化钾0.83mg，硼酸6.0mg，硫酸锰16.9mg，硫酸锌9.6mg，钼酸钠0.25mg，硫酸铜0.025mg，氯化钴0.025mg，硫酸亚铁27.8mg，乙二胺四乙酸二钠37.3mg；
（2）有机物：肌醇100mg，烟酸0.5mg，盐酸吡哆醇0.5mg，盐酸硫胺素0.1mg，甘氨酸2mg；
（3）植物激素：6-苄氨基腺嘌呤1.0mg，萘乙酸0.01mg，激动素0.5mg，吲哚乙酸1.0mg，玉米素4mg；
（4）蔗糖30g；
（5）倍力凝4g；
配置方法：同实施例1。
实施例3
称取：
（1）无机物：硝酸钾1900mg，硝酸铵1600mg，磷酸二氢钾175mg，硫酸镁360mg，氯化钙430mg，碘化钾0.83mg，硼酸6.0mg，硫酸锰16.9mg，硫酸锌9.6mg，钼酸钠0.25mg，硫酸铜0.025mg，氯化钴0.025mg，硫酸亚铁27.8mg，乙二胺四乙酸二钠37.3mg；
（2）有机物：肌醇100mg，烟酸0.5mg，盐酸吡哆醇0.5mg，盐酸硫胺素0.1mg，甘氨酸1mg；
（3）植物激素：6-苄氨基腺嘌呤1.0mg，萘乙酸0.005mg，激动素0.5mg，吲哚乙酸1.0mg，玉米素4mg；
（4）蔗糖30g；
（5）倍力凝3.5g；
配置方法：同实施例1。
实施例4
称取：
（1）无机物：硝酸钾2108mg，硝酸铵1700mg，磷酸二氢钾165mg，硫酸镁380mg，氯化钙450mg，碘化钾0.83mg，硼酸6.0mg，硫酸锰16.9mg，硫酸锌9.0mg，钼酸钠0.25mg，硫酸铜0.025mg，氯化钴0.025mg，硫酸亚铁27.8mg，乙二胺四乙酸二钠37.3mg；
（2）有机物：水解酪蛋白100mg，酵母提取物250mg，水解乳蛋白200mg，肌醇100mg，烟酸0.5mg，盐酸吡哆醇0.5mg，盐酸硫胺素0.1mg，甘氨酸2mg；
（3）植物激素：6-苄氨基腺嘌呤1.0mg，萘乙酸0.01mg，激动素0.5mg，吲哚乙酸1.0mg，玉米素4mg；
（4）蔗糖30g；
（5）倍力凝4.5g；
配置方法：同实施例1。
实施例5
采用实施例1的配比和配置方法制备五份再生培养基（每份为1L），然后分别加入20mg、30mg、37.5mg、40mg、55mg平阳霉素；即得相应的诱变培养基D1、A1、A2、A3、D2；
分别采用实施例2-4的配比和配置方法制备再生培养基（每份为1L），然后均加入37.5mg平阳霉素；即得相应的诱变培养基A4、A5、A6。
诱变实验
步骤一、待处理样品的准备：
取收获30天、还未发芽的紫色马铃薯块茎为材料，先用自来水将其表面冲洗干净。然后用自来水连续冲洗30分钟以上，接着用0.1%的生汞表面灭菌10分钟（也可用次氯酸钠溶液），最后在无菌条件下用无菌水彻底冲洗3-5次。在无菌条件下，用解剖刀将紫色马铃薯块茎的皮切掉。为了防止块茎的芽眼组织的存在，切掉薯皮的厚度应在1mm以上。然后将中间的薯肉切成长0.5cm、宽0.5cm、厚度0.1cm的方片，即得紫色马铃薯方片；
步骤二、诱变、再生培养
诱变、再生培养（1）：将8块紫色马铃薯方片分别放置在诱变培养基A1、A2、A3、A4、A5、A6、D1、D2上培养15天；然后移至相应的再生培养基上培养两个月；分别获得再生苗；培养条件：22℃,光照强度700lx，光照时间8h/d，相对湿度70%；
诱变、再生培养（2）：将一块紫色马铃薯方片放置在诱变培养基A2上培养15天；然后移至相应的再生培养基上培养两个月获得再生苗;培养条件：22℃,自然光照条件，相对湿度70%；
诱变、再生培养（3）：将一块紫色马铃薯方片放置在诱变培养基A2上培养5天后，然后移至相应的再生培养基上，培养条件：22℃,光照强度700lx，光照时间8h/d，相对湿度70%。
诱变、再生培（4）：将一块紫色马铃薯方片放置在诱变培养基A2上培养20天后，然后移至相应的再生培养基上，培养条件：22℃,光照强度700lx，光照时间8h/d，相对湿度70%。
步骤二中，所述“移至相应的再生培养基”是指：将在诱变培养基A1、A2、A3、D1、D2培养过的马铃薯方片均转移至实施例1制备的再生培养基；将在诱变培养基A4培养过的马铃薯方片均转移至实施例2制备的再生培养基；将在诱变培养基A5培养过的马铃薯方片均转移至实施例3制备的再生培养基；将在诱变培养基A6培养过的马铃薯方片均转移至实施例4制备的再生培养基；
按照上述实验步骤进行多次实验；统计在不同培养条件下获得的再生苗的平均数量占所接种块茎数的百分比；然后将再生苗在相同的条件下栽培，观察所收获的马铃薯块茎的颜色；结果如表1所示。
表1，不同诱变、再生培养条件下马铃薯再生情况
。
Claims (3)
1.一种获得红色马铃薯突变体所用诱变培养基，其特征在于，在每升再生培养基的基础上添加30-40mg平阳霉素；
所用再生培养基由以下组分组成；
（1）无机物
大量元素
硝酸钾1900-2108mg/L
硝酸铵1600-1700mg/L
磷酸二氢钾165-175mg/L
硫酸镁360-380mg/L
氯化钙430-450mg/L；
微量元素
碘化钾0.8-0.9mg/L
硼酸5.5-6.5mg/L
硫酸锰16-17.5mg/L
硫酸锌9-10mg/L
钼酸钠0.2-0.3mg/L
硫酸铜0.02-0.03mg/L
氯化钴0.02-0.03mg/L
硫酸亚铁27-28mg/L
乙二胺四乙酸二钠37-38mg/L；
（2）有机物
水解酪蛋白0-300mg/L
酵母提取物0-500mg/L
水解乳蛋白0-500mg/L
肌醇80-120mg/L
烟酸0.4-0.6mg/L
盐酸吡哆醇0.4-0.6mg/L
盐酸硫胺素0.05-0.15mg/L
甘氨酸1-2mg/L；
其中，水解酪蛋白、酵母提取物和水解乳蛋白同时存在或同时不存在；
（3）植物激素
6-苄氨基腺嘌呤1-4mg/L
萘乙酸0.001-0.1mg/L
激动素0.5-2.0mg/L
玉米素1-4mg/L
吲哚乙酸0.5-2mg/L
（4）蔗糖25-35g/L；
（5）倍力凝3.5-4.5g/L。
2.根据权利要求1所述诱变培养基，其特征在于，所用再生培养基由以下组分组成；
（1）无机物
大量元素
硝酸钾2108mg/L
硝酸铵1650mg/L
磷酸二氢钾170mg/L
硫酸镁370mg/L
氯化钙440mg/L；
微量元素
碘化钾0.83mg/L
硼酸6.0mg/L
硫酸锰16.9mg/L
硫酸锌9.6mg/L
钼酸钠0.25mg/L
硫酸铜0.025mg/L
氯化钴0.025mg/L
硫酸亚铁27.8mg/L
乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；
（2）有机物
水解酪蛋白100mg/L
酵母提取物250mg/L
水解乳蛋白100mg/L
肌醇100mg/L
烟酸0.5mg/L
盐酸吡哆醇0.5mg/L
盐酸硫胺素0.1mg/L
甘氨酸2mg/L；
（3）植物激素
6-苄氨基腺嘌呤1.0mg/L
萘乙酸0.005mg/L
激动素0.5mg/L
玉米素4mg/L
吲哚乙酸1mg/L
（4）蔗糖30g/L；
（5）倍力凝4g/L。
3.根据权利要求1或2所述诱变培养基，其特征在于，其中平阳霉素的浓度为37.5mg/L。
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200313 Address after: 32 sangyuan Road, Licheng District, Jinan City, Shandong Province Patentee after: Shandong shenchuang Agricultural Technology Co., Ltd Address before: Industrial Road Licheng District, Ji'nan city of Shandong Province, No. 202 250100 Patentee before: VEGETABLE RESEARCH INSTITUTE OF SHANDONG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20211018 Address after: No. 202, Gongye North Road, Jinan City, Shandong Province Patentee after: SHANDONG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES Address before: 32 sangyuan Road, Licheng District, Jinan City, Shandong Province Patentee before: Shandong shenchuang Agricultural Technology Co.,Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right |