CN105075865A - 一种蓝莓美登初代培养的培养基及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蓝莓美登初代培养的培养基，按照质量百分比由以下组分组成：改良WPM培养基12.724%、玉米素0.01%、吲哚丁酸0.002%、葡萄糖74.79%、植物凝胶12.474%。本发明还公开了上述培养基的制备方法和应用。本发明的培养基中的激素配比合理，将初代培养和生根培养合为一步，初代培养的过程中茎段就能够生根，简化培养流程，缩短培养时间；使用此初代培养基提高初代培养植株的萌芽数，植株生长健壮，有利于下一步继代扩繁。

Description

一种蓝莓美登初代培养的培养基及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于组织培养技术领域，特别涉及一种蓝莓美登初代培养的培养基及其制备方法和应用。

背景技术

在蓝莓组织培养快繁的过程中，最重要的是第一步，初代培养。初代培养的成功与否直接决定后期组培苗的快繁。而初代培养中培养基配方是至关重要的，直接关系到影响初代苗木的成活率以及蓝莓植株的繁殖系数以及繁殖的速度。目前针对不同的蓝莓品种，已经报道的初代培养的培养基有许多种。但是目前已经公开发表的培养基的配方都是针对不同的品种而言的，并不是一种培养基配方就适合所有的蓝莓初代培养。因此每一个不同的蓝莓品种都需要针对其品种特点有不同的培养基配方。与此同时，蓝莓生根非常难，无论是组培苗还是大田植株，生根都比较困难，因此在初代培养阶段的培养基也要有利于蓝莓的生根才能够使蓝莓更好的的成活增殖。

美登(Blomidon)，矮丛蓝莓品种。加拿大农业部肯特维尔研究中心从野生矮丛蓝莓品种Augusta与451杂交育成，中熟种。果实圆形、淡蓝色，果粉多，有香味，风味好。树势强，丰产。株产1-2kg。抗寒力极强，在我国东北大小兴安岭和长白山区可安全露地越冬。为高寒山区发展蓝莓的首推品种。目前已发表的关于美登蓝莓的相关文献资料中，还没有专门针对美登的组织培养快繁而试验的培养基配方。因此美登的组织培养快繁培养基配方目前还属空白。本发明通过多次试验，研究出最适合蓝莓‘美登’的初代培养基配方。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的第一个技术问题是提供了一种蓝莓美登初代培养的培养基。本发明经过试验获得蓝莓‘美登’的初代培养快培养基配方，解决生产上蓝莓‘美登’苗木的快速繁殖问题，为蓝莓‘美登’提供更多优质苗木，创造更大经济效益。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供了一种蓝莓美登初代培养的培养基的制备方法。

本发明所要解决的第三个技术问题是提供了一种蓝莓美登初代培养的培养基在培养蓝莓美登方面的应用。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种蓝莓美登初代培养的培养基，按照质量百分比由以下组分组成：改良WPM培养基12.724％、玉米素0.01％、吲哚丁酸0.002％、葡萄糖74.79％、植物凝胶12.474％。

其中，改良WPM培养基按照质量百分比包括大量元素74.1％～74.9％、微量元素1.27％～1.39％、铁盐0.35％～0.425％、钙盐19.5％～19.71％、有机物3.76～4.57％。本发明经过多次试验，筛选出最适合蓝莓‘美登’初代培养的培养基配方。改良WPM培养基，是根据已经报道的WPM培养基配方的基础上，根据蓝莓生长的特殊需要改进得到的。

其中，所述大量元素包括KNO₃900～1100mg/L、(NH4)₂SO₄270～330mg/L、MgSO₄·7H2O360～440mg/L和KH₂PO₄180～220mg/L。优选地，本发明的大量元素(KNO₃硝酸钾1000mg/L、(NH4)₂SO₄硫酸铵300mg/L、MgSO₄·7H₂O七水合硫酸镁400mg/L、KH₂PO₄磷酸二氢钾200mg/L)；和原来的WPM培养基相比较，原来的培养基大量元素(KNO₃硝酸钾400mg/L、MgSO₄·7H₂O七水合硫酸镁370mg/L、KH₂PO₄磷酸二氢钾170mg/L、K₂SO4硫酸钾900mg/L)，四种药品营养不均衡，尤其是N元素含量低，不利于蓝莓生长，因此改良后添加(NH4)₂SO4硫酸铵300mg/L，而去掉K₂SO4硫酸钾，因为钾元素在KNO₃硝酸钾中能够充分提供。

其中，所述微量元素包括KI1.0～1.1mg/L、MnSO₄·4H₂O18～22mg/L、ZnSO₄·7H₂O6～10mg/L、H₃BO₃4～6mg/L。(优选地，KI碘化钾1.1mg/L、MnSO4.4H2O四水合硫酸锰20mg/L、ZnSO4.7H2O七水合硫酸锌8mg/L、H3BO3硼酸5mg/L)；原有的微量元素(1.1mg/L、MnSO4.H2O水合硫酸锰22.3mg/L、ZnSO4.7H2O七水合硫酸锌8.6mg/L、H3BO3硼酸6.2mg/L、CuSO4.5H2O五水合硫酸铜0.025mg/L，NaMoO4钼酸钠0.25mg/L)这个配方没有常用的微量元素KI碘化钾，根据我们的试验，添加碘化钾对植物生长有好处，因此添加了碘化钾，五水合硫酸铜0.025mg/L，NaMoO4钼酸钠0.25mg/L这两个物质在培养基中用的量非常少，去掉这两个物质发现植株生长没有变化，因此为了配置母液更加便利，去掉了这两个物质。

其中，所述铁盐为乙二胺邻二羟基乙酸铁。(原有的配方需要硫酸亚铁27.8mg/L和乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L配置，过程繁琐，而且乙二胺四乙酸二钠不溶于水，配制时时间较长)，新的培养基直接使用Fe-EDDHA乙二胺邻二羟基乙酸铁10mg/L，配置过程简单，植物生长效果更好。

其中，所述钙盐为二水合氯化钙。原有培养基用氯化钙150mg/L和硝酸钙556mg/L配置，改进后直接用CaCl2.2H2O二水合氯化钙500mg/L就能够满足植物对钙元素的需求，而且配制更方便)；

其中，所述有机物为肌醇80～120mg/L、烟酸0.8～1.2mg/L、维生素B10.4～0.6mg/L、维生素B60.8～1.2mg/L、维生素C4～6mg/L。有机元素和原有的配方比较，增加了维生素C元素，维生素C的增加，能够延缓植株茎段衰老，并且抑制茎段的褐化，在培养过程中极大提高茎段的成活率。

ZT：玉米素(Zeatin)是存在于高等植物的一种天然植物细胞分裂素不仅促进侧芽生长，刺激细胞分化(侧端优势)，促进愈伤组织和种子发芽，还能防止叶片衰老，逆转芽部受到的毒素伤害和抑制过度根部形成。高浓度的玉米素还能产生不定芽分化。

IBA：吲哚丁酸，是组织培养中常用的植物生长调节剂。能够刺进植物生根本。试验中配制成1mg/mL的母液供配制培养基使用。

不同于以往试验，本实验中用葡萄糖代替蔗糖，蓝莓植株生长更健壮。

植物凝胶Phytagel从假单胞菌分泌而来的一种琼脂的替代物，是葡萄糖醛酸、鼠李糖和葡萄糖的混合物，具有无色、透亮和高韧性的特点，用于蓝莓的组织培养中能够使培养基的酸碱度更加稳定，蓝莓植株更好生长。

培养基PH值：蓝莓‘美登’组织培养对PH值的要求比较严格，过高或者过低都会造成植株生长不好，或者死亡，因此一定要精准调节PH值。

其中，所述培养基的pH值为5.4～5.6。

上述的一种蓝莓美登初代培养的培养基的制备方法，包括以下步骤：将上述的组分按照要求的量加入每种材料，煮沸使所有材料充分混匀溶解，调培养基PH到5.4～5.6，分装在需要的容器中进行高温高压灭菌20分钟。

上述的一种蓝莓美登初代培养的培养基在培养蓝莓美登方面的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下的特色及优点：本发明的培养基中的激素配比合理，将初代培养和生根培养合为一步，初代培养的过程中茎段就能够生根，简化培养流程，缩短培养时间；使用此初代培养基提高初代培养植株的萌芽数，植株生长健壮，有利于下一步继代扩繁。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。

实施例1一种蓝莓美登初代培养的培养基

改良WPM培养基12.724％、玉米素0.01％、吲哚丁酸0.002％、葡萄糖74.79％、植物凝胶12.474％。所述的改良WPM培养基按照质量百分比包括大量元素、微量元素、铁盐、钙盐、有机物。其中，大量元素占全部WPM培养基质量的74.9％，包括KNO₃硝酸钾1000mg/L、(NH4)₂SO₄硫酸铵300mg/L、MgSO₄·7H₂O七水合硫酸镁400mg/L、KH₂PO₄磷酸二氢钾200mg/L；微量元素占全部WPM培养基质量的1.27％，包括KI碘化钾1.1mg/L、MnSO4.4H2O四水合硫酸锰20mg/L、ZnSO4.7H2O七水合硫酸锌8mg/L、H3BO3硼酸5mg/L；铁盐占全部WPM培养基质量的0.35％，Fe-EDDHA乙二胺邻二羟基乙酸铁10mg/L；钙盐占全部WPM培养基质量的19.71％，CaCl2.2H2O二水合氯化钙500mg/L；有机物占全部WPM培养基质量的3.77％，为肌醇100mg/L、烟酸1mg/L、维生素B10.5mg/L、维生素B61mg/L、维生素C5mg/L。

实施例2：一种蓝莓美登初代培养的培养基

改良WPM培养基12.724％、玉米素0.01％、吲哚丁酸0.002％、葡萄糖74.79％、植物凝胶12.474％。其中，大量元素占全部WPM培养基质量的74.1％，包括KNO₃硝酸钾900mg/L、(NH4)₂SO₄硫酸铵270mg/L、MgSO₄·7H₂O七水合硫酸镁360mg/L、KH₂PO₄磷酸二氢钾180mg/L；微量元素占全部WPM培养基质量的1.39％，包括KI碘化钾1.0mg/L、MnSO4.4H2O四水合硫酸锰18mg/L、ZnSO4.7H2O七水合硫酸锌6mg/L、H3BO3硼酸4mg/L；铁盐占全部WPM培养基质量的0.425％，Fe-EDDHA乙二胺邻二羟基乙酸铁8mg/L；钙盐占全部WPM培养基质量的19.5％，CaCl2.2H2O二水合氯化钙450mg/L；有机物占全部WPM培养基质量的4.585％，有机物为肌醇80mg/L、烟酸0.8mg/L、维生素B10.4mg/L、维生素B60.8mg/L、维生素C4mg/L。

实施例3：一种蓝莓美登初代培养的培养基

改良WPM培养基12.724％、玉米素0.01％、吲哚丁酸0.002％、葡萄糖74.79％、植物凝胶12.474％。其中，大量元素占全部WPM培养基质量的74.1％，包括KNO₃硝酸钾1000mg/L、(NH4)₂SO₄硫酸铵300mg/L、MgSO₄·7H₂O七水合硫酸镁400mg/L、KH₂PO₄磷酸二氢钾200mg/L；微量元素占全部WPM培养基质量的1.27％，包括KI碘化钾1.1mg/L、MnSO4.4H2O四水合硫酸锰20mg/L、ZnSO4.7H2O七水合硫酸锌8mg/L、H3BO3硼酸5mg/L；铁盐占全部WPM培养基质量的0.35％，Fe-EDDHA乙二胺邻二羟基乙酸铁10mg/L；钙盐占全部WPM培养基质量的19.71％，CaCl2.2H2O二水合氯化钙500mg/L；有机物占全部WPM培养基质量的4.57％，为肌醇100mg/L、烟酸1mg/L、维生素B10.5mg/L、维生素B61mg/L、维生素C5mg/L。

实施例4本发明培养基的应用实例

1.培养基配制方法试验过程：

(1)将蓝莓‘美登’的茎段分别接种于附加ZT(2mg/L)+IBA(0.4mg/L)+葡萄糖(15g/L)+植物凝胶(2.5g/L)的MS、WPM、改良的WPM3种不同的基本培养基上，筛选出蓝莓‘美登’初代培养的最适基本培养基。

(2)将蓝莓‘美登’的茎段分别接种于附加不同浓度ZT、IBA培养基上研究不同配比的植物生长调节剂对蓝莓‘美登’初代培养的影响。

蓝莓‘美登’的茎段均接种于250毫升的培养瓶中，每瓶接种5个外植体，每个处理重复三次。30天换新鲜培养基。培养条件为16hr(光)/8hr(暗)，光强2000-3000lx，温度23-25℃。40天后统计茎段分化率、平均苗高、生根率、平均根长、褐化率、死亡率、植株长势。

2.实验结果

从试验结果能够看出，用MS基本培养基和WPM培养基，茎段初代培养效果都不好，而改良以后的培养基中由于添加了维生素C，并且降低了一些眼泪的含量，因此蓝莓初代培养时茎段能够生长良好。附加ZT(2mg/L)+IBA(0.4mg/L)既能够促进茎段生长，又能够使初代培养的植株生根。

表1.不同基本培养基对蓝莓‘美登’初代培养的影响

注：a,b,c表示经Duncan’s测验，P＝0.05水平差异显著。下同。

表2.不同激素配比对蓝莓‘美登’初代培养的影响

实施例5采用实施例1～3的蓝莓美登初代培养的培养基

使用本发明的培养基培养蓝莓‘美登’，组培苗生长健壮，叶片嫩绿，没有死苗的现象。生长过程中植株不容易老化，分株良好。植株较高，荷花率明显降低，死亡率为零。根据表3的实验数据也能够看出改良以后的培养基对蓝莓生长状态的影响。

表3、蓝莓美登初代培养的培养基对蓝莓组培植株生长的影响

上述仅为本发明优选的实施例，并不限制于本发明。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施例来举例说明。而由此方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种蓝莓美登初代培养的培养基，其特征在于，按照质量百分比由以下组分组成：改良WPM培养基12.724%、玉米素0.01%、吲哚丁酸0.002%、葡萄糖74.79%、植物凝胶12.474%。

2.根据权利要求1所述的一种蓝莓美登初代培养的培养基，其特征在于，所述改良WPM培养基按照质量百分比包括大量元素74.1%～74.9%、微量元素1.27%～1.39%、铁盐0.35%～0.425%、钙盐19.5%～19.71%、有机物3.76～4.57%。

3.权利要求1所述的一种蓝莓美登初代培养的培养基，其特征在于，所述大量元素包括KNO₃900～1100mg/L、(NH4)₂SO₄270～330mg/L、MgSO₄·7H2O360～440mg/L和KH₂PO₄180～220mg/L。

4.根据权利要求2所述的一种蓝莓美登初代培养的培养基，其特征在于，所述微量元素包括KI1.0～1.1mg/L、MnSO₄·4H₂O18～22mg/L、ZnSO₄·7H₂O6～10mg/L、H₃BO₃4～6mg/L。

5.根据权利要求2所述的一种蓝莓美登初代培养的培养基，其特征在于，所述铁盐为乙二胺邻二羟基乙酸铁。

6.根据权利要求2所述的一种蓝莓美登初代培养的培养基，其特征在于，所述钙盐为二水合氯化钙。

7.根据权利要求2所述的一种蓝莓美登初代培养的培养基，其特征在于，所述有机物为肌醇80～120mg/L、烟酸0.8～1.2mg/L、维生素B10.4～0.6mg/L、维生素B60.8～1.2mg/L、维生素C4～6mg/L。

8.根据权利要求1所述的一种蓝莓美登初代培养的培养基，其特征在于，所述培养基的pH值为5.4~5.6。

9.权利要求1~8所述的一种蓝莓美登初代培养的培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将上述的组分按照要求的量加入每种材料，煮沸使所有材料充分混匀溶解，调培养基PH到5.4~5.6，分装在需要的容器中进行高温高压灭菌20分钟。

10.权利要求1~8所述的所述的一种蓝莓美登初代培养的培养基在培养蓝莓美登方面的应用。