KR101290257B1 - 생장점 배양 방법을 이용한 블루베리 품종인 블루골드, 엘리자베스, 다로우, 오따드 또는 티프블루의 식물체 형성 방법 - Google Patents

생장점 배양 방법을 이용한 블루베리 품종인 블루골드, 엘리자베스, 다로우, 오따드 또는 티프블루의 식물체 형성 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생장점 배양 방법을 이용한 블루베리 품종인 블루골드, 엘리자베스, 다로우, 오따드 또는 티프블루의 식물체 형성 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 블루베리의 기내 배양시 식물 성장 호르몬 지아틴 또는 지아틴 리보사이드가 첨가된 특정 배지에서 캘러스의 형성 없이 신초를 형성하여 변이가 없는 블루베리 식물체를 단기간에 배양할 수 있는 생장점 배양 방법을 이용한 블루베리 품종인 블루골드, 엘리자베스, 다로우, 오따드 또는 티프블루의 식물체 형성 방법에 관한 것이고, 캘러스 형성 이후에 다신초를 형성하는 일반적인 배양과정을 거치지 않고, 캘러스의 형성 없이 신초를 형성함으로써, 10 ~ 11 개월 걸리는 식물체 형성과정을 5 ~ 6 개월로 단축할 수 있으며, 변이율이 많은 캘러스를 형성하지 않아 우수한 품질의 블루베리 식물체를 다량으로 생산하기에 유용하다.

Description

생장점 배양 방법을 이용한 블루베리 품종인 블루골드, 엘리자베스, 다로우, 오따드 또는 티프블루의 식물체 형성 방법{Method for Plant Formation of Blueberry cv. Bluegold, Elizabeth, Darrow, Woodard or Tifblue through apical meristem culture}
본 발명은 블루베리 품종인 블루골드, 엘리자베스, 다로우, 오따드 또는 티프블루의 식물체 형성 방법에 관한 것이다.
블루베리(Vaccinium spp.)는 진달래과(family Ericaceae) 산앵도나무속(genus Vaccinium) 시아노코커스절(sections Cyanoccous)에 속하는 관목성 작물로 타임지 선정 세계 10대 슈퍼푸드 중 하나로써 안토시아닌, 래스베리톨 등의 유효성분에 의해 그 효용 가치를 인정받아 21세기형 과수로도 불리고 있다. 뛰어난 생체조절 기능으로는 시력 회복 및 증진, 망막의 변성과 백내장 방지, 발암 억제, 항산화 작용 등을 들 수 있다.
산앵도나무속은 위와 같이 4개의 절로 나뉘며 그 중 하나의 아속(subgenus)인 실제 블루베리(True blueberries = Cyanococcus)는 미국 동부에 많은 하이부시블루베리(highbush blueberry, V. corymbosum, 미국 북동부와 캐나다에 많은 로우부시블루베리(lowbush blueberry, V. angustifolium, Georgia 주 등 온난한 지역에서 자라는 래빗아이블루베리(rabbiteye blueberry, V. ashie.)로 나뉜다. 북아메리카 및 핀란드 등 유럽 각 지역이 원산지로 알려진 블루베리는 과실의 맛과 효능이 널리 알려지기 시작해서 1950 년대 이후에 품종 개발이 진행되어 현재 약 200 여 종이 알려져 있다. 한국에서 상업적 재배가 가능한 블루베리의 종은 하이부시종으로 하이부시계 블루베리는 주로 다음과 같이 나뉜다. 한냉한 지역에서 잘 자라는 북부하이부시계 블루베리, 추위가 약한 지역에서 잘 자라는 남부하이부시계 블루베리, 반수고 하이부시계 블루베리, 레빗아이계 블루베리로 나뉜다.
고기능성 신소득 작목으로 국내에는 2000년 이후 본격적으로 도입되어 재배가 시작되었으며, 2010년 전체 재배면적은 534 ha(충북 56 ha)으로 3년 만에 5배 정도 급증하여 묘목 품귀현상이 있을 정도로 관심이 집중되고 있다. 국내 수입량 또한 매년 증가하고 있으며, 생과뿐 만 아니라 와인, 잼 등의 가공식품에 대한 수요도 급증하고 있다.
블루베리 묘목은 2년생이 주당 1 ~ 2만원 정도로 초기 재배 비용 중 묘목비가 차지하는 비율이 높아 농가 경영에 큰 부담을 차지하고 있다. 또한 수요에 비해 묘목 공급이 부족하고, 국산 삽목묘의 품질이 떨어져 중국, 미국, 일본으로부터 묘목과 삽수가 수입되는 등 재배 농가가 큰 어려움을 겪고 있는 실정이다.
특히 중국산 블루베리 묘목에서 BlSV(Blueberry scorch virus)가 검역과정에서 검출되면서 2008년 이후 식물검역 관리병해충에 추가 지정되어 수입산 묘목의 소독폐기반송 조치 사례가 증가하고 있다.
따라서 virus-free한 무병주로써 삽목묘보다 뿌리 생육 등이 강건하고 초기 생장속도가 훨씬 빠르며 조기 수확이 가능할 뿐만 아니라 과실품질이나 내병성 등이 우수하다는 평가를 받는 블루베리 조직배양묘의 국내 생산 기술 확보가 매우 중요하다.
국내 적응성이 뛰어나고 비교적 많은 재배면적을 차지하는 하이부시 계통 3품종(블루골드, 엘리자베스, 다로우)과 래빗아이 계통 2품종(오따드, 티프블루)의 품종별 특성은 <표 1>과 같다.
블루베리 하이부시 계통 3품종(블루골드, 엘리자베스, 다로우)과 래빗아이 계통 2품종(오따드, 티프블루)의 품종별 특성
북부하이부시계통
블루골드 조생종(수확기 7월 상순).
과실크기는 중립.
1988년 개발된 USDA 등록품종.
Bluehaven와 (Ashworth x Bluecrop)의 교배종.
나무의 높이는 120 ㎝ 정도이며 수형은 개장성임.
꽃과 과실이 많이 달리므로 적화 또는 적과 작업이 필요.
과실 당도는 12 ~ 14 브릭스 정도임
다로우 만생종(수확기 7월 하순).
과실크기는 극대립.
1965년 개발된 USDA 등록품종.
(Whareham x Pioneer)와 Bluecrop의 교배종.
나무의 생육상태가 강하고 수고는 150~180cm 정도임.
수형은 개장성임.
열매의 색은 밝은 청색이며, 과실이 크고 맛이 좋아 인기 품종임.
과육은 단단한 편임.
과실의 산미가 강하지만 수확기에 당산의 비율이 안정되어 풍미가 뛰어남.
엘리자베스 중만생종(수확기 7월 중~하순).
과실크기는 극대립.
1966년 개발된 USDA 등록품종.
(Katharine x Jersey)와 Sca㎜el의 교배종.
나무자세는 직립에서 개장성이고, 성숙기는 긴 편임.
과실은 크고 맛이 좋으며 보존성이 뛰어남.
래빗아이계통
티프블루 중생종(수확기 7월 말~9월).
과실크기는 중립.
1955년 조지아 주립대학에서 육성됨.
Ethe와 Clara를 교배한 USDA 등록 품종.
수세가 직립으로 강하게 성장하는 특징이 있음.
저온 요구 시간은 600~650 시간으로 래빗아이계통 중 비교적 냉해에 강한 편임.
가정에서 키우기 좋은 품종임.
Brightwell이나 Powder-blue 등의 수분수가 필요함.
오따드 중생종(수확기 7월 중순~8월 중순).
과실크기는 대립.
1960년 죠지아에서 육성됨.
Ethel과 Callaway를 교배한 USDA 등록 품종.
열매가 완숙되기 전까지는 신맛이 강하며 수세도 강한 편임.
저온 요구 시간은 350~400 시간 정도임.
꽃이 빨리 피는 편으로 동해에 약한 편임.
블루베리의 조직배양 시, 배지에 포함되는 생장조정제 및 첨가물의 종류와 농도에 따라 블루베리의 신초 형성 및 생육이 현저히 다르다는 연구들이 보고되었다(Alexandru F., D. Clapa, and C. Badescu. 2008. Horticulture. 65(1):104~109, Jiang Y.Q., Yu H., Zhang D.Q, He S.A. and Wang C.Y. ISHS Acta Horticulturae 810: IX International Vaccinium Symposium., Sedlak J. and Paprstein F. ISHS Acta Horticulturae 810: IX International Vaccinium Symposium., Clapa D., Fira A., and Rusu T. 2008. Food, Agriculture and Environment. 6(1):145~147). 더욱이 같은 배양 조건이라도 블루베리 품종에 따라 신초 분화 및 식물체 생육이 서로 다르다는 연구 결과가 보고되었다(Gajdosova A., Ostrolucka M. G., Libiakova G., Ondruskova E., and Simala D. 2006. Journal of Fruit and Ornamental Plant Research. 14(Suppl. 1):103~119, Ostrolucka M. G., Libiakova G., Ondruskova E. and Gajdosova A. 2004. Acta Universitatis Latviensis, Biology. 676:207~212). 따라서 이러한 결과들은 블루베리의 신초 형성율 및 분화율이 생장조정제를 포함한 첨가물의 종류 및 농도에 따른 배지의 조성과 식물체 재분화 과정에 있는 각각의 블루베리 품종간 상호 작용 또는 반응(reaction of specific cultivar to the cytokinin type)에 의해 좌우된다는 것을 보여준다. 따라서 조직배양 방법을 이용하는 경우, 블루베리의 식물체 형성율을 높이고 아울러 성공적인 조직배양묘의 대량생산을 위해서는 블루베리 품종별로, 생장조정제를 포함한 배지 첨가물의 종류 및 농도 등 배지의 조성 최적화가 반드시 필요하다.
이에 본 발명자들은 상기 블루베리 품종(블루골드, 엘리자베스, 다로우, 오따드, 티프블루)을 생장점 배양하여 캘러스 형성을 생략하고 신초를 바로 유기하여 5 ~ 6 개월 내에 유식물체를 형성하는 배지 조성 및 배양 조건을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 생장점 배양을 통하여 캘러스 형성을 생략하고 바로 신초 형성을 유기하여 변이율을 최소화하며 단기간에 블루베리 조직배양묘를 제공할 수 있는 블루베리 품종인 블루골드, 엘리자베스, 다로우, 오따드 또는 티프블루의 식물체 형성 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 생장점 배양을 이용한 블루베리 블루골드 품종의 식물체 형성 방법을 제공한다:
⒜ 블루베리 블루골드 품종의 생장점을 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴(Zeatin), 27.6 ~ 55.05 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA(FeNa-EDTA), 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨(Myo-Inositol), 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl(Thiamine HCl), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산(Nicotinic acid), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl), 10 ~ 50 g/L 수크로오스(Sucrose) 및 5 ~ 7 g 아가(Agar)가 포함된 배지에 치상하여 캘러스 형성과정을 거치지 않고 신초를 형성하는 단계; 및
⒝ 상기 신초를 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴(Zeatin), 36.7 ~ 73.4 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA, 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨, 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl, 10 ~ 50 g/L 수크로오스 및 5 ~ 7 g 아가가 포함된 배지에 배양하여 다신초를 유도하는 단계.
또한, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 생장점 배양을 이용한 블루베리 엘리자베스 품종의 식물체 형성 방법을 제공한다:
⒜ 블루베리 엘리자베스 품종의 생장점을 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside), 27.6 ~ 55.05 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA(FeNa-EDTA), 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨(Myo-Inositol), 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl(Thiamine HCl), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산(Nicotinic acid), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl), 10 ~ 50 g/L 수크로오스(Sucrose) 및 5 ~ 7 g 아가(Agar)가 포함된 배지에 치상하여 캘러스 형성과정을 거치지 않고 신초를 형성하는 단계; 및
⒝ 상기 신초를 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside), 36.7 ~ 73.4 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA, 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨, 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl, 10 ~ 50 g/L 수크로오스 및 5 ~ 7 g 아가가 포함된 배지에 배양하여 다신초를 유도하는 단계.
또한, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 생장점 배양을 이용한 블루베리 다로우 품종의 식물체 형성 방법을 제공한다:
⒜ 블루베리 다로우 품종의 생장점을 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside), 27.6 ~ 55.05 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA(FeNa-EDTA), 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨(Myo-Inositol), 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl(Thiamine HCl), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산(Nicotinic acid), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl), 10 ~ 50 g/L 수크로오스(Sucrose) 및 5 ~ 7 g 아가(Agar)가 포함된 배지에 치상하여 캘러스 형성과정을 거치지 않고 신초를 형성하는 단계; 및
⒝ 상기 신초를 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside), 36.7 ~ 73.4 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA, 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨, 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl, 10 ~ 50 g/L 수크로오스 및 5 ~ 7 g 아가가 포함된 배지에 배양하여 다신초를 유도하는 단계.
또한, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 생장점 배양을 이용한 블루베리 오따드 품종의 식물체 형성 방법을 제공한다:
⒜ 블루베리 오따드 품종의 생장점을 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴(Zeatin), 27.6 ~ 55.05 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA(FeNa-EDTA), 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨(Myo-Inositol), 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl(Thiamine HCl), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산(Nicotinic acid), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl), 10 ~ 50 g/L 수크로오스(Sucrose) 및 5 ~ 7 g 아가(Agar)가 포함된 배지에 치상하여 캘러스 형성과정을 거치지 않고 신초를 형성하는 단계; 및
⒝ 상기 신초를 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside), 36.7 ~ 73.4 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA, 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨, 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl, 10 ~ 50 g/L 수크로오스 및 5 ~ 7 g 아가가 포함된 배지에 배양하여 다신초를 유도하는 단계.
아울러, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 생장점 배양을 이용한 블루베리 티프블루 품종의 식물체 형성 방법을 제공한다:
⒜ 블루베리 티프블루 품종의 생장점을 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside), 27.6 ~ 55.05 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA(FeNa-EDTA), 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨(Myo-Inositol), 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl(Thiamine HCl), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산(Nicotinic acid), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl), 10 ~ 50 g/L 수크로오스(Sucrose) 및 5 ~ 7 g 아가(Agar)가 포함된 배지에 치상하여 캘러스 형성과정을 거치지 않고 신초를 형성하는 단계; 및
⒝ 상기 신초를 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside), 36.7 ~ 73.4 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA, 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨, 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl, 10 ~ 50 g/L 수크로오스 및 5 ~ 7 g 아가가 포함된 배지에 배양하여 다신초를 유도하는 단계.
본 발명에 따른 블루베리 품종인 블루골드, 엘리자베스, 다로우, 오따드 또는 티프블루의 식물체 형성 방법은 생장점으로부터 캘러스 형성 이후에 다신초를 형성하는 일반적인 배양과정을 거치지 않고, 캘러스의 형성 없이 신초를 형성함으로써, 10 ~ 11 개월 걸리는 식물체 형성과정을 5 ~ 6 개월로 단축할 수 있다. 또한, 변이율이 많은 캘러스를 형성하지 않아 우수한 품질의 블루베리 식물체를 다량으로 생산하기에 유용하다.
도 1은 블루베리 블루골드 품종의 생장점 배양방법을 이용한 식물체 형성 과정을 나타낸 사진이다(생장점 배양 후 A: 10 주 후, B: 16 주 후, C: 20 주 후, 기외순화 후 D : 3개월 후, E : 6개월 후).
도 2는 블루베리 엘리자베스 품종의 생장점 배양방법을 이용한 식물체 형성 과정을 나타낸 사진이다(생장점 배양 후 A: 10 주 후, B: 16 주 후, C: 20 주 후, 기외순화 후 D : 3개월 후, E : 6개월 후).
도 3은 블루베리 다로우 품종의 생장점 배양방법을 이용한 식물체 형성 과정을 나타낸 사진이다(생장점 배양 후 A: 10 주 후, B: 16 주 후, C: 20 주 후, 기외순화 후 D : 3개월 후, E : 6개월 후).
도 4는 블루베리 오따드 품종의 생장점 배양방법을 이용한 식물체 형성 과정을 나타낸 사진이다(생장점 배양 후 A: 10 주 후, B: 16 주 후, C: 20 주 후, 기외순화 후 D : 3개월 후, E : 6개월 후).
도 5는 블루베리 티프블루 품종의 생장점 배양방법을 이용한 식물체 형성 과정을 나타낸 사진이다(생장점 배양 후 A: 10 주 후, B: 16 주 후, C: 20 주 후, 기외순화 후 D : 3개월 후, E : 6개월 후).
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 기술은 블루베리 품종 중 하이부시 계통 3품종(블루골드, 엘리자베스, 다로우)과 래빗아이 계통 2품종(오따드, 티프블루)으로부터 그 해에 새로 자란 잎이 붙어있는 당년생 가지의 정단부 액아(곁눈)에 있는 생장점(식물의 줄기와 뿌리의 끝에서 세포의 증식, 기관 형성과 같이 두드러진 형성 활동을 하는 부분)을 채취하여 고체배지에 치상한 후 배양하는 초기 생장점 배양 단계, 신초(microshoot) 발생을 활발히 유도하여 식물체 형성 및 생장속도를 빠르게 하는 증식 배양 단계, 뿌리 형성을 유도하는 발근 배양 단계, 그리고 기내(배양실)에서 기외(온실 또는 포장)로 식물체를 순화하는 단계로 구성되어 있다.
본 발명에 있어서, 생장점 배양은 몇 개의 엽원기를 가진 정아(혹은 액아)의 절편을 배양하는 방법으로써, 식물체의 길이생장을 위해 세포분열이 왕성히 일어나는 정아(혹은 액아)를 배양하는 방법이다. 본 발명에서는 블루베리 가지의 정단부위의 액아(당년에 잎으로 분화하는 곁눈)로부터 엽원기가 1 ~ 2 매가 붙어있는 생장점을 채취한 후 배양하여 블루베리의 식물체를 형성하였다(도 1 내지 5).
본 발명은 다음 단계를 포함하는 생장점 배양을 이용한 블루베리 블루골드 품종의 식물체 형성 방법을 제공한다:
⒜ 블루베리 블루골드 품종의 생장점을 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴(Zeatin), 27.6 ~ 55.05 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA(FeNa-EDTA), 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨(Myo-Inositol), 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl(Thiamine HCl), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산(Nicotinic acid), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl), 10 ~ 50 g/L 수크로오스(Sucrose) 및 5 ~ 7 g 아가(Agar)가 포함된 배지에 치상하여 캘러스 형성과정을 거치지 않고 신초를 형성하는 단계; 및
⒝ 상기 신초를 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴(Zeatin), 36.7 ~ 73.4 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA, 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨, 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl, 10 ~ 50 g/L 수크로오스 및 5 ~ 7 g 아가가 포함된 배지에 배양하여 다신초를 유도하는 단계.
상기 방법에 있어서, ⒞ 상기 다신초를 0.1 ~ 0.3 ㎎/L 지아틴 또는 0.5 ~ 4.0 ㎎/L 인돌-3-부트릭산(Indole-3-butyric acid, IBA)이 포함된 배지에서 배양하여 뿌리를 유도하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 배지는 WPM 배지(Lloyd & McCown Woody Plant Basal Salt Medium)와 MS 배지(Murashige & Skoog Medium, Basal Salt Mixture, NH4NO3 Free)를 3:1 비율로 혼합하여 한 배지를 기본배지로 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 다음 단계를 포함하는 생장점 배양을 이용한 블루베리 엘리자베스 품종의 식물체 형성 방법을 제공한다:
⒜ 블루베리 엘리자베스 품종의 생장점을 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside), 27.6 ~ 55.05 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA(FeNa-EDTA), 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨(Myo-Inositol), 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl(Thiamine HCl), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산(Nicotinic acid), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl), 10 ~ 50 g/L 수크로오스(Sucrose) 및 5 ~ 7 g 아가(Agar)가 포함된 배지에 치상하여 캘러스 형성과정을 거치지 않고 신초를 형성하는 단계; 및
⒝ 상기 신초를 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside), 36.7 ~ 73.4 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA, 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨, 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl, 10 ~ 50 g/L 수크로오스 및 5 ~ 7 g 아가가 포함된 배지에 배양하여 다신초를 유도하는 단계.
상기 방법에 있어서, ⒞ 상기 다신초를 0.1 ~ 0.3 ㎎/L 지아틴 리보사이드 또는 0.5 ~ 4.0 ㎎/L 인돌-3-부트릭산(Indole-3-butyric acid, IBA)이 포함된 배지에서 배양하여 뿌리를 유도하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 배지는 WPM 배지(Lloyd & McCown Woody Plant Basal Salt Medium)와 MS 배지(Murashige & Skoog Medium, Basal Salt Mixture, NH4NO3 Free)를 1:1 비율로 혼합하여 한 배지를 기본배지로 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 다음 단계를 포함하는 생장점 배양을 이용한 블루베리 다로우 품종의 식물체 형성 방법을 제공한다:
⒜ 블루베리 다로우 품종의 생장점을 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside), 27.6 ~ 55.05 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA(FeNa-EDTA), 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨(Myo-Inositol), 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl(Thiamine HCl), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산(Nicotinic acid), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl), 10 ~ 50 g/L 수크로오스(Sucrose) 및 5 ~ 7 g 아가(Agar)가 포함된 배지에 치상하여 캘러스 형성과정을 거치지 않고 신초를 형성하는 단계; 및
⒝ 상기 신초를 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside), 36.7 ~ 73.4 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA, 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨, 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl, 10 ~ 50 g/L 수크로오스 및 5 ~ 7 g 아가가 포함된 배지에 배양하여 다신초를 유도하는 단계.
상기 방법에 있어서, ⒞ 상기 다신초를 0.1 ~ 0.3 ㎎/L 지아틴 리보사이드 또는 0.5 ~ 4.0 ㎎/L 인돌-3-부트릭산(Indole-3-butyric acid, IBA)이 포함된 배지에서 배양하여 뿌리를 유도하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 단계 ⒜의 배지는 WPM 배지(Lloyd & McCown Woody Plant Basal Salt Medium)와 MS 배지(Murashige & Skoog Medium, Basal Salt Mixture, NH4NO3 Free)를 3:1 비율로 혼합하여 한 배지를 기본배지로 하고, 단계 ⒝의 배지는 WPM 배지(Lloyd & McCown Woody Plant Basal Salt Medium)와 MS 배지(Murashige & Skoog Medium, Basal Salt Mixture, NH4NO3 Free)를 1:3 비율로 혼합하여 한 배지를 기본배지로 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 다음 단계를 포함하는 생장점 배양을 이용한 블루베리 오따드 품종의 식물체 형성 방법을 제공한다:
⒜ 블루베리 오따드 품종의 생장점을 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴(Zeatin), 27.6 ~ 55.05 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA(FeNa-EDTA), 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨(Myo-Inositol), 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl(Thiamine HCl), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산(Nicotinic acid), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl), 10 ~ 50 g/L 수크로오스(Sucrose) 및 5 ~ 7 g 아가(Agar)가 포함된 배지에 치상하여 캘러스 형성과정을 거치지 않고 신초를 형성하는 단계; 및
⒝ 상기 신초를 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside), 36.7 ~ 73.4 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA, 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨, 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl, 10 ~ 50 g/L 수크로오스 및 5 ~ 7 g 아가가 포함된 배지에 배양하여 다신초를 유도하는 단계.
상기 방법에 있어서, ⒞ 상기 다신초를 0.1 ~ 0.3 ㎎/L 지아틴 리보사이드 또는 0.5 ~ 4.0 ㎎/L 인돌-3-부트릭산(Indole-3-butyric acid, IBA)이 포함된 배지에서 배양하여 뿌리를 유도하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 본 발명의 단계 ⒜의 배지는 WPM 배지(Lloyd & McCown Woody Plant Basal Salt Medium)와 MS 배지(Murashige & Skoog Medium, Basal Salt Mixture, NH4NO3 Free)를 1:1 비율로 혼합하여 한 배지를 기본배지로 하고, 단계 ⒝의 배지는 WPM 배지(Lloyd & McCown Woody Plant Basal Salt Medium)와 MS 배지(Murashige & Skoog Medium, Basal Salt Mixture, NH4NO3 Free)를 1:3 비율로 혼합하여 한 배지를 기본배지로 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
아울러, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 생장점 배양을 이용한 블루베리 티프블루 품종의 식물체 형성 방법을 제공한다:
⒜ 블루베리 티프블루 품종의 생장점을 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside), 27.6 ~ 55.05 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA(FeNa-EDTA), 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨(Myo-Inositol), 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl(Thiamine HCl), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산(Nicotinic acid), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl), 10 ~ 50 g/L 수크로오스(Sucrose) 및 5 ~ 7 g 아가(Agar)가 포함된 배지에 치상하여 캘러스 형성과정을 거치지 않고 신초를 형성하는 단계; 및
⒝ 상기 신초를 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside), 36.7 ~ 73.4 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA, 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨, 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl, 10 ~ 50 g/L 수크로오스 및 5 ~ 7 g 아가가 포함된 배지에 배양하여 다신초를 유도하는 단계.
상기 방법에 있어서, ⒞ 상기 다신초를 0.1 ~ 0.3 ㎎/L 지아틴 리보사이드 또는 0.5 ~ 4.0 ㎎/L 인돌-3-부트릭산(Indole-3-butyric acid, IBA)이 포함된 배지에서 배양하여 뿌리를 유도하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 배지는 WPM 배지(Lloyd & McCown Woody Plant Basal Salt Medium)와 MS 배지(Murashige & Skoog Medium,Basal Salt Mixture, NH4NO3 Free)를 3:1 비율로 혼합하여 한 배지를 기본배지로 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
조직 배양 배지는 크게 무기염류, 탄소 및 에너지원, 기타 유기물, 비타민류, 생장조절제, 기타 첨가물(아가)로 구성된다.
산소, 탄소, 수소를 제외한 조직 배양 배지의 무기염류로써, 식물세포 및 조직배양에 필요한 원소로는 질소, 인산, 칼리, 황 등의 다량요소와 칼슘, 나트륨, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 구리, 아연, 붕소, 코발트, 철 등 비교적 소량으로 필요한 미량요소가 있다.
위의 원소들은 식물체 뿐 아니라 세포나 조직의 발달에 중요한 역할을 한다. 특히 미량요소 중 철(Fe)의 기능이 중요한데, 식물체 내에 일어나는 여러 대사과정을 조절하는 효소(enzyme)의 기능을 보완하고 보조하는 보조인자(cofactor)의 역할을 한다. 특히 식물의 광합성 작용이 일어나는 세포내 엽록체에는 라멜라(lamellae)라는 층이 존재하는데, 이 층은 싸이토크롬(cytochrome)이라는 단백질로 구성되어 있고 이 싸이토크롬 내에 철(Fe)을 포함하는 색소가 있어 산화·환원 작용을 통한 전자의 전달 기능 등 광합성 작용을 촉매하는 중요한 역활을 한다. 그 외에도 식물의 생장이나 형태 형성에 필수적인 것으로 알려져 있다.
배지 내 철(Fe)의 흡수는 pH의 영향을 많이 받는데 pH가 5.2 이상이 되면 흡수율이 떨어질 뿐만 아니라, 철(Fe) 자체가 물에 잘 녹지 않아 배지를 만들 때 침전이 생기는 문제가 발생하기도 한다. 과거 상업적으로 개발된 배지의 경우, Fe(SO4)3의 형태로 Fe를 공급하였으나, 이후에 개발된 배지에서는 위에서 언급한 문제점들을 극복하기 위하여 FeSO42H2O를 첨가하여 FeNa-EDTA의 착염(chelate)을 형성시켰으며, 이 착염상태의 철(Fe)은 배지의 pH가 8까지 올라가도 흡수가 가능하여 식물체가 계속 이용할 수 있다.
생장조절제인 지아틴 또는 지아틴 리보사이드는 벤질아미노푸린(Benzylaminopurine), 티디아주론(Thidiazuron), 카이네틴(Kinetin) 및 디메틸알릴아미노퓨린(2iP)과 같은 시토시닌(cytokinis)류의 식물성장호르몬으로써, 식물의 세포분열을 촉진한다. 특히 지하부의 발육을 억제하고 지상부의 생육을 촉진한다고 알려져 있어 식물체의 대량번식에서 신초를 유기, 증식시키는데 많이 사용되고 있다.
상기 신초 유도시 지아틴 또는 지아틴 리보사이드를 3 ㎎/L 이상으로 첨가할 경우, 오히려 식물체 생육을 저해하여 신초 발생이 지연되거나 억제되고 식물체 고사율이 높아지는 문제점이 있으며, 1 ㎎/L 이하로 첨가할 경우, 캘러스 형성율이 높아지고 신초 형성율이 낮아지는 문제점이 발생한다. 또한 페릭소디움솔트-EDTA를 73.4 ㎎/L 이상으로 첨가할 경우, 신초의 잎이 붉게 변하고 고사율 또는 갈변율이 높아지는 문제점이 있으며, 27.6 ㎎/L 이하로 첨가할 경우, 신초 생육이 저하되는 문제점이 있다. 그리고 미오이노시톨을 150 ㎎/L 이상으로 첨가할 경우, 식물체 형성과정에서 변이율이 높아지는 문제점이 있으며, 50 ㎎/L 이하로 첨가할 경우, 신초 생육이 저하되는 문제점이 있다. 티아민 HCl을 3 ㎎/L 이상으로 첨가할 경우, 식물체 고사율 및 갈변율이 높아지는 문제점이 있으며, 1 ㎎/L 이하로 첨가할 경우, 신초 생육이 저하되는 문제점이 있다. 또한 니코틴산을 1.5 ㎎/L 이상으로 첨가할 경우, 식물체 고사율 및 갈변율이 높아지는 문제점이 있으며, 0.5 ㎎/L 이하로 첨가할 경우, 신초 생육이 저하되는 문제점이 있다. 피리독신 HCl을 1.5 ㎎/L 이상으로 첨가할 경우, 식물체 고사율 및 갈변율이 높아지는 문제점이 있으며, 0.5 ㎎/L 이하로 첨가할 경우, 신초 생육이 저하되는 문제점이 있다. 또한, 수크로오스를 50 g/L 이상으로 첨가할 경우, 배지내 당 농도가 과도하게 높아지고 역삼투 현상이 일어나 식물체 조직 내부의 수분이 배지로 빠져나갈 가능성이 높아지며, 따라서 신초가 정상적으로 신장하지 못하고 생육 중간에 식물체의 줄기와 잎이 마르는 등 식물체가 고사하는 문제점이 있다. 수크로오스를 10 g/L 이하로 첨가할 경우, 식물체의 탄소 및 에너지원인 당의 농도가 급격히 낮아져 신초의 성장이 느려지고 배양단계 후반부에 생육의 억제되는 문제점이 있다. 그리고 액체상태의 배지를 고형화(젤라틴화)시켜 고체상태로 만드는 역활을 하는 아가를 7 g/L 이상으로 첨가할 경우, 배지의 강도(딱딱한 정도)가 과도하게 높아져 식물체에서 뿌리가 잘 뻗어 내리지 못하는 문제점이 있으며, 5 g/L 이하로 첨가할 경우, 식물체가 배지에 제대로 지지되지 못하는 문제점이 있다.
상기 다신초 유도시 지아틴 또는 지아틴 리보사이드를 3 ㎎/L 이상으로 첨가할 경우, 식물체 고사율 및 변이율이 높아지는 문제점이 있으며, 1 ㎎/L 이하로 첨가할 경우, 다신초 형성율이 낮아지고 식물체 생육이 억제되는 문제점이 있다.
상기 뿌리 유도시 인돌-3-부트릭 산을 4.0 ㎎/L 이상으로 첨가할 경우, 뿌리형성이 오히려 억제되고 식물체의 줄기와 잎이 갈변하는 등 고사율이 높아지는 문제점이 있으며, 0.5 ㎎/L 이하로 첨가할 경우, 뿌리 형성이 잘 이루어지지 않는 문제점이 있다.
본 발명에 있어서, “기본 배지”는 식물의 배양에 필요한 가장 기본적인 물질들만 포함되어 있는 배양액을 의미하며, 본 발명에서는 WPM과 MS의 혼합배지를 기본 배지로 사용하였으며, 기본 배지에 지아틴 또는 지아틴 리보사이드, 페릭소디움솔트-EDTA, 미오이노시톨, 티아민 HCl, 니코틴산, 피리독신 HCl, 수크로오스 및 아가를 추가로 첨가하여 블루베리의 생장점 배양을 위한 배지로 사용하였다.
본 발명에 있어서, 상기 기본 배지의 pH는 3 ~ 7로 사용하는 것을 특징으로 한다. 배지의 pH를 7 이상으로 사용하였을 경우에는 산성상태에서 잘 자라는 블루베리의 특성과 맞지 않아 식물체의 생장이 늦어질 수 있으며, pH를 3 이하로 사용하였을 경우에는 식물체의 칼슘(Ca) 이온 흡수를 저해하여 칼슘이 결핍되게 되며 이로써 생장점이 괴사될 수 있다. 따라서 배지의 pH를 3 ~ 7로 조정하여 사용하는 것이 바람직하며, pH 4.5 ~ 5.5로 사용하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
‘ 블루골드 ’ 품종의 생장점 배양방법
<1-1> ‘ 블루골드 ’ 품종의 생장점 채취
블루베리 “블루골드” 품종의 생장점은 신초(그 해에 새로 자란 잎이 붙어있는 당년생 가지) 생장이 주로 이루어지는 4 ~ 5 월(1차 생장) 또는 7 ~ 8 월(2차 생장)에 신초의 정단 부위에 있는 액아(당년에 잎으로 분화하는 곁눈)로부터 채취하여 배양 재료로 사용하였다. 정단 부위의 액아를 절취하여 70 % 에탄올에 30 초간 침지하여 표면 소독하고 3 % 차아염소산나트륨(NaOCl) 용액에 15 ~ 20 분간 침지하여 1 회 소독한 후 멸균수로 10 분간 3 회 세척하였다. 클린벤치(무균작업대)에서 현미경을 이용하여 액아 내 0.3 ~ 0.5 ㎜ 정도의 크기의 생장점을 엽원기(leaf primordium, 잎의 근원이 되거나 잎을 생성하는 세포의 일군)가 1 ~ 2 매가 붙어 있는 상태로 채취하여 배양하였다.
<1-2> ‘ 블루골드 ’ 품종의 신초 ( microshoot ) 생성 유도를 위한 초기 생장점 배양
초기 생장점 배양 배지는 WPM(Lloyd & McCown Woody Plant Basal Salt Medium w/o vitamins, MBcell 社) 배지와 MS(Murashige & Skoog Medium, Mod. No. 4 Basal Salt Mixture, NH4NO3 Free, Duchefa 社) 배지를 3:1 비율로 혼합한 배지에 생장조정제 지아틴(Zeatin) 외 8가지 첨가물을 추가하여 배지를 제조하였다. 배지 조성 성분은 <표 2>와 같다.
각각의 배지 성분을 혼합 조제한 후 배양용 유리 시험관(지름 25 ㎜, 높이 150 ㎜)에 10 ㎖씩 분주하여 121 ℃에서 15 분간 고압 멸균하여 사용하였다. 배지가 든 유리 시험관에 생장점을 하나씩 치상하였으며, 25±1 ℃로 유지되는 배양실에서 명 조건(2,000 ~ 3,000 lux, 16 시간 일장)으로 1 ~ 2 개월 정도 배양하였다.
<1-3> ‘ 블루골드 ’ 품종의 다신초 ( multi - shoot ) 생성 유도를 위한 증식 배양
초기 배양 과정에서 각각의 배지에 치상된 생장점은 1~2 개월 정도 배양기간이 지나면 신초가 형성되는데, 이 때 신초의 생장촉진을 위하여 <표 2>와 같은 증식배지에 3 ~ 4 주 간격으로 계대하였다. 새로운 증식배지에 2 ~ 3 회 계대배양을 거치면서, 신초(shoot)가 어느 정도 자라 다신초(multi-shoot)가 유도되면 신초의 기부를 분할하여 증식 배양을 수행하였다. 증식 배양시 신초가 성장하여 신초장(shoot length)이 2 ㎝ 이상이 되면 배양 용기를 유리 시험관(지름 25 ㎜, 높이 150 ㎜)에서 배양병(지름 25 ㎜, 높이 150 ㎜)으로 바꾸어 주었다.
<1-4> ‘ 블루골드 ’ 품종의 뿌리 형성 유도를 위한 발근 배양
증식 배양을 거친 “블루골드” 유식물체의 뿌리를 형성시키기 위하여 <표 2>의 증식 배양 배지 조성에서 지아틴(Zeatin)의 농도를 1/10로 줄이거나 첨가하지 않은 배지에 IBA 1 또는 2 ㎎/L을 첨가하여 발근 배지로 이용하며, 1 개월 정도 배양하였다. 이 때 배양병 마개에 솜으로 막는 구멍이 있어 외부공기가 순환되는 배양병을 사용하는 경우 기외 순화시 생존율을 높일 수 있다.
“블루골드” 유식물체의 전체 길이가 5 ㎝ 이상으로 충분히 성장한 경우, 뿌리를 형성시키는 발근 배양을 거치지 않고 바로 기외(온실)로 순화하는 것이 가능하였다.
<1-5> ‘ 블루골드 ’ 품종의 조직배양 묘목 형성을 위한 순화 과정
발근 배양을 통하여 뿌리가 형성된 유식물체 또는 뿌리가 형성되지는 않았으나 5 ㎝ 이상 충분히 성장한 “블루골드” 유식물체는 기내(배양실)에서 기외(온실)로 순화하는 과정을 거쳐야만 완전한 조직배양 묘목의 형태를 갖추게 된다. 피트모스와 펄라이트를 1:1(v:v)로 혼합한 상토를 준비한 후 블루베리 유식물체를 화분(내부 직경 110 ㎜, 높이 113 ㎜)에 심고, 햇빛의 30 ~ 40 %가 차광되며 최고 25 ℃, 최저 18 ℃로 유지되는 온실에서 투명 비닐을 덮어주어 습도가 잘 유지되는 상태에서 경화처리를 하였다. 유식물체의 상태를 확인하면서 비닐을 서서히 걷어내고 외기의 환경에 노출시켜 완전히 경화시켰다.
블루베리 “블루골드” 품종의 배양 배지 조성
성 분 명 함 량
초기 생장점 배양 배지 증식 배양 배지
NH4NO3 300.00 mg/L 300.00 mg/L
MgSO4 180.60 mg/L 180.60 mg/L
KNO3 475.00 mg/L 475.00 mg/L
K2SO4 742.50 mg/L 742.50 mg/L
KH2PO4 170.00 mg/L 170.00 mg/L
Ca(NO3)24H2O 289.50 mg/L 289.50 mg/L
CaCl2 137.38 mg/L 137.38 mg/L
CoCl26H2O 0.00625 mg/L 0.00625 mg/L
ZnSO47H2O 8.60 mg/L 8.60 mg/L
Na2MoO42H2O 0.25 mg/L 0.25 mg/L
MnSO4H2O 20.95 mg/L 20.95 mg/L
H3BO3 6.20 mg/L 6.20 mg/L
KI 0.2075 mg/L 0.2075 mg/L
FeNaEDTA 36.70 mg/L 45.875 mg/L
Na2EDTA 27.97 mg/L 27.97 mg/L
FeSO47H2O 20.88 mg/L 20.88 mg/L
CuSO45H2O 0.19 mg/L 0.19 mg/L
myo-Inositol 100 mg/L 100 mg/L
Nicotinic acid 1.00 mg/L 1.00 mg/L
Pyridoxine HCl 1.00 mg/L 1.00 mg/L
Thiamine HCl 2.00 mg/L 2.00 mg/L
Sucrose 30 g/L 30 g/L
Zeatin 2.00 mg/L 2.00 mg/L
Agar 6 g/L 6 g/L
배지의 pH 5.0 5.0
‘엘리자베스’ 품종의 생장점 배양방법
<2-1> ‘엘리자베스’ 품종의 생장점 채취
블루베리 “엘리자베스” 품종의 생장점의 채취방법은 위의 ‘블루골드’ 품종의 방법과 동일하다.
<2-2> ‘엘리자베스’ 품종의 신초 ( microshoot ) 생성 유도를 위한 초기 생장점 배양
초기 생장점 배양 배지는 WPM(Lloyd & McCown Woody Plant Basal Salt Medium w/o vitamins, MBcell 社) 배지와 MS(Murashige & Skoog Medium, Mod. No. 4 Basal Salt Mixture, NH4NO3 Free, Duchefa 社) 배지를 1:1 비율로 혼합한 배지에 생장조정제 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 외 8가지 첨가물을 추가하여 배지를 제조하였다. 배지조성 성분은 <표 3>과 같다.
각각의 배지 성분을 혼합 조제한 후 배양용 유리 시험관(지름 25 ㎜, 높이 150 ㎜)에 10 ㎖씩 분주하여 121 ℃에서 15 분간 고압 멸균하여 사용하였다. 배지가 든 유리 시험관에 생장점을 하나씩 치상하였으며, 25±1 ℃로 유지되는 배양실에서 명 조건(2,000 ~ 3,000 lux, 16 시간 일장)으로 1 ~ 2 개월 정도 배양하였다.
<2-3> ‘엘리자베스’ 품종의 다신초 ( multi - shoot ) 생성 유도를 위한 증식 배양
초기 배양 과정에서 각각의 배지에 치상된 생장점은 1 ~ 2 개월 정도 배양 기간이 지나면 신초가 형성되는데, 이 때 신초의 생장촉진을 위하여 <표 3>과 같은 증식배지에 3 ~ 4 주 간격으로 계대하였다. 새로운 증식 배지에 2 ~ 3 회 계대배양을 거치면서, 신초(shoot)가 어느 정도 자라 다신초(multi-shoot)가 유도되면 신초의 기부를 분할하여 증식 배양을 수행하였다. 증식 배양시 신초가 성장하여 신초장(shoot length)이 2 ㎝ 이상이 되면 배양 용기를 유리 시험관(지름 25 ㎜, 높이 150 ㎜)에서 배양병(지름 25 ㎜, 높이 150 ㎜)으로 바꾸어 주었다.
<2-4> ‘엘리자베스’ 품종의 뿌리 형성 유도를 위한 발근 배양
증식 배양을 거친 “엘리자베스” 유식물체의 뿌리를 형성시키기 위하여 <표 3>의 증식 배양 배지 조성에서 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside)의 농도를 1/10로 줄이거나 첨가하지 않은 배지에 IBA 1 또는 2 ㎎/L을 첨가하여 발근 배지로 이용하며, 1 개월 정도 배양하였다. 이 때 배양병 마개에 솜으로 막는 구멍이 있어 외부공기가 순환되는 배양병을 사용하는 경우 기외 순화시 생존율을 높일 수 있다.
“엘리자베스” 유식물체의 전체 길이가 5 ㎝ 이상으로 충분히 성장한 경우, 뿌리를 형성시키는 발근 배양을 거치지 않고 바로 기외(온실) 순화하는 것이 가능하였다.
<2-5> ‘엘리자베스’ 품종의 조직배양 묘목 형성을 위한 순화 과정
발근 배양을 통하여 뿌리가 형성된 유식물체 또는 뿌리가 형성되지는 않았으나 5 ㎝ 이상 충분히 성장한 “엘리자베스” 유식물체는 기내(배양실)에서 기외(온실)로 순화하는 과정을 거쳐야만 완전한 조직배양 묘목의 형태를 갖추게 된다. 기외에서 순화하는 방법은 위의 '블루골드' 품종의 방법과 동일하다.
블루베리 “엘리자베스” 품종의 배양 배지 조성
성 분 명 함 량
초기 생장점 배양 배지 증식 배양 배지
NH4NO3 200.00 mg/L 200.00 mg/L
MgSO4 180.60 mg/L 180.60 mg/L
KNO3 950.00 mg/L 950.00 mg/L
K2SO4 495.00 mg/L 495.00 mg/L
KH2PO4 170.00 mg/L 170.00 mg/L
Ca(NO3)24H2O 193.00 mg/L 193.00 mg/L
CaCl2 202.26 mg/L 202.26 mg/L
CoCl26H2O 0.0125 mg/L 0.0125 mg/L
ZnSO47H2O 8.60 mg/L 8.60 mg/L
Na2MoO42H2O 0.25 mg/L 0.25 mg/L
MnSO4H2O 19.60 mg/L 19.60 mg/L
H3BO3 6.20 mg/L 6.20 mg/L
KI 0.415 mg/L 0.415 mg/L
FeNaEDTA 36.70 mg/L 55.05 mg/L
Na2EDTA 18.65 mg/L 18.65 mg/L
FeSO47H2O 13.92 mg/L 13.92 mg/L
CuSO45H2O 0.13 mg/L 0.13 mg/L
myo-Inositol 100 mg/L 100 mg/L
Nicotinic acid 1.00 mg/L 1.00 mg/L
Pyridoxine HCl 1.00 mg/L 1.00 mg/L
Thiamine HCl 2.00 mg/L 2.00 mg/L
Sucrose 30 g/L 30 g/L
Zeatin riboside 2.00 mg/L 2.00 mg/L
Agar 6 g/L 6 g/L
배지의 pH 5.0 5.0
‘ 다로우 ’ 품종의 생장점 배양방법
<3-1> ‘ 다로우 ’ 품종의 생장점 채취
블루베리 “다로우” 품종의 생장점의 채취방법은 위의 ‘블루골드’ 품종의 방법과 동일하다.
<3-2> ‘ 다로우 ’ 품종의 신초 ( microshoot ) 생성 유도를 위한 초기 생장점 배양
초기 생장점 배양 배지는 WPM(Lloyd & McCown Woody Plant Basal Salt Medium w/o vitamins, MBcell 社) 배지와 MS(Murashige & Skoog Medium, Mod. No. 4 Basal Salt Mixture, NH4NO3 Free, Duchefa 社) 배지를 3:1 비율로 혼합한 배지에 생장조정제 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 외 8가지 첨가물을 추가하여 배지를 제조하였다. 배지조성 성분은 <표 4>와 같다.
각각의 배지 성분을 혼합 조제한 후 배양용 유리 시험관(지름 25 ㎜, 높이 150 ㎜)에 10 ㎖ 씩 분주하여 121 ℃에서 15 분간 고압 멸균하여 사용하였다. 배지가 든 유리 시험관에 생장점을 하나씩 치상하였으며, 25±1 ℃로 유지되는 배양실에서 명 조건(2,000 ~ 3,000 lux, 16 시간 일장)으로 1 ~ 2 개월 정도 배양하였다.
<3-3> ‘ 다로우 ’ 품종의 다신초 ( multi - shoot ) 생성 유도를 위한 증식 배양
초기 배양 과정에서 각각의 배지에 치상된 생장점은 1 ~ 2 개월 정도 배양기간이 지나면 신초가 형성되는데, 이 때 신초의 생장 촉진을 위하여 증식 배양 배지에 3 ~ 4 주 간격으로 계대하였다.
증식 배양 배지는 WPM(Lloyd & McCown Woody Plant Basal Salt Medium w/o vitamins, MBcell 社) 배지와 MS(Murashige & Skoog Medium, Mod. No. 4 Basal Salt Mixture, NH4NO3 Free, Duchefa 社) 배지를 1:3 비율로 혼합한 배지에 생장조정제 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 외 8가지 첨가물을 추가하여 배지를 제조하였으며, 그 성분은 <표 4>와 같다.
새로운 증식배지에 2 ~ 3 회 계대배양을 거치면서, 신초(shoot)가 어느 정도 자라 다신초(multi-shoot)가 유도되면 신초의 기부를 분할하여 증식 배양을 수행하였다. 증식 배양시 신초가 성장하여 신초장(shoot length)이 2 ㎝ 이상이 되면 배양 용기를 유리 시험관(지름 25 ㎜, 높이 150 ㎜)에서 배양병(지름 25 ㎜, 높이 150 ㎜)으로 바꾸어 주었다.
<3-4> ‘ 다로우 ’ 품종의 뿌리 형성 유도를 위한 발근 배양
증식 배양을 거친 “다로우” 유식물체의 뿌리를 형성시키기 위하여 <표 4>의 증식 배양 배지 조성에서 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside)의 농도를 1/10로 줄이거나 첨가하지 않은 배지에 IBA 1 또는 2 ㎎/L을 첨가하여 발근배지로 이용하며, 1 개월 정도 배양하였다. 이 때 배양병 마개에 솜으로 막는 구멍이 있어 외부공기가 순환되는 배양병을 사용하는 경우 기외 순화시 생존율을 높일 수 있다.
“다로우” 유식물체의 전체 길이가 5 ㎝ 이상으로 충분히 성장한 경우, 뿌리를 형성시키는 발근 배양을 거치지 않고 바로 기외(온실) 순화하는 것이 가능하였다.
<3-5> ‘ 다로우 ’ 품종의 조직배양 묘목 형성을 위한 순화 과정
발근 배양을 통하여 뿌리가 형성된 유식물체 또는 뿌리가 형성되지는 않았으나 5㎝ 이상 충분히 성장한 “다로우” 유식물체는 기내(배양실)에서 기외(온실)로 순화하는 과정을 거쳐야만 완전한 조직배양 묘목의 형태를 갖추게 된다. 기외에서 순화하는 방법은 위의 ‘블루골드’ 품종의 방법과 동일하다.
블루베리 “다로우” 품종의 배양 배지 조성
성 분 명 함 량
초기 생장점 배양 배지 증식 배양 배지
NH4NO3 300.00 mg/L 100.00 mg/L
MgSO4 180.60 mg/L 180.60 mg/L
KNO3 475.00 mg/L 1425.00 mg/L
K2SO4 742.50 mg/L 247.50 mg/L
KH2PO4 170.00 mg/L 170.00 mg/L
Ca(NO3)24H2O 289.50 mg/L 96.50 mg/L
CaCl2 137.38 mg/L 267.14 mg/L
CoCl26H2O 0.00625 mg/L 0.01875 mg/L
ZnSO47H2O 8.60 mg/L 8.60 mg/L
Na2MoO42H2O 0.25 mg/L 0.25 mg/L
MnSO4H2O 20.95 mg/L 18.25 mg/L
H3BO3 6.20 mg/L 6.20 mg/L
KI 0.2075 mg/L 0.6225 mg/L
FeNaEDTA 36.70 mg/L 64.22 mg/L
Na2EDTA 27.97 mg/L 9.32 mg/L
FeSO47H2O 20.88 mg/L 6.96 mg/L
CuSO45H2O 0.19 mg/L 0.08 mg/L
myo-Inositol 100 mg/L 100 mg/L
Nicotinic acid 1.00 mg/L 1.00 mg/L
Pyridoxine HCl 1.00 mg/L 1.00 mg/L
Thiamine HCl 2.00 mg/L 2.00 mg/L
Sucrose 30 g/L 30 g/L
Zeatin riboside 2.00 mg/L 2.00 mg/L
Agar 6 g/L 6 g/L
배지의 pH 5.0 5.0
‘ 오따드 ’ 품종의 생장점 배양방법
<4-1> ‘ 오따드 ’ 품종의 생장점 채취
블루베리 “오따드” 품종의 생장점의 채취방법은 위의 ‘블루골드’ 품종의 방법과 동일하다.
<4-2> ‘ 오따드 ’ 품종의 신초 ( microshoot ) 생성 유도를 위한 초기 생장점 배양
초기 생장점 배양 배지는 WPM(Lloyd & McCown Woody Plant Basal Salt Medium w/o vitamins, MBcell 社) 배지와 MS(Murashige & Skoog Medium, Mod. No. 4 Basal Salt Mixture, NH4NO3 Free, Duchefa 社) 배지를 1:1 비율로 혼합한 배지에 생장조정제 지아틴(Zeatin) 외 8가지 첨가물을 추가하여 배지를 제조하였다. 배지조성 성분은 <표 5>와 같다.
각각의 배지 성분을 혼합 조제한 후 배양용 유리 시험관(지름 25 ㎜, 높이 150 ㎜)에 10 ㎖씩 분주하여 121 ℃에서 15 분간 고압 멸균하여 사용하였다. 배지가 든 유리 시험관에 생장점을 하나씩 치상하였으며, 25±1 ℃로 유지되는 배양실에서 명 조건(2,000 ~ 3,000 lux, 16 시간 일장)으로 1 ~ 2 개월 정도 배양하였다.
<4-3> ‘ 오따드 ’ 품종의 다신초 ( multi - shoot ) 생성 유도를 위한 증식 배양
초기 배양과정에서 각각의 배지에 치상된 생장점은 1 ~ 2 개월 정도 배양기간이 지나면 신초가 형성되는데, 이 때 신초의 생장촉진을 위하여 증식 배양 배지에 3 ~ 4 주 간격으로 계대하였다.
증식 배양 배지는 WPM(Lloyd & McCown Woody Plant Basal Salt Medium w/o vitamins, MBcell 社) 배지와 MS(Murashige & Skoog Medium, Mod. No. 4 Basal Salt Mixture, NH4NO3 Free, Duchefa 社) 배지를 1:3 비율로 혼합한 배지에 생장조정제 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 외 8가지 첨가물을 추가하여 배지를 제조하였으며, 그 성분은 <표 5>와 같다.
새로운 증식배지에 2 ~ 3 회 계대배양을 거치면서, 신초(shoot)가 어느 정도 자라 다신초(multi-shoot)가 유도되면 신초의 기부를 분할하여 증식 배양을 수행하였다. 증식 배양시 신초가 성장하여 신초장(shoot length)이 2 ㎝ 이상이 되면 배양 용기를 유리 시험관(지름 25 ㎜, 높이 150 ㎜)에서 배양병(지름 25 ㎜, 높이 150 ㎜)으로 바꾸어 주었다.
<4-4> ‘ 오따드 ’ 품종의 뿌리 형성 유도를 위한 발근 배양
증식 배양을 거친 “오따드” 유식물체의 뿌리를 형성시키기 위하여 <표 5>의 증식 배양 배지 조성에서 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside)의 농도를 1/10로 줄이거나 첨가하지 않은 배지에 IBA 1 또는 2 ㎎/L을 첨가하여 발근 배지로 이용하며, 1 개월 정도 배양하였다. 이 때 배양병 마개에 솜으로 막는 구멍이 있어 외부공기가 순환되는 배양병을 사용하는 경우 기외 순화시 생존율을 높일 수 있다.
“오따드” 유식물체의 전체 길이가 5 ㎝ 이상으로 충분히 성장한 경우, 뿌리를 형성시키는 발근 배양을 거치지 않고 바로 기외(온실) 순화하는 것이 가능하였다.
<4-5> ‘ 오따드 ’ 품종의 조직배양 묘목 형성을 위한 순화 과정
발근 배양을 통하여 뿌리가 형성된 유식물체 또는 뿌리가 형성되지는 않았으나 5 ㎝ 이상 충분히 성장한 “오따드” 유식물체는 기내(배양실)에서 기외(온실)로 순화하는 과정을 거쳐야만 완전한 조직배양 묘목의 형태를 갖추게 된다. 기외에서 순화하는 방법은 위의 ‘블루골드’ 품종의 방법과 동일하다.
블루베리 “오따드” 품종의 배양 배지 조성
성 분 명 함 량
초기 생장점 배양 배지 증식 배양 배지
NH4NO3 200.00 mg/L 100.00 mg/L
MgSO4 180.60 mg/L 180.60 mg/L
KNO3 950.00 mg/L 1425.00 mg/L
K2SO4 495.00 mg/L 247.50 mg/L
KH2PO4 170.00 mg/L 170.00 mg/L
Ca(NO3)24H2O 193.00 mg/L 96.50 mg/L
CaCl2 202.26 mg/L 267.14 mg/L
CoCl26H2O 0.0125 mg/L 0.01875 mg/L
ZnSO47H2O 8.60 mg/L 8.60 mg/L
Na2MoO42H2O 0.25 mg/L 0.25 mg/L
MnSO4H2O 19.60 mg/L 18.25 mg/L
H3BO3 6.20 mg/L 6.20 mg/L
KI 0.415 mg/L 0.6225 mg/L
FeNaEDTA 36.70 mg/L 64.22 mg/L
Na2EDTA 18.65 mg/L 9.32 mg/L
FeSO47H2O 13.92 mg/L 6.96 mg/L
CuSO45H2O 0.13 mg/L 0.08 mg/L
myo-Inositol 100 mg/L 100 mg/L
Nicotinic acid 1.00 mg/L 1.00 mg/L
Pyridoxine HCl 1.00 mg/L 1.00 mg/L
Thiamine HCl 2.00 mg/L 2.00 mg/L
Sucrose 30 g/L 30 g/L
Zeatin 2.00 mg/L 0.00 mg/L
Zeatin riboside 0.00 mg/L 2.00 mg/L
Agar 6 g/L 6 g/L
배지의 pH 5.0 5.0
‘ 티프블루 ’ 품종의 생장점 배양방법
<5-1> ‘ 티프블루 ’품종의 생장점 채취
블루베리 “티프블루” 품종의 생장점의 채취방법은 위의 ‘블루골드’ 품종의 방법과 동일하다.
<5-2> ‘ 티프블루 ’ 품종의 신초 ( microshoot ) 생성 유도를 위한 초기 생장점 배양
초기 생장점 배양 배지는 WPM(Lloyd & McCown Woody Plant Basal Salt Medium w/o vitamins, MBcell 社) 배지와 MS(Murashige & Skoog Medium, Mod. No. 4 Basal Salt Mixture, NH4NO3 Free, Duchefa 社) 배지를 3:1 비율로 혼합한 배지에 생장조정제 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside) 외 8가지 첨가물을 추가하여 배지를 제조하였다. 배지조성 성분은 <표 6>과 같다.
각각의 배지 성분을 혼합 조제한 후 배양용 유리 시험관(지름 25 ㎜, 높이 150 ㎜)에 10 ㎖씩 분주하여 121 ℃에서 15 분간 고압 멸균하여 사용하였다. 배지가 든 유리 시험관에 생장점을 하나씩 치상하였으며, 25±1 ℃로 유지되는 배양실에서 명 조건(2,000 ~ 3,000 lux, 16 시간 일장)으로 1 ~ 2 개월 정도 배양하였다.
<5-3> ‘ 티프블루 ’ 품종의 다신초 ( multi - shoot ) 생성 유도를 위한 증식 배양
초기 배양 과정에서 각각의 배지에 치상된 생장점은 1~2 개월 정도 배양기간이 지나면 신초가 형성되는데, 이 때 신초의 생장 촉진을 위하여 <표 6>과 같은 증식배지에 3~4 주 간격으로 계대하였다. 새로운 증식배지에 2~3 회 계대배양을 거치면서, 신초(shoot)가 어느 정도 자라 다신초(multi-shoot)가 유도되면 신초의 기부를 분할하여 증식 배양을 수행하였다. 증식 배양시 신초가 성장하여 신초장(shoot length)이 2 ㎝ 이상이 되면 배양 용기를 유리 시험관(지름 25 ㎜, 높이 150 ㎜)에서 배양병(지름 25 ㎜, 높이 150 ㎜)으로 바꾸어 주었다.
<5-4> ‘ 티프블루 ’ 품종의 뿌리 형성 유도를 위한 발근 배양
증식 배양을 거친 “티프블루” 유식물체의 뿌리를 형성시키기 위하여 <표 6>의 증식 배양 배지 조성에서 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside)의 농도를 1/10로 줄이거나 첨가하지 않은 배지에 IBA 1 또는 2 ㎎/L을 첨가하여 발근 배지로 이용하며, 1 개월 정도 배양하였다. 이 때 배양병 마개에 솜으로 막는 구멍이 있어 외부공기가 순환되는 배양병을 사용하는 경우 기외 순화시 생존율을 높일 수 있다.
“티프블루” 유식물체의 전체 길이가 5 ㎝ 이상으로 충분히 성장한 경우, 뿌리를 형성시키는 발근 배양을 거치지 않고 바로 기외(온실) 순화하는 것이 가능하였다.
<5-5> ‘ 티프블루 ’ 품종의 조직배양 묘목 형성을 위한 순화 과정
발근 배양을 통하여 뿌리가 형성된 유식물체 또는 뿌리가 형성되지는 않았으나 5㎝ 이상 충분히 성장한 “티프블루” 유식물체는 기내(배양실)에서 기외(온실)로 순화하는 과정을 거쳐야만 완전한 조직배양 묘목의 형태를 갖추게 된다. 기외에서 순화하는 방법은 위의‘블루골드’품종의 방법과 동일하다.
블루베리 “티프블루” 품종의 배양 배지 조성
성 분 명 함 량
초기 생장점 배양 배지 증식 배양 배지
NH4NO3 300.00 mg/L 300.00 mg/L
MgSO4 180.60 mg/L 180.60 mg/L
KNO3 475.00 mg/L 475.00 mg/L
K2SO4 742.50 mg/L 742.50 mg/L
KH2PO4 170.00 mg/L 170.00 mg/L
Ca(NO3)24H2O 289.50 mg/L 289.50 mg/L
CaCl2 137.38 mg/L 137.38 mg/L
CoCl26H2O 0.00625 mg/L 0.00625 mg/L
ZnSO47H2O 8.60 mg/L 8.60 mg/L
Na2MoO42H2O 0.25 mg/L 0.25 mg/L
MnSO4H2O 20.95 mg/L 20.95 mg/L
H3BO3 6.20 mg/L 6.20 mg/L
KI 0.2075 mg/L 0.2075 mg/L
FeNaEDTA 36.70 mg/L 45.875 mg/L
Na2EDTA 27.97 mg/L 27.97 mg/L
FeSO47H2O 20.88 mg/L 20.88 mg/L
CuSO45H2O 0.19 mg/L 0.19 mg/L
myo-Inositol 100 mg/L 100 mg/L
Nicotinic acid 1.00 mg/L 1.00 mg/L
Pyridoxine HCl 1.00 mg/L 1.00 mg/L
Thiamine HCl 2.00 mg/L 2.00 mg/L
Sucrose 30 g/L 30 g/L
Zeatin riboside 2.00 mg/L 2.00 mg/L
Agar 6 g/L 6 g/L
배지의 pH 5.0 5.0
본 발명은 건전한 블루베리 국산 조직배양 묘목의 확대 보급을 위한 원천기술로 활용하고, 급증하는 블루베리 묘목의 국내 수요를 충족시키고 외국으로부터 묘목 수입을 대체하는 효과를 얻을 수 있으며, 고품질 국산 무병주(virus-free 묘목)의 보급 확대 및 묘목 수급의 안정화가 가능할 것이다. 또한 virus-free 묘목의 대량생산으로 국외 수출 가능성까지 확대할 수 있을 것이다.

Claims (11)

  1. 다음 단계를 포함하는 생장점 배양을 이용한 블루베리 블루골드 품종의 식물체 형성 방법:
    (a) 블루베리 블루골드(Bluegold) 품종의 생장점을 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴(Zeatin), 27.6 ~ 55.05 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA(FeNa-EDTA), 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨(Myo-Inositol), 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl(Thiamine HCl), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산(Nicotinic acid), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl), 10 ~ 50 g/L 수크로오스(Sucrose) 및 5 ~ 7 g 아가(Agar)가 포함된 WPM 배지(Lloyd & McCown Woody Plant Basal Salt Medium)와 MS 배지(Murashige & Skoog Medium, Basal Salt Mixture, NH4NO3 Free)를 3:1 비율로 혼합한 배지에 치상하여 캘러스 형성과정을 거치지 않고 신초를 형성하는 단계;
    (b) 상기 신초를 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴(Zeatin), 36.7 ~ 73.4 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA, 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨, 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl, 10 ~ 50 g/L 수크로오스 및 5 ~ 7 g 아가가 포함된 배지에 배양하여 다신초를 유도하는 단계; 및
    (c) 상기 다신초를 0.1 ~ 0.3 ㎎/L 지아틴 또는 0.5 ~ 4.0 ㎎/L 인돌-3-부트릭산(Indole-3-butyric acid, IBA)이 포함된 WPM 배지(Lloyd & McCown Woody Plant Basal Salt Medium)와 MS 배지(Murashige & Skoog Medium, Basal Salt Mixture, NH4NO3 Free)를 3:1 비율로 혼합한 배지에서 배양하여 뿌리를 유도하는 단계.
  2. 다음 단계를 포함하는 생장점 배양을 이용한 블루베리 엘리자베스(Eligabeth) 품종의 식물체 형성 방법:
    (a) 블루베리 엘리자베스 품종의 생장점을 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside), 27.6 ~ 55.05 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA(FeNa-EDTA), 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨(Myo-Inositol), 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl(Thiamine HCl), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산(Nicotinic acid), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl), 10 ~ 50 g/L 수크로오스(Sucrose) 및 5 ~ 7 g 아가(Agar)가 포함된 WPM 배지(Lloyd & McCown Woody Plant Basal Salt Medium)와 MS 배지(Murashige & Skoog Medium, Basal Salt Mixture, NH4NO3 Free)를 1:1 비율로 혼합한 배지에 치상하여 캘러스 형성과정을 거치지 않고 신초를 형성하는 단계;
    (b) 상기 신초를 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside), 36.7 ~ 73.4 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA, 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨, 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl, 10 ~ 50 g/L 수크로오스 및 5 ~ 7 g 아가가 포함된 배지에 배양하여 다신초를 유도하는 단계; 및
    (c) 상기 다신초를 0.1 ~ 0.3 ㎎/L 지아틴 또는 0.5 ~ 4.0 ㎎/L 인돌-3-부트릭산(Indole-3-butyric acid, IBA)이 포함된 WPM 배지(Lloyd & McCown Woody Plant Basal Salt Medium)와 MS 배지(Murashige & Skoog Medium, Basal Salt Mixture, NH4NO3 Free)를 1:1 비율로 혼합한 배지에서 배양하여 뿌리를 유도하는 단계.
  3. 다음 단계를 포함하는 생장점 배양을 이용한 블루베리 다로우(Darrow) 품종의 식물체 형성 방법:
    (a) 블루베리 오따드 품종의 생장점을 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴(Zeatin), 27.6 ~ 55.05 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA(FeNa-EDTA), 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨(Myo-Inositol), 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl(Thiamine HCl), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산(Nicotinic acid), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl), 10 ~ 50 g/L 수크로오스(Sucrose) 및 5 ~ 7 g 아가(Agar)가 포함된 WPM 배지(Lloyd & McCown Woody Plant Basal Salt Medium)와 MS 배지(Murashige & Skoog Medium, Basal Salt Mixture, NH4NO3 Free)를 1:1 비율로 혼합한 배지에 치상하여 캘러스 형성과정을 거치지 않고 신초를 형성하는 단계;
    (b) 상기 신초를 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside), 36.7 ~ 73.4 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA, 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨, 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl, 10 ~ 50 g/L 수크로오스 및 5 ~ 7 g 아가가 포함된 배지에 배양하여 다신초를 유도하는 단계; 및
    (c) 상기 다신초를 0.1 ~ 0.3 ㎎/L 지아틴 또는 0.5 ~ 4.0 ㎎/L 인돌-3-부트릭산(Indole-3-butyric acid, IBA)이 포함된 WPM 배지(Lloyd & McCown Woody Plant Basal Salt Medium)와 MS 배지(Murashige & Skoog Medium, Basal Salt Mixture, NH4NO3 Free)를 1:3 비율로 혼합한 배지에서 배양하여 뿌리를 유도하는 단계.
  4. 다음 단계를 포함하는 생장점 배양을 이용한 블루베리 오따드(Woodard) 품종의 식물체 형성 방법:
    ⒜ 블루베리 오따드 품종의 생장점을 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴(Zeatin), 27.6 ~ 55.05 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA(FeNa-EDTA), 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨(Myo-Inositol), 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl(Thiamine HCl), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산(Nicotinic acid), 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl(Pyridoxine HCl), 10 ~ 50 g/L 수크로오스(Sucrose) 및 5 ~ 7 g 아가(Agar)가 포함된 배지에 치상하여 캘러스 형성과정을 거치지 않고 신초를 형성하는 단계;
    ⒝ 상기 신초를 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside), 36.7 ~ 73.4 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA, 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨, 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl, 10 ~ 50 g/L 수크로오스 및 5 ~ 7 g 아가가 포함된 배지에 배양하여 다신초를 유도하는 단계; 및
    ⒞ 상기 다신초를 0.1 ~ 0.3 ㎎/L 지아틴 리보사이드 또는 0.5 ~ 4.0 ㎎/L 인돌-3-부트릭산(Indole-3-butyric acid, IBA)이 포함된 배지에서 배양하여 뿌리를 유도하는 단계.
  5. 다음 단계를 포함하는 생장점 배양을 이용한 블루베리 티프블루(Tifblue) 품종의 식물체 형성 방법:
    (a) 블루베리 티프블루 품종의 포함된 WPM 배지(Lloyd & McCown Woody Plant Basal Salt Medium)와 MS 배지(Murashige & Skoog Medium, Basal Salt Mixture, NH4NO3 Free)를 3:1 비율로 혼합한 배지에 치상하여 캘러스 형성과정을 거치지 않고 신초를 형성하는 단계;
    (b) 상기 신초를 1 ~ 3 ㎎/L 지아틴 리보사이드(Zeatin riboside), 36.7 ~ 73.4 ㎎/L 페릭소디움솔트-EDTA, 50 ~ 150 ㎎/L 미오이노시톨, 1 ~ 3 ㎎/L 티아민 HCl, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 니코틴산, 0.5 ~ 1.5 ㎎/L 피리독신 HCl, 10 ~ 50 g/L 수크로오스 및 5 ~ 7 g 아가가 포함된 배지에 배양하여 다신초를 유도하는 단계; 및
    (c) 상기 다신초를 0.1 ~ 0.3 ㎎/L 지아틴 또는 0.5 ~ 4.0 ㎎/L 인돌-3-부트릭산(Indole-3-butyric acid, IBA)이 포함된 WPM 배지(Lloyd & McCown Woody Plant Basal Salt Medium)와 MS 배지(Murashige & Skoog Medium, Basal Salt Mixture, NH4NO3 Free)를 3:1 비율로 혼합한 배지에서 배양하여 뿌리를 유도하는 단계.

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