KR102511158B1

KR102511158B1 - 정금나무 조직배양 묘목의 대량 생산방법

Info

Publication number: KR102511158B1
Application number: KR1020210000110A
Authority: KR
Inventors: 윤아영; 김용욱; 김지아; 김태동; 이나념
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2021-01-04
Filing date: 2021-01-04
Publication date: 2023-03-17
Also published as: KR20220098418A

Abstract

본 발명에서는 정금나무의 신초의 기외 발근 공정을 통하여 정금나무 조직배양 묘목을 대량 생산하는 방법이 개시된다.
본 발명에 따른 정금나무 조직배양 묘목의 대량 생산방법에 의하면, 통상적으로 이루어지는 기내 발근 대신에, 기외 발근을 이용함에 의해 정금나무 신초의 발근율(재분화율)이 현저히 증진되고, 더불어 별도의 환경 순화 과정이 필요치 않아서 건전한 정금나무 조직배양 묘목을 단시간에 대량으로 생산할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 정금나무 조직배양 묘목은 우수한 유전형질을 갖는 모본과 동일한 유전형질을 가지므로 과수농가 보급용으로 유용하다.

Description

정금나무 조직배양 묘목의 대량 생산방법 {Methods for mass propagation of tissue culture-derived plants of Vaccinium oldhamii}

본 발명은 정금나무 조직배양 묘목의 대량 생산방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 정금나무의 신초의 기외 발근 공정을 통하여 정금나무 조직배양 묘목을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

정금나무(Vaccinium oldhamii)는 진달래과 산앵두나무속에 속하는 낙엽성의 키 작은 나무이며, 우리나라 원산으로 중·남부 지역의 낮은 산에서 자란다. 정금나무와 같은 산앵도나무속에 속하는 나무에서 열리는 열매를 블루베리라고 한다. 블루베리는 몸에 좋은 슈퍼푸드 중 하나로 강력한 항산화작용으로 세포노화 억제 효과가 있을 뿐만 아니라 안토시아닌의 함량이 높고 면역력 강화와 성인병 예방에 좋은 것으로 알려져 있다. 특히 최근 연구에 따르면 우리나라 자생 정금나무가 북미산 블루베리보다 유용성분 및 항산화 활성이 더 높은 것으로 나타나 토종 정금나무 열매를 이용한 건강기능 식품 개발 등의 산업화 움직임이 활발해지고 있다. 이에 따라 최근 정금나무 과실 생산을 위한 재배용 묘목 수요가 증가하고 있다.

정금나무의 번식은 가을에 채취한 종자를 이끼에 파종한 후 관수하는 방법과 하계에 녹지삽목을 하는 방법이 있다. 하지만 정금나무 종자 발아율은 10% 이하로 낮고 녹지삽목 또한 삽수 채취 시기가 하계에 한정되어 있어 그 효율이 매우 낮다. 재배용 정금나무 묘목 생산을 위해 종자, 삽목 등 유무성 번식방법에 관한 연구가 수행되어 왔으나, 효율적인 대량 생산 기술의 개발이 아직 미미한 실정이다.

이러한 정금나무의 낮은 번식 효율로 인한 묘목 생산량은 저조한데 그 대안으로 생명공학기법 중 하나인 조직배양기술을 이용한 번식방법이 일부 개발되어 왔다. 그 일례로 미숙종자 또는 뿌리로부터 배발생 캘러스를 유도하여 기내 발근(배지에서 식물체 형성)을 통한 정금나무의 기내번식방법이 개발되었으나 생산 효율이 낮아서 정금나무의 조직배양묘의 대량 생산에는 적합하지 않았다 (등록특허 10-1852799호).

따라서 정금나무 묘목의 대량 생산 방법의 개발이 절실히 요구되는 실정이다.

이에 본 발명자들은 종래 기술에서의 요구에 부응하기 위해 지속적으로 연구한 결과, 정금나무의 신초를 기외 발근을 통할 경우, 놀랍게도 신초의 발근을 통한 식물체 재분화가 현저히 증진되어 정금나무 조직배양 묘목을 대량으로 생산할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 정금나무 조직배양 묘목의 대량 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 생산된 정금나무 조직배양 묘목을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

i) 정금나무의 정아 절편체를 기내 배양하여 다신초를 유도하는 단계;

ii) 다신초에서 유래된 신초를 상토에 삽목하여 기외 발근을 통하여 식물체로 재분화시키는 단계; 및

iii) 식물체를 토양에 이식하여 육묘하는 단계:를 포함하는 정금나무 조직배양 묘목의 대량 생산방법을 제공한다.

본 발명에 따른 방법은 별도의 순화 단계를 거치지 않는다.

본 발명에서 '정아(頂芽, Apical bud)'는 식물의 줄기나 가지 끝부분에 나 있는 눈(싹 발생 구조)을 지칭한다.

본 발명에서 '신초(shoot)'는 새로 자라난 가지를 의미하는 것으로, 조직의 기내 배양으로 새로 자라난 가지, 줄기의 선단을 적심했을 때 측아로부터 자라나온 가지, 숨은 눈이나 가지 윗쪽 또는 등어리에 위치한 눈에서 자라나온 가지와 같이 세력이 좋은 가지를 포함한다.

본 발명에서 '다신초(multiple shoot)'는 신초가 여러개 있는 것을 가리킨다.

본 발명에서 '기내 배양'은 인공배양기를 사용하여 유기체를 기르는 방법을 의미한다.

본 발명에서 '발근(rooting)'은 뿌리내림을 의미하는 것으로, 식물체의 기관에서 뿌리를 분화(형성)시키는 것을 포함한다.

본 발명에서 '재분화(再分化)'는 탈분화한 세포로부터 원래의 기관이나 생물체로 복원하는 것을 재분화라고 하며, 식물 세포의 배양기술에서 배양 조건을 변화시킴으로써 싹이나 뿌리가 형성되게 하여 식물체가 재생하는 출발점이 되게 하는 현상을 포함한다.

본 발명에서 '순화'는 식물체가 토지의 기후 조건, 또는 동일 지역의 기후 변동에 적응하는 것을 의미한다.

본 발명에서 '상토(床土)'는 작물의 육묘를 목적으로 사용되는 배양토(인공토양)를 말한다.

본 발명에서 '묘목(苗木, seedling)'은 인공적으로 대량으로 육성한 어린 나무를 의미하며, 비인공적으로 자란 어린 나무는 치묘 등의 용어를 사용해 구별하기도 한다.

본 발명에서 '육묘 (育苗, raising seeding)'는 식물체를 일정 기간 동안 길러 정식으로 심기에 가장 적합한 양질의 묘목을 키우는 제반 작업을 의미한다.

단계 i) 정금나무의 정아 절편체 기내 배양

정금나무의 정아 절편체를 기내 배양하여 다신초를 유도한다.

본 단계에서 정아 절편체는 정금나무의 정아를 포함하는 줄기 끝부분을 1cm 정도 길이로 절단하여 제조한다.

정아 절편체는 배양 배지에 이식하여 배양하여 다신초를 유도한다.

본 단계에서 배양 배지는 1.0 mg/L ~ 2.0 mg/L의 6-(γ,γ-디메틸알릴)아미노퓨린 (6-(γ,γ-Dimethylallyl)aminopurine), 2% ~ 3%의 수크로스 및 0.3% ~ 0.35%의 젤라이트가 첨가된 고체상의 MS(Murashige and Skoog) 배지를 사용하고, 가장 바람직하게는 2.0 mg/L, 3% 수크로스 및 0.35% 젤라이트가 첨가된 MS 배지를 사용한다.

본 단계에서 정아 절편체 배양은 25±1℃에서 1일 15~17시간, 30~50 μmol·m^-2·s^-1 조명이 유지되는 조건 하에 배양하여 신초를 유도한다.

상기 배양의 기간은 6~10 주간이 바람직하고, 가장 바람직하게는 8 주간이다.

상기와 같은 배양 조건으로 정금나무 정아 절편체를 배양시, 신초유도율이 우수하면서도, 신초길이가 길고 신초 수도 많은 다신초를 유도할 수 있다 (표 1, 도 1).

단계 ii) 신초의 기외 발근을 통한 식물체 재분화

다신초에서 유래된 신초를 상토에 삽목하여 기외 발근을 통하여 식물체로 재분화시킨다.

본 단계에서 신초로는 다신초에서 정아 부분을 제거하고 액아가 4∼6개가 포함되도록 줄기 길이를 2.5∼3 cm로 절단하여 사용한다.

본 단계에서 기외 발근은 신초에 발근 유도를 위한 옥신을 처리 후, 상토에 삽목하여 발근을 유도하여 식물체로 재분화하는 것으로 수행된다.

본 단계에서 발근 유도를 위한 옥신 처리는 0.5 ~ 1.0 g/L 인돌-3-뷰티르산 (IBA, Indole-3-butyric acid) 용액에 옥신 운반체 (옥신 흡수를 용이하게 해주는) 탈크(Talc)를 1 : 1 (v:w)로 혼합 후 신초의 절단면에 묻혀서 사용하고, 가장 바람직하게는 1.0 mg/L IBA 용액을 사용한다.

본 단계에서 기외 발근 환경은 25±1℃에서 1일 15~17시간, 30~50mol·m^-2·s^-1 조명, 습도 80~90%이 유지되는 조건하에 수행한다. 바람직하게는 25℃에서 1일 16시간 40 μmol·m^-2·s^-1 범위 내에서 조명이 유지되는 조건하에 수행한다.

상기 기외 발근 기간은 6 ~ 10 주간이 바람직하고, 가장 바람직하게는 8 주간이다.

상기와 같은 조건으로 기외 발근시 정금나무 신초는 발근이 잘 진행되어 발근율이 높으면서도 줄기 길이도 길어 제대로 성장된 식물체로 분화된다. 이에 따라서, 기내 발근에 비하여, 6.7 ~ 9.4배 증진된 정금나무 조직배양 묘목의 생산률(재분화율)을 나타낸다 (표 2, 도 2).

통상적으로는 조직배양 묘목을 생산시 배양배지를 이용하는 기내 발근을 이용하는 것이 재분화율이 높다는 것이 상식적이었으나, 정금나무 신초의 경우, 놀랍게도, 상기와 같이 기외 발근을 이용할 경우 현저히 증진된 재분화율을 나타내고, 최종적으로 조직배양 묘목의 생산률을 현저히 증진시킨다.

또한 기외 발근을 통하는 본 단계를 거침에 의해, 본 발명의 생산방법은 추가적인 순화 단계가 필요치 않아서 묘목 생산기간이 현저히 단축될 수 있다.

iii) 육묘

식물체를 토양에 이식하여 육묘한다.

단계 ii)로부터의 분화된 식물체를 토양(폿트)에 이식한 후 4 ~ 5 개월 동안 길러 정식으로 심기에 가장 적합한 양질의 묘목으로 대량생산한다.

본 발명의 생산방법에 따르면, 양질의 정금나무 조직배양 묘목을 대량으로 생산할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적에 따라서, 본 발명은 상기 생산방법에 의해 생산된 정금나무 조직배양 묘목을 제공한다.

본 발명에 따른 정금나무 조직배양 묘목은, 생장이 양호하여 대량 과실수 재배용으로 적합하다.

본 발명에 따른 정금나무 조직배양 묘목의 대량 생산방법에 의하면, 통상적으로 이루어지는 기내 발근 대신에, 기외 발근을 이용함에 의해 정금나무 신초의 발근율(재분화율)이 최대 80%로 현저히 증진되고, 더불어 별도의 환경 순화 과정이 필요치 않아서 건전한 정금나무 조직배양 묘목을 단시간에 대량으로 생산할 수 있다.

본 발명에 따른 정금나무 조직배양 묘목의 대량 생산방법은 통상적인 기내 발근에 의한 방법에 비하여 생산률(재분화율)이 최대 9.4배 증진된다.

또한 본 발명에 따른 정금나무 조직배양 묘목은 우수한 유전형질을 갖는 모본과 동일한 유전형질을 가지므로 과수농가 보급용으로 유용하다.

도 1a는 정금나무 정아 절편체의 식물생장호르몬 종류 및 농도에 따른 다신초 유도 결과를 보여주는 사진이다. a는 1.0 mg/L 제아틴, b는 2.0 mg/L 제아틴, c는 5.0 mg/L 제아틴, d는 1.0 mg/L 씨디아주론, e는 2.0 mg/L 씨디아주론, f는 5.0 mg/L 씨디아주론, g는 1.0 mg/L 6-벤질아미노퓨린, h는 2.0 mg/L 6-벤질아미노퓨린, I는 5.0 mg/L 6-벤질아미노퓨린, j는 1.0 mg/L 6-(γ,γ-디메틸알릴)아미노퓨린, k는: 2.0 mg/L 6-(γ,γ-디메틸알릴)아미노퓨린, l는 5.0 mg/L 6-(γ,γ-디메틸알릴)아미노퓨린의 식물생장호르몬을 사용한 결과이다. 도 1b는 k의 확대사진이다.
도 2는 정금나무 신초의 식물생장호르몬에 따른 기내발근 결과를 보여주는 사진이다. a는 대조구 (옥신 무첨가), b는 0.5 mg/L NAA, c는 1.0 mg/L NAA, d는 2.0 mg/L NAA, e는 5.0 mg/L NAA, f는 0.5 mg/L IBA, g는 1.0 mg/L IBA, h는 2.0 mg/L IBA, i는 5.0 mg/L IBA의 옥신을 사용한 결과이다.
도 3는 정금나무 신초의 상토 삽목을 통한 기외발근 과정과 결과를 보여주는 사진이다.
도 4a 및 도 4b는 정금나무 신초의 플러그 삽목을 통한 기외발근 과정과 결과를 보여주는 사진이다.
도 5는 본 발명에 따라 재분화된 식물체(정금나무)를 토양(폿트)에 이식하여 육묘 과정을 보여주는 사진이다.
도 6은 본 발명의 따라 생산된 정금나무 조직배양 묘목를 보여주는 사진이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 구체적인 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 보다 상세히 설명하기로 한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 보다 명확하게 이해시키기 위하여 예시한 것일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 정금나무 정아 절편체 배양을 통한 다신초 유도

정금나무 정아 절편체는 정아를 포함하는 줄기 끝부분을 1cm 정도 길이로 절단하여 준비하였다.

정아 절편체 25 개씩을 하기 표 2과 같은 종류와 농도의 식물생장호르몬 [제아틴, 6-벤질아미노퓨린(6-Benzylaminopurine; BA), 6-(γ,γ-디메틸알릴)아미노퓨린 (6-(γ,γ-Dimethylallyl)aminopurine), 또는 씨디아주론(Thidiazuron; TDZ)], 3% 수크로스 및 0.35% 젤라이트가 첨가된 고체상 MS(Murashige and Skoog) 배지 (표 1)에 이식한 후 8주간 배양하여 다신초를 유도하였다. 배지는 pH 5.7로 조정 후 고압멸균기에서 121℃, 15기압 하에서 20분간 살균 후 사용하고, 살균된 유리병(6.4×11cm) 배양용기에 50mL의 배지를 분주하여 사용하였고 정금나무 정아 절편체는 배양병 당 5개씩 치상하였다.

		원소이름	mg/L
MS 기본배지	미량원소	CoCl₂.6H₂O	0.025
		CuSO₄.5H₂O	0.025
		FeNaEDTA	36.70
		H₃BO₃	6.20
		KI	0.83
		MnSO₄.H₂O	16.90
		Na₂MoO₄.2H₂O	0.25
		ZnSO₄.7H₂O	8.60
	대량원소	CaCl₂	332.02
		KH₂PO₄	170.00
		KNO₃	1900.00
		MgSO₄	180.54
		NH₄NO₃	1650.00
	비타민	Glycine	2.00
		myo-Inositol	100.00
		Nicotinic acid	0.50
		Pyridoxine HCl	0.50
		Thiamine HCl	0.10
식물생장호르몬		4종 중 하나	1 ~ 5
탄소원		Sucrose	30000
경화제		Gelrite	3500
산도(pH)		5.7

배양 환경은 온도 25±1℃에서 1일 16시간 조명(냉백색 형광등, 30~50 μmol·m^-2·s^-1)으로 유지하였다. 배양 결과 사진을 도 1에 도시했고, 신초 유도율, 신초 수, 신초 길이를 평균내어 산출하여 그 결과를 표 2에 나타내었다.

식물생장호르몬 종류 및 농도 (mg/L)		신초 유도율 (%)	신초 수 (개)	신초 길이 (mm)
제아틴	1.0 (a)	100.0	5.8 ± 2.4	34.1 ± 2.4
	2.0 (b)	100.0	7.5 ± 2.8	31.5 ± 2.9
	5.0 (c)	100.0	23.5 ± 10.4	4.4 ± 0.4
씨디아주론 (TDZ)	1.0 (d)	84.0	12.2 ± 6.3	5.3 ± 1.4
	2.0 (e)	88.0	10.2 ± 5.4	5.3 ± 1.1
	5.0 (f)	100.0	8.0 ± 5.3	5.0 ± 1.3
6-벤질아미노퓨린 (BA)	1.0 (g)	0	0	0
	2.0 (h)	0	0	0
	5.0 (i)	0	0	0
6-(γ,γ-디메틸알릴)아미노퓨린	1.0 (g)	88.0	5.2 ± 2.9	38.9 ± 2.7
	2.0 (k)	100.0	7.4 ± 3.0	51.7 ± 5.5
	5.0 (l)	92.0	4.3 ± 1.6	25.5 ± 3.2

도 1a 및 표 2에 나타낸 바에 의하면, 6-벤질아미노퓨린을 첨가한 배양배지에서는 농도와 상관없이 정금나무 정아 절편체로부터 신초가 전혀 유도되지 않았고, 제아틴을 첨가한 배양배지에서는 신초 유도율은 100%로 나타나고 신초 수도 많았으나, 신초 길이가 충분치 않았다. 씨디아주론을 첨가한 배양배지에서는 신초 수는 가장 많았으나, 신초 길이가 미흡하였다.

이에 비하여 본 발명에 따라 1.0 ~ 2,0 mg/L 농도로 6-(γ,γ-디메틸알릴)아미노퓨린 첨가한 배양배지에서는 신초 유도율이 높고, 신초 수도 많았으며 이에 더불어 신초 길이도 충분히 길어 정금나무 정아 절편체로부터 다신초가 잘 유도됨을 확인할 수 있다. 특히 2,0 mg/L 농도로 6-(γ,γ-디메틸알릴)아미노퓨린 첨가한 배양배지에서는 신초 유도율 100%, 신초 수 7.4 ± 3.0개, 신초 길이 51.7 ± 5.5mm로 현저히 우수하였다 (도 1b). 따라서 정금나무의 다신초 유도를 위해서는 식물생장호르몬 중에서 6-(γ,γ-디메틸알릴)아미노퓨린를 첨가하는 것이 가장 효과적이며, 신초 길이(생장 촉진)까지 고려할 경우 가장 바람직한 첨가 농도는 2.0mg/L임을 확인할 수 있다.

비교예 1: 기내 발근을 통한 식물체 재분화 및 순화

<기내 발근>

실시예 1 (k 그룹)에서와 같이 유도된 다신초로부터 액아 4∼6개가 포함되도록 줄기를 2.5∼3 cm로 절단하여 신초를 준비하였다.

준비된 신초들을 각각 30 개씩을 하기 표 3과 같은 종류와 농도의 옥신 (인돌-3-뷰티르산(IBA, indole-3-butyric acid) 또는 1-나프탈렌아세트산 (NAA, 1-Naphthaleneacetic acid)과 1% 수크로스 및 0.35 젤라이트가 첨가된 MS 배지에 이식하여 8주간 배양하여 발근을 유도하였다. 배양 환경은 온도 25℃에서 1일 16시간 조명(냉백색 형광등, 30~50 μmol·m^-2·s^-1)으로 유지하였다. 각 그룹의 신초의 발근율, 뿌리 수 및 뿌리 길이를 평균내어 산출하여 그 결과를 표 3에 나타내었다. 발근 유도되어 재분화된 식물체의 사진을 도 2에 나타냈다.

옥신 (mg/L)		발근율 (%)	뿌리수 (개)	뿌리길이 (mm)
Control	0 (a)	3.3	1.0	23.2
IBA	0.5 (f)	30.0 ± 10.0	2.4 ± 2.2	17.6 ± 7.5
	1.0 (g)	30.0 ± 10.0	3.7 ±3.5	20.0 ± 6.3
	2.0 (h)	43.3 ± 30.0	8.4 ± 7.7	19.3 ± 5.0
	5.0 (i)	60.0 ± 10.0	10.1 ± 7.1	14.3 ± 2.8
NAA	0.5 (b)	60.0 ± 26.5	5.2 ± 3.6	12.8 ± 2.6
	1.0 (c)	66.7 ± 20.8	8.2 ± 4.2	10.7 ± 1.8
	2.0 (d)	86.7 ± 15.3	7.1 ± 4.0	3.7 ± 1.2
	5.0 (e)	10.0 ± 10.0	3.3 ± 2.1	1.7 ± 0.5

도 2에 나타낸 바와 같이, 정아나무 신초를 NAA를 첨가한 배양 배지에서 (b~e) 기내 발근시 캘러스가 과형성되어 뿌리 내림이 원활하지 않음을 확인할 수 있고, IBA를 첨가한 배양 배지에서 기내 발근시도 캘러스가 형성되어 뿌리 내림이 잘 이루어지지 않았다.

표 3에 나타낸 바와 같이, 0.5 ~ 5.0 mg/L 농도로 IBA를 첨가한 배양배지에서는 기내 발근시 모두 정아나무 신초의 발근율이 60% 이하로 낮았으며, 저농도의 NAA를 첨가한 배양배지에서는 기내 발근시 정아나무 신초의 발근율이 마찬가지로 낮았으며, 고농도(2.0 ~ 5,0 mg/L)의 NAA를 첨가한 배양배지에서는 기내 발근시 정아나무 신초의 발근율은 높았으나, 뿌리 길이가 3.7mm 이하로 미흡하였다.

<순화>

기내 발근을 통해 재분화된 어린 식물체를 각각 30 개씩 순화용기 내 원예용상토(팜한농)에 이식하여 4주간 생장시켰다. 이식 후 충분히 관수하고 순화용기 덮개로 덮어줌으로써 순화용기 내 습도를 80~90%로 유지하였다. 순화실 배양 환경은 온도 25±1℃에서 1일 16시간, 30~50mol·m^-2·s^-1 조명으로 유지하였다.

4주간 생장 후 순화묘(정금나무)의 생존율을 산출하였으며 그 결과를 표 4에 나타냈다.

옥신 (mg/L)		생존율 (%)
Control		8.9± 2.1
IBA	0.5	8.3 ± 1.9
	1.0	11.8 ± 2.4
	2.0	6.7 ± 1.7
	5.0	2.3 ± 0.4
NAA	0.5	0
	1.0	0
	2.0	0
	5.0	0

표 4에서 확인할 수 있듯이, 0.5 ~ 5.0 mg/L 농도의 NAA 첨가 배지에서 발근된 식물체의 경우 모두 고사되었고 (생존율 0%), IBA 첨가 배지에서 발근된 식물체의 경우도 최대 생존율이 11.8%로 현저하게 낮게 나타나서, 기내 발근으로 재분화된 정금나무는 순화가 제대로 이루어지지 않음을 알 수 있다.

상기와 같이 기내 발근의 경우 식물체의 순화율이 11.8% 이하로 낮게 나타난 이유는 뿌리가 줄기 하단부에서 직접 형성되지 않고, 하단부 절단면에 캘러스가 먼저 과잉 형성되면서 캘러스 표면에서 뿌리가 발생하였기 때문에 토양순화 과정에서 식물체가 정상적으로 생장하지 못하고 고사된 것으로 판단된다.

결과적으로, 정금나무 신초의 기내 발근을 통한 조직배양 묘목의 생산 효율성은 매우 낮은 것으로 나타났다.

실시예 2: 기외 발근을 통한 식물체 재분화 및 육묘

<기외 발근>

준비된 신초들을 각각 30 개씩을 하기 표 5와 같은 농도의 옥신 처리 후에 플러그(FLEXI-PLPUG) 삽목 또는 상토(팜한농) 삽목하여 기외 발근을 유도하여 식물체로 재분화시켰다. 옥신 처리는 인돌-3-뷰티르산 (IBA, Indole-3-butyric acid) 용액 2.0 mL에 옥신 운반체(옥신 흡수를 용이하게 해줌) Talc (삼전화학, 일본) 2.0 g 혼합 후 신초의 절단면에 묻혔다.

기외 발근은 삽목 콘테이너(54×28×6.5 cm)내의 공중습도는 90%으로 유지하였고 25℃에서 1일 16시간 40 μmol·m^-2·s^-1 범위 내에서 조명이 유지되는 조건하에 8주간 실시하였으며, 발근율과 뿌리 길이 및 줄기 길이를 측정하고 산출하여 그 결과를 도 3 내지 도 4b, 표 5에 나타냈다.

삽목방법	IBA (g/L)	발근율 (%)	뿌리 길이 (mm)	줄기 길이 (mm)
플러그삽목	0	20.0 ± 10.0	23.5 ± 2.1	34.6 ± 3.0
	0.05	40.0 ± 10.0	24.3 ± 3.7	31.7 ± 4.7
	0.1	26.7 ± 15.3	24.8 ± 3.5	34.7 ± 3.9
	0.5	50.0 ± 10.0	27.9 ± 4.3	34.1 ± 7.4
	1.0	36.7 ± 11.6	32.7 ± 5.2	35.3 ± 6.4
	2.0	24.5 ± 10.4	25.3 ± 4.1	32.6 ± 5.9
상토삽목	0	0	0	0
	0.05	33.3 ± 5.8	18.1 ± 4.3	40.3 ± 8.2
	0.1	46.7 ± 15.3	27.0 ± 4.7	37.3 ± 8.5
	0.5	63.3 ± 15.3	33.8 ± 5.4	42.1 ± 10.2
	1.0	80.0 ± 17.3	32.9 ± 5.1	41.7 ± 5.6
	2.0	57.8 ± 14.3	28.4 ± 3.8	38.4 ± 7.5

도 3은 플러그 삽목을 이용한 정금나무 신초의 기외 발근 과정 (위)과 재분화된 정금나무 식물체의 사진이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 재분화된 식물체 전반적으로 뿌리 및 줄기의 생장이 미흡하였다.

도 4a 및 도 4b는 상토 삽목을 이용한 정금나무 신초의 기외 발근 과정과 재분화된 정금나무 식물체의 사진이다. 도 4a 및 도 4b에 나타낸 바와 같이, 재분화된 식물체 전반적으로 뿌리 및 줄기의 생장이 잘 이루어진 것을 확인할 수 있다.

표 5는 삽목 방법 및 옥신(IBA) 처리 농도에 따른 정금나무 신초의 기외 발근 유도 및 줄기 생장 효과를 나타낸 것이다.

플러그 삽목으로 기외 발근시에는 옥신 처리 농도에 상관없이 전체적으로 정금나무 신초의 발근율이 50% 이하로 낮았고, 뿌리 길이 및 줄기 생장도 미흡하였다.

이에 비하여 상토 삽목으로 기외 발근시에는 1.0 mg/L IBA가 처리된 정금나무 신초의 발근율이 80.0%로 가장 높게 나타났고, 뿌리 및 줄기 길이는 0.5 mg/L IBA가 처리된 정금나무 신초가 각각 33.8mm 및 42.1mm로 가장 높게 나타났다. 따라서 정금나무의 신초의 기외 발근에는 상토 삽목과 IBA 0.5 ~ 1.0 mg/L 처리가 바람직하며, 가장 바람직하게는 IBA 1.0 mg/L 처리이다.

비교예 1의 기내 발근을 통한 재분화(IBA 0.5 ~ 1.0 mg/L 처리와 비교)와 비교시, 본 발명에 따른 기외 발근을 통한 재분화는 6.7 ~ 9.4배 증진되었음을 확인할 수 있다.

상토 삽목을 통한 정금나무 신초의 기외 발근 유도시, 기내 발근과 달리, 과도한 캘러스 형성없이 뿌리 내림이 이루어져서 뿌리 형성이 잘 이루어져서 재분화가 원활히 이루어진 것으로 판단된다.

<육묘>

상기와 같이 재분화된 정금나무 식물체를 폿트 내의 토양으로 이식하여 온실에서(관수는 주 1~2회 실시) 4개월 길러 정식으로 심기에 가장 적합한 양질의 묘목으로 대량생산하였고 (도 5), 그 결과 사진을 도 6에 나타내고, 4개월 육묘 후의 생존율을 산출하여 표 6에 나타냈다.

삽목방법	IBA (g/L)	생존율 (%)
상토 삽목	0	-
	0.05	100.0
	0.1	100.0
	0.5	100.0
	1.0	100.0
	2.0	100.0

표 6에 나타낸 바에 의하면, 상토 삽목을 이용하여 기외 발근으로 재분화된 정금나무 식물체의 육묘를 통한 생존율은 모두 100%로 나타났다.

본 발명에서 기외 발근로부터 재분화된 정금나무 식물체 토양순화도 동시에 이루어지기 때문에 별도의 추가적인 순화단계 없이 조직배양 묘목을 육성할 수 있었다.

Claims

i) 정금나무의 정아 절편체를 2.0 mg/L의 6-(γ,γ-디메틸알릴)아미노퓨린이 첨가된 고체상의 MS(Murashige and Skoog) 배지에서 기내 배양하여 다신초를 유도하는 단계;
ii) 다신초에서 유래된 신초의 절단면을 1.0 g/L 인돌-3-뷰티르산과 탈크를 1 : 1(v:w)로 혼합한 용액으로 처리한 후 상토에 삽목하여 기외 발근을 통하여 식물체로 재분화시키는 단계; 및
iii) 식물체를 토양에 이식하여 육묘하는 단계:를 포함하고,
단계 i)에서 다신초 유도율이 100%이고 신초길이가 51mm 이상이고,
단계 ii)에서 재분화율이 80%인 것인,
한국 자생 정금나무 조직배양 묘목의 대량 생산방법.
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