CN111972288B - 一种百香果离体保存及增殖再生方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种紫果型和黄金百香果离体保存方法。将两种百香果高度为2～3cm的组培苗转接于离体保存培养基MS+PP₃₃₃0.5～4.0mg·L^‑1+蔗糖30g·L^‑1+琼脂3.5g·L^‑1中进行离体保存培养；离体保存330d，成活率可达80％。将保存的紫果型和黄金百香果材料转接于适合的增殖培养基中进行再生增殖，二者再生率都为100％，增殖系数分别可达4.0和4.8，连续培养多代，增殖系数分别可维持在4.27/30d和5.0/30d。对经过所述增殖培养的增殖苗(丛生芽)进行20d的生根培养时，根长均能达到4～5cm，生根率均达到95％以上，且每株平均生根数量5～6条，根系均匀洁白、有韧性，更易于清洗和移栽。

Description

一种百香果离体保存及增殖再生方法

技术领域

本发明属于果木离体保存技术领域，具体涉及一种百香果离体保存方法。

背景技术

百香果(Passiflora edulia Sims)，又名鸡蛋果、西番莲，为西番莲科西番莲属的藤本植物，是热带、亚热带多年生常绿藤本浆果类果树。百香果的果肉具有香蕉、菠萝、草莓、柠檬、荔枝等百余种水果的浓郁香味，芳香怡人，富含多种维生素、必需氨基酸、类胡萝卜素等多种成分，具有美容养颜、抗衰老等功效，故有“果汁之王”的美誉，可生食、制汁。

由于百香果果实具有极高的营养价值，且其属多年生常绿攀缘性藤本水果，生长旺盛，从种植到收获一般几个月，投产早，高产稳产，果实耐运输，销路广，经济效益较高。因此，市场对百香果的需求量逐年上升。在我国台湾、福建、广东、海南等地均有栽培。

目前我国自主培育的百香果优良新品种较少，良种化程度低，生产上使用的优良品种除了我国南方一些育种单位或个人自主培育外，大多从台湾、东南亚和非洲等热带地区引进。由于外部品种引进和繁殖方式缺乏统一的管理规范，不同种植户(或公司)都有各自的引种渠道和育苗方式，新引进的品种普遍存在未经试种和驯化就直接推广种植的现象；导致许多种植户对于新引进的百香果品种的优劣性并不十分了解，缺乏对各个品种适用性的认知，不能根据当地土质、气候等条件选择恰当的品种；造成了目前栽培生产中品种参差不齐、劣质果苗泛滥成灾、产量和品质不稳定等问题，从而影响了我国百香果种植业的发展。这些问题产生的根本原因主要归咎于我国百香果品种选育研究落后于产业发展的步伐。因此，收存并利用现有的百香果优良种质资源，从中选出优异基因，进一步开展优良品种选育研究，对解决上述问题并促进我国百香果产业发展十分重要。而在对百香果优良种质资源进行种质圃收存的过程中，我们发现，由于茎腐病和病毒病等危害，种质圃保存第二年之后，所有引种植株均丧失了生长和结果能力，无法达到种质收存的目的。针对大田种质圃受到茎腐病和病毒病危害无法保存种质的问题，开展其种质离体保存研究，能够为百香果优良株系筛选和新品种培育奠定基础。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种百香果种质离体保存方法，尽可能延长单代保存时间，并保有相对较高的保存成活率，且保证保存后材料具有正常稳定的增殖和生根能力，以便为百香果优良品种保护和新品种培育等研究工作提供技术方法和材料支撑。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种百香果离体保存方法，包括以下步骤：

(1)百香果种质离体保存：将高度为2～3cm的百香果组培苗转接于离体保存培养基中进行离体保存培养；所述离体保存培养基以MS培养基为基础培养基，还包括：PP₃₃₃0.5～4.0mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1和琼脂3.5g·L^-1，培养时间为330d，超过此期限，培养基颜色加深，全部变为黄色，材料逐步黄化死亡；

(2)将步骤(1)中不继代保存330d的紫果型百香果离体保存材料转接于增殖培养基中进行增殖培养得到增殖苗；所述增殖培养基以MS培养基为基础培养基，增殖培养基还包括：6-BA 1.5～2.5mg·L^-1、IAA 0.1～0.3mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1和琼脂3.5g·L^-1，将步骤(1)中不继代保存330d的黄金百香果离体保存材料转接于增殖培养基中进行增殖培养得到增殖苗；所述增殖培养基以MS培养基为基础培养基，还包括：6-BA 0.5～1.5mg·L^-1、IAA0.1～0.3mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1和琼脂3.5g·L^-1；

(3)离体保存后的百香果生根培养：将所述增殖苗接种于生根培养基上进行生根培养，得百香果生根苗；所述生根培养基以1/2MS为基本培养基，还包括：NAA 0.2～0.4mg·L^-1、蔗糖20.0g·L^-1和卡拉胶4.0g·L^-1。

优选的，步骤(1)所述离体保存、步骤(2)所述增殖培养、步骤(3)所述的生根培养为光照培养，所述光照培养的温度均为28±3℃，光照时间均为12h/d，光照强度均为40μmol·m^-2·s^-1。

优选的，步骤(3)得到百香果生根苗后，还包括炼苗和移栽；

优选的，所述炼苗为将百香果组培快繁苗置大棚中炼苗7d，所述大棚的遮阴度为70％。

优选的，所述移栽为将炼苗后的生根苗移栽入基质中，所述基质包括腐殖土和泥炭土。

优选的，所述腐殖土和泥炭土的体积比为1：2。

本发明提供了一种百香果离体保存方法，将百香果高度为2～3cm的组培苗转接于离体保存培养基中进行离体保存培养；离体保存330d，成活率可达80％。将保存的紫果型百香果材料转接于适合的增殖培养基中进行再生增殖，再生率100％，增殖系数可达4.0，连续培养多代，增殖系数可维持在4.27/30d。将保存的黄金百香果材料转接于适合的增殖培养基中进行再生增殖，再生率100％，增殖系数可达4.8，连续培养多代，增殖系数可维持在5.0/30d。对经过所述增殖培养的增殖苗(丛生芽)进行20d的生根培养，根长均能达到4～5cm，生根率均达到95％以上，且每株平均生根数量5～6条，根系均匀洁白、有韧性，易于清洗和移栽。应用本发明的方法能够解决百香果种质大田保存由于茎腐病和病毒病等危害无法长期保存的同时，还能够通过再生增殖培养快速获得大量组培苗，为百香果高效低成本的种质保存及种苗快繁提供支撑。

附图说明

图1为本发明实施例1中离体保存结果图；

图2为本发明实施例2中生根培养结果图；

图3为本发明实施例2中移栽结果图；

图4为本发明实施例10中紫果型百香果连续增殖培养结果图；

图5本发明实施例10中黄金百香果连续增殖培养结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种百香果离体保存方法，包括以下步骤：

1)百香果种质离体保存：将高度为2～3cm的百香果组培苗转接于离体保存培养基中进行离体保存培养；所述离体保存培养基以MS培养基为基础培养基，还包括：PP₃₃₃0.5～4.0mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1和琼脂3.5g·L^-1，培养时间为330d；

2)将步骤(1)中不继代保存330d的紫果型百香果离体保存材料转接于增殖培养基中进行增殖培养得到增殖苗；所述增殖培养基以MS培养基为基础培养基，增殖培养基还包括：6-BA 1.5～2.5mg·L^-1、IAA 0.1～0.3mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1和琼脂3.5g·L^-1，将步骤(1)中不继代保存330d的黄金百香果离体保存材料转接于增殖培养基中进行增殖培养得到增殖苗；所述增殖培养基以MS培养基为基础培养基，还包括：6-BA 0.5～1.5mg·L^-1、IAA0.1～0.3mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1和琼脂3.5g·L^-1；

4)离体保存后的百香果生根培养：将所述增殖苗接种于生根培养基上进行生根培养，得百香果生根苗；所述生根培养基以1/2MS为基本培养基，还包括：NAA 0.2～0.4mg·L^-1、蔗糖20.0g·L^-1和卡拉胶4.0g·L^-1。

本发明所述百香果离体保存方法中，首先将高度为2～3cm的百香果组培苗转接于离体保存培养基中进行离体保存培养；所述离体保存培养基以MS培养基为基础培养基，还包括：PP₃₃₃0.5～4.0mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1和琼脂3.5g·L^-1。本发明所述的离体保存培养基中包括PP₃₃₃，所述的PP₃₃₃在所述的离体保存培养基中的浓度优选为1.0～3.0mg·L^-1，更优选为2.0mg·L^-1。本发明所述离体保存培养基包括蔗糖30g·L^-1。本发明所述离体保存培养基包括琼脂3.5g·L^-1。本发明对所述离体保存培养基的各原料试剂来源并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂即可。本发明对所述离体保存培养基的制备方法并没有特殊限定，优选的得到所述离体保存培养基后，调节所述培养基pH为5.8。本发明所述离体培养优选为光照培养，所述光照培养的温度优选为28±3℃，光照时间优选为12h/d，光照强度优选为40μmol·m^-2·s^-1。利用本发明所述优选的离体保存培养基进行离体培养，不继代保存330d，离体保存材料植株形态正常，成活率80％以上，转接继代增殖培养基后再生率100％。

将在离体保存培养基中培养330d的紫果型百香果材料裁剪成包含1～2个腋芽的茎段，置于增殖培养基中进行增殖培养，得丛生苗；所述的增殖培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：6-BA 1.5～2.5mg·L^-1、IAA 0.1～0.3mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1和琼脂3.5g·L^-1。本发明所述的增殖培养基中包括6-BA，所述的6-BA在所述的增殖培养基中的浓度优选为1.8～2.2mg·L^-1，更优选为2.0mg·L^-1。本发明所述的增殖培养基中包括IAA，所述的IAA在所述的增殖培养基中的浓度优选为0.15～0.25mg·L^-1，更优选为0.2mg·L^-1。本发明所述增殖培养基包括蔗糖30g·L^-1。本发明所述增殖培养基包括琼脂3.5g·L^-1。本发明对所述增殖培养基的各原料试剂来源并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂即可。本发明对所述增殖培养基的制备方法并没有特殊限定，优选的得到所述增殖培养基后，调节所述培养基pH为5.8。本发明所述增殖培养优选为光照培养，所述光照培养的温度优选为28±3℃，光照时间优选为12h/d，光照强度优选为40μmol·m^-2·s^-1。利用本发明所述优选的增殖培养基对紫果型百香果材料进行增殖培养，增殖培养30d，增殖系数可达4.0，丛生苗叶片鲜绿、植株健壮，进行后续的增殖培养，增殖系数稳定在4.27/30d以上。

将在离体保存培养基中培养330d的黄金百香果材料裁剪成包含1～2个腋芽的茎段，置于增殖培养基中进行增殖培养，得丛生苗；所述的增殖培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：6-BA 0.5～1.5mg·L^-1、IAA 0.1～0.3mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1和琼脂3.5g·L^-1。本发明所述的增殖培养基中包括6-BA，所述的6-BA在所述的增殖培养基中的浓度优选为0.8～1.2mg·L^-1，更优选为1.0mg·L^-1。本发明所述的增殖培养基中包括IAA，所述的IAA在所述的增殖培养基中的浓度优选为0.15～0.25mg·L^-1，更优选为0.2mg·L^-1。本发明所述增殖培养基包括蔗糖30g·L^-1。本发明所述增殖培养基包括琼脂3.5g·L^-1。本发明对所述增殖培养基的各原料试剂来源并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂即可。本发明对所述增殖培养基的制备方法并没有特殊限定，优选的得到所述增殖培养基后，调节所述培养基pH为5.8。本发明所述增殖培养优选为光照培养，所述光照培养的温度优选为28±3℃，光照时间优选为12h/d，光照强度优选为40μmol·m^-2·s^-1。利用本发明所述优选的增殖培养基对黄金百香果材料进行增殖培养，增殖培养30d，增殖系数可达4.8，丛生苗叶片鲜绿、植株健壮，进行后续的增殖培养，增殖系数稳定在5.0/30d以上。

得增殖苗后，本发明将所述增殖苗接种于生根培养基上进行生根培养，得百香果生根苗；所述生根培养基以1/2MS为基本培养基，还包括：NAA 0.2～0.4mg·L^-1、蔗糖20.0g·L^-1和卡拉胶4.0g·L^-1。本发明优选将所述增殖苗从基部剪下转入生根培养基中进行生根培养，所述生根培养的时间优选为20d。本发明所述的生根培养基中包括NAA，所述NAA在所述的生根培养基中的浓度优选为0.25～0.35mg·L^-1，更优选为蔗糖0.3mg·L^-1。

本发明所述生根培养的温度优选为28±3℃，光照时间优选为12h/d，光照强度优选为40μmol·m^-2·s^-1。在本发明中，经过20d的生根培养，根长可达4～5cm，生根率都能达到95％以上。本发明所述生根培养基中以卡拉胶作为固体支撑物，可使根系均匀洁白、有韧性，易于清洗和移栽。本发明所述生根培养基包括蔗糖20g·L^-1。本发明所述生根培养基包括卡拉胶4.0g·L^-1。本发明对所述生根培养基的各原料试剂来源并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂即可。本发明对所述生根培养基的制备方法并没有特殊限定，优选的得到所述生根培养基后，调节所述培养基pH为5.8。

本发明在得到百香果生根苗后，优选还包括炼苗和移栽。本发明所述炼苗优选为将所述百香果脱毒苗置于70％遮阴度的大棚中炼苗7d，炼苗结束后，取出生根苗并洗净根部培养基，移栽于已消毒的移栽基质中，在温室大棚培养14d后，成活率在90％以上。本发明所述移栽基质优选为腐殖土和泥炭土的混合基质，所述混合基质中腐殖土和泥炭土的体积比优选为1：2。

下面结合实施例对本发明提供的百香果离体保存方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1)将高度为2～3cm的百香果组培苗转接于离体保存培养基中进行离体保存培养；光照培养330d，离体材料高度9～10cm，叶片鲜绿，植株健壮，成活率80％(如图1所示)。紫果型百香果材料和黄金百香果材料在高度和成活率等方面没有显著性差异；所用离体保存培养基配方为MS+PP₃₃₃2.0 mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，PH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

2)将所得不继代保存330d的紫果型百香果离体保存材料转接于增殖培养基中进行增殖培养，光照30d，增殖系数3.4/30d；所用增殖培养基配方为：MS+6-BA 1.5mg·L^-1+IAA0.1mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

3)将所得不继代保存330d的黄金百香果离体保存材料转接于增殖培养基中进行增殖培养，光照30d，增殖系数2.1/30d；所用增殖培养基配方为：MS+6-BA 0.5mg·L^-1+IAA0.1mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

4)将增殖培养所得丛生苗分株转入生根培养基上进行生根培养，每个培养瓶中转入8～10株，光照培养20d，得百香果生根苗；统计它们的平均根长4.6cm、平均生根数3.5条、生根率95％，且紫果型和黄金百香果材料之间没有显著性差异；所用生根培养基配方为：1/2MS+NAA 0.2mg·L^-1+蔗糖20g·L^-1+卡拉胶4.0g·L^-1，pH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。将百香果生根苗置于70％遮阴度的大棚中炼苗7d后，取出并洗净根部培养基，移栽于装有消过毒的移栽基质(腐殖土：泥炭土＝1:2)的营养杯中，在温室大棚培养14天后，成活率90％以上。

实施例2

1)同实施例1中的步骤1)。

2)将所得不继代保存330d的紫果型百香果离体保存材料转接于增殖培养基中进行增殖培养，光照30d，增殖系数3.6/30d；所用增殖培养基配方为：MS+6-BA 1.5mg·L^-1+IAA0.2mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

3)将所得不继代保存330d的黄金百香果离体保存材料转接于增殖培养基中进行增殖培养，光照30d，增殖系数2.3/30d；所用增殖培养基配方为：MS+6-BA 0.5mg·L^-1+IAA0.2mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

4)将增殖培养所得丛生苗分株转入生根培养基上进行生根培养，每个培养瓶中转入8～10株，光照培养20d，得百香果生根苗(如图2所示)；统计它们的平均根长4.9cm、平均生根数5.0条、生根率96％，且紫果型和黄金百香果材料之间没有显著性差异；所用生根培养基配方为：1/2MS+NAA 0.3mg·L^-1+蔗糖20g·L^-1+卡拉胶4.0g·L^-1，pH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。将百香果生根苗置于70％遮阴度的大棚中炼苗7d后，取出并洗净根部培养基，移栽于装有消过毒的移栽基质(腐殖土：泥炭土＝1:2)的营养杯中，在温室大棚培养14天后，成活率90％以上(如图3所示)。

实施例3

1)同实施例1中的步骤1)。

2)将所得不继代保存330d的紫果型百香果离体保存材料转接于增殖培养基中进行增殖培养，光照30d，增殖系数3.6/30d；所用增殖培养基配方为：MS+6-BA 1.5mg·L^-1+IAA0.3mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

3)将所得不继代保存330d的黄金百香果离体保存材料转接于增殖培养基中进行增殖培养，光照30d，增殖系数2.4/30d；所用增殖培养基配方为：MS+6-BA 0.5mg·L^-1+IAA0.3mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

4)将增殖培养所得丛生苗分株转入生根培养基上进行生根培养，每个培养瓶中转入8～10株，光照培养20d，得百香果生根苗；统计它们的平均根长4.7cm、平均生根数4.0条、生根率95％，且紫果型和黄金百香果材料之间没有显著性差异；所用生根培养基配方为：1/2MS+NAA 0.4mg·L^-1+蔗糖20g·L^-1+卡拉胶4.0g·L^-1，pH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。将百香果生根苗置于70％遮阴度的大棚中炼苗7d后，取出并洗净根部培养基，移栽于装有消过毒的移栽基质(腐殖土：泥炭土＝1:2)的营养杯中，在温室大棚培养14天后，成活率90％以上。

实施例4

1)同实施例1中的步骤1)。

2)将所得不继代保存330d的紫果型百香果离体保存材料转接于增殖培养基中进行增殖培养，光照30d，增殖系数3.9/30d；所用增殖培养基配方为：MS+6-BA 2.0mg·L^-1+IAA0.1mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

3)将所得不继代保存330d的黄金百香果离体保存材料转接于增殖培养基中进行增殖培养，光照30d，增殖系数3.7/30d；所用增殖培养基配方为：MS+6-BA 1.0mg·L^-1+IAA0.1mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

4)同实施例2中的步骤4)。

实施例5

1)同实施例1中的步骤1)。

2)将所得不继代保存330d的紫果型百香果离体保存材料转接于增殖培养基中进行增殖培养，光照30d，增殖系数4.0/30d；所用增殖培养基配方为：MS+6-BA 2.0mg·L^-1+IAA0.2mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

3)将所得不继代保存330d的黄金百香果离体保存材料转接于增殖培养基中进行增殖培养，光照30d，增殖系数4.8/30d；所用增殖培养基配方为：MS+6-BA 1.0mg·L^-1+IAA0.2mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

4)同实施例2中的步骤4)。

实施例6

1)同实施例1中的步骤1)。

2)将所得不继代保存330d的紫果型百香果离体保存材料转接于增殖培养基中进行增殖培养，光照30d，增殖系数3.8/30d；所用增殖培养基配方为：MS+6-BA 2.0mg·L^-1+IAA0.3mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

3)将所得不继代保存330d的黄金百香果离体保存材料转接于增殖培养基中进行增殖培养，光照30d，增殖系数4.1/30d；所用增殖培养基配方为：MS+6-BA 1.0mg·L^-1+IAA0.3mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

4)同实施例2中的步骤4)。

实施例7

1)同实施例1中的步骤1)。

2)将所得不继代保存330d的紫果型百香果离体保存材料转接于增殖培养基中进行增殖培养，光照30d，增殖系数3.5/30d；所用增殖培养基配方为：MS+6-BA 2.5mg·L^-1+IAA0.1mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

3)将所得不继代保存330d的黄金百香果离体保存材料转接于增殖培养基中进行增殖培养，光照30d，增殖系数3.9/30d；所用增殖培养基配方为：MS+6-BA 1.5mg·L^-1+IAA0.1mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

4)同实施例2中的步骤4)。

实施例8

1)同实施例1中的步骤1)。

2)将所得不继代保存330d的紫果型百香果离体保存材料转接于增殖培养基中进行增殖培养，光照30d，增殖系数3.5/30d；所用增殖培养基配方为：MS+6-BA 2.5mg·L^-1+IAA0.2mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

3)将所得不继代保存330d的黄金百香果离体保存材料转接于增殖培养基中进行增殖培养，光照30d，增殖系数3.6/30d；所用增殖培养基配方为：MS+6-BA 1.5mg·L^-1+IAA0.2mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

4)同实施例2中的步骤4)。

实施例9

1)同实施例1中的步骤1)。

2)将所得不继代保存330d的紫果型百香果离体保存材料转接于增殖培养基中进行增殖培养，光照30d，增殖系数3.2/30d；所用增殖培养基配方为：MS+6-BA 2.5mg·L^-1+IAA0.3mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

3)将所得不继代保存330d的黄金百香果离体保存材料转接于增殖培养基中进行增殖培养，光照30d，增殖系数3.3/30d；所用增殖培养基配方为：MS+6-BA 1.5mg·L^-1+IAA0.3mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

4)同实施例2中的步骤4)。

实施例10

1)利用实施例5中步骤2)的增殖培养基对紫果型百香果材料进行连续的继代培养，增殖系数能够稳定在4.27/30d(如图4所示)；所用增殖培养基配方为：MS+6-BA 2.0mg·L^-1+IAA 0.2mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

2)利用实施例5中步骤3)的增殖培养基对黄金百香果材料进行连续的继代培养，增殖系数能够稳定在5.0/30d(如图5所示)；所用增殖培养基配方为：MS+6-BA 1.0mg·L^-1+IAA 0.2mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，pH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

实施例11

1)将高度为2～3cm的百香果组培苗转接于离体保存培养基中进行离体保存培养；光照培养330d，离体材料高度9～12cm，植株健壮，成活率40％，紫果型百香果材料和黄金百香果材料在高度和成活率等方面没有显著性差异；所用离体保存培养基配方为MS+PP₃₃₃0.5mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，PH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

实施例12

1)将高度为2～3cm的百香果组培苗转接于离体保存培养基中进行离体保存培养；光照培养330d，离体材料高度9～11cm，叶片深绿，植株健壮，成活率70％，紫果型百香果材料和黄金百香果材料在高度和成活率等方面没有显著性差异；所用离体保存培养基配方为MS+PP₃₃₃1.0 mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，PH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

实施例13

1)将高度为2～3cm的百香果组培苗转接于离体保存培养基中进行离体保存培养；光照培养330d，离体材料高度9～10cm，叶片深绿，植株健壮，成活率62％，紫果型百香果材料和黄金百香果材料在高度和成活率等方面没有显著性差异；所用离体保存培养基配方为MS+PP₃₃₃3.0 mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，PH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

实施例14

1)将高度为2～3cm的百香果组培苗转接于离体保存培养基中进行离体保存培养；光照培养330d，离体材料高度8～9cm，植株节间短缩，长势弱，叶边缘发黄，成活率60％，紫果型百香果材料和黄金百香果材料在高度和成活率等方面没有显著性差异；所用离体保存培养基配方为MS+PP₃₃₃4.0 mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，PH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

对比例1

1)将高度为2～3cm的百香果组培苗转接于离体保存培养基中进行离体保存培养；光照培养200d，叶片全部变黄，植株干枯死亡，成活率为0，紫果型百香果材料和黄金百香果材料在高度和成活率等方面没有显著性差异；所用离体保存培养基配方为MS+PP₃₃₃0.25mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，PH5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

对比例2

1)将高度为2～3cm的百香果组培苗转接于离体保存培养基中进行离体保存培养；光照培养100d，植株短缩，叶片变黄，整株枯萎死亡，成活率为0，紫果型百香果材料和黄金百香果材料在高度和成活率等方面没有显著性差异；所用离体保存培养基配方为MS+PP₃₃₃8.0 mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂3.5g·L^-1，PH 5.8。培养条件为：温度为28±3℃，光照时间为12h/d，光照强度为40μmol·m^-2·s^-1。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种百香果离体保存方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

(1)将高度为2～3cm的百香果组培苗转接于离体保存培养基中进行离体保存培养；离体保存培养基以MS培养基为基础培养基，还包括：PP₃₃₃0.5～4.0mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1和琼脂3.5g·L^-1，培养时间为330d；

(2)将步骤(1)中不继代保存330d的紫果型百香果离体保存材料转接于增殖培养基中进行增殖培养得到增殖苗，所述增殖培养基以MS培养基为基础培养基，增殖培养基还包括：6-BA 1.5～2.5mg·L^-1、IAA 0.1～0.3mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1和琼脂3.5g·L^-1；

将步骤(1)中不继代保存330d的黄金百香果离体保存材料转接于增殖培养基中进行增殖培养得到增殖苗，所述增殖培养基以MS培养基为基础培养基，还包括：6-BA 0.5～1.5mg·L^-1、IAA 0.1～0.3mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1和琼脂3.5g·L^-1；

(3)将所述增殖苗接种于生根培养基上进行生根培养，得百香果生根苗；所述生根培养基以1/2MS为基本培养基，还包括：NAA 0.2～0.4mg·L^-1、蔗糖20.0g·L^-1和卡拉胶4.0g·L^-1。

2.根据权利要求1所述一种百香果离体保存方法，其特征在于，步骤(1)所述离体保存、步骤(2)所述增殖培养、步骤(3)所述的生根培养为光照培养，所述光照培养的温度均为28±3℃，光照时间均为12h/d，光照强度均为40μmol·m^-2·s^-1。

3.根据权利要求1所述一种百香果离体保存方法，其特征在于，在步骤(3)得到百香果生根苗后，还包括炼苗和移栽。

4.根据权利要求3所述的一种百香果离体保存方法，其特征在于，所述炼苗为将百香果组培快繁苗置大棚中炼苗7d，所述大棚的遮阴度为70％。

5.根据权利要求3所述的一种百香果离体保存方法，其特征在于，所述移栽为将炼苗后的生根苗移栽入基质中。

6.根据权利要求5所述的一种百香果离体保存方法，其特征在于，所述基质包括腐殖土和泥炭土。

7.根据权利要求6所述的一种百香果离体保存方法，其特征在于，所述腐殖土和泥炭土的体积比为1：2。

Images