CN103283606A - 一种新型樱桃种内、种间杂种胚的离体培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型樱桃种内、种间杂种胚的离体培养方法，包括：杂种获得、杂种预处理、杂种无菌材料的建立、杂种胚继代增殖培养、杂种胚壮苗培养、杂种胚生根培养、炼苗移栽、移栽田间。本发明利用杂种胚离体培养方法，可有效地筛选具有优良性状的樱桃新品种培育的父本和母本，保证培育出来的子代具有共同父母代的优良性状，培育的杂交品种更具有针对性和广泛性；本发明可以快速低成本的繁殖出大量樱桃的幼苗，生产周期短，因而经济效益可观，具有良好的市场前景。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，尤其涉及一种新型樱桃种内、种间杂种胚的离体培养方法。
背景技术
樱桃属于蔷薇科樱属落叶乔木。按果实结构分类樱桃果实属于核果类。由于樱桃果实发育期短，成熟期早，果实上市正值鲜果市场淡季，果色美艳、营养丰富、鲜食加工均宜，被誉为果中珍品。樱属植物有百余种，在果树生产上主要经济栽培的有中国樱桃、欧洲甜樱桃和欧洲酸樱桃。中国樱桃原产我国，品种类型较多，在我国具有悠久的栽培历史和一定的栽培面积，自花结实，成熟期早，坐果率高，较为丰产，风味浓郁，缺点是果实较小，单果重低，果肉较软，成熟后不耐贮运。欧洲甜樱桃原产欧洲及亚洲西部，经引种到我国后，与中国樱桃相比，大部分品种自花不结实，果实较大，单果重大，果肉较硬，离核，耐贮运较好，但风味偏淡，产量较低。我国分布有丰富的野生樱桃资源。野生樱桃资源往往果实小，产量低，果实偏酸，品质较差，但许多野生樱桃资源的抗病性、抗寒性强。樱桃栽培品种由于长期人为偏重于果实品质性状选育，导致有的栽培品种在抗病性、耐寒性等抗性性状上较弱。由于樱桃物候期早，花期容易遭遇倒春寒影响授粉受精导致坐果率和产量降低。此外，樱桃栽培品种常会因栽培管理不当、冬春长期干旱后偶降暴雨或枝干冻害等易发生流胶病。
远缘杂交是创造植物新种质的重要途径之一。通过远缘杂交，打破种属间的隔离，把两个或多个物种经过自然界长期进化积累起来的有益性状，在试验条件下进行重新组合，使之形成新的类型或新种，这些新类型或新种，可能具有亲本综合的优良性状。所以，将中国樱桃与甜樱桃进行种间杂交，利用中国樱桃优良的品质和甜樱桃个大、肉硬、相对耐贮藏的特性，把两种资源进行遗传改良和种质创新，从后代中选育出自交亲和、果实大、成熟期早、品质优的新品种具有重要意义。同时，将樱桃野生种质与栽培品种进行种内或种间杂交，特别是在仅有个别染色体发生交换，或染色体片断发生属间易位情况下，可将野生植物的抗寒性、抗病性等优良性状转移给栽培品种，又可以避免野生亲本的其它不良性状带给杂种。
杂交的不亲和性及杂种胚的中途败育或退化而导致果树远缘杂交育种进展缓慢；另外，核果类果树的早熟及特早熟品种，种胚容易发育不全，采用常规播种不能成苗或萌芽率很低，阻碍着育种工作的进一步进展。因此，如何克服这两大障碍是核果类果树远缘杂交育种和特早熟、早熟品种选育研究领域的重要问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型樱桃种内、种间杂种胚的离体培养方法，旨在解决樱桃远缘杂交杂种胚的中途败育或退化、早熟品种种胚发育不全导致常规播种不能成苗或萌芽率很低两大障碍，为选育自交亲和、果实大、品质优、熟期早、耐贮运、抗性强的樱桃新品种提供重要保障。
本发明是这样实现的，一种新型樱桃种内、种间杂种胚的离体培养方法，所述离体培养方法包括以下步骤：
杂种获得、杂种预处理、杂种无菌材料的建立、杂种胚继代增殖培养、杂种胚壮苗培养、杂种胚生根培养、炼苗移栽、移栽田间。
进一步，所述杂种获得是在将父本铃铛花期的花朵，带回室内摘下花药，置于20℃的条件下进行干燥爆粉，从花药中裂散出的花粉收集于干净的小瓶中，分别贴上标签后置于干燥的环境中保存备用，并在授粉前进行花粉的活力检测；同时在母本盛花期，选择铃铛花期的母本花朵去雄，进行人工授粉，授粉后立即套上硫酸纸袋，2～3周后去袋，于杂种硬核期和果实成熟时采摘带核果实。
进一步，所述杂种预处理是将采摘的带核果实去除果肉，取果核冲洗干净，晾干后密封置于4℃条件下贮存30d。
进一步，所述杂种无菌材料的建立是将预处理的杂种在室温环境中小心捣破果核，取出种仁，用70%的酒精对种仁浸润1min，再用0.1%的HgCl2表面灭菌10～12min，无菌水冲洗4～5次后用无菌镊子取出已灭菌种仁放于无菌培养皿中的无菌滤纸上，然后再用无菌解剖针或刀片小心去掉种仁上的种皮，最后将去皮种仁接种于初代培养基上先暗培养7d再转入光照条件下培养，培养条件为光照时间12h/d，光照强度2000Lx，温度23～25℃。
进一步，所述杂种胚继代增殖培养，应将杂种胚初代培养萌发的无菌芽苗，剪去子叶和根系转接入到1/2MS+BA0.5mg/L+IBA0.3mg/L+GA31.0mg/L+CH1.0mg/L+Vc10.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L继代增殖培养基中，在光照时间12h/d、光照强度2000Lx、温度23～25℃环境中培养30d可增殖4倍。
进一步，所述杂种胚壮苗培养是将继代培养的杂种胚组培苗接种于不添加任何植物生长调节剂的MS+蔗糖30g/L+琼脂7g/L（pH=5.8）壮苗培养基上，在光照时间12h/d、光照强度2000Lx、温度23～25℃环境中进行壮苗培养30d。
进一步，所述杂种胚生根培养是将经过壮苗培养后，将株高1.0cm以上、生长健壮的芽苗接种于组分为1/2MS+IBA0.3mg/L+蔗糖15g/L+琼脂5g/L的生根培养基中，先弱光培养5d，再转入光照时间12h/d、光照强度2000Lx、温度23～25℃条件下培养30d。
进一步，所述炼苗移栽将生根7条以上、真叶数7片以上、株高1.5cm以上的健壮杂种胚培苗先在无菌培养室内逐步去除瓶膜炼苗3～5d，再转到室温环境下炼苗3～5d。
进一步，所述移栽田间是待杂种胚组培苗移栽蛭石基质50～60d、有新叶长出时，可将其从花盆中移栽到大棚或田间育苗地。
采用本发明技术方案的方法，与现有技术对比的有益效果在于：
（1）本发明利用杂种胚离体培养方法，可有效地筛选具有优良性状的樱桃新品种培育的父本和母本，保证培育出来的子代具有共同父母代的优良性状，培育的杂交品种更具有针对性和广泛性。
（2）本发明过程不同的步骤采用不同的培养基，有利益不同杂交亲本类型的杂种胚苗的成活与生产。
（3）本发明由于采用离体培养技术对樱桃杂种胚进行离体培养，可以快速低成本的繁殖出大量樱桃的幼苗，生产周期短，因而经济效益可观，具有良好的市场前景。
附图说明
图1是本发明提供的新型樱桃种内、种间杂种胚的离体培养方法的流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施实例1
一种新型樱桃种内、种间杂种胚的离体培养方法，如附图1所示，包含以下8个步骤：S101、杂种获得；S102、杂种预处理；S103、杂种无菌材料的建立；S104、杂种胚继代增殖培养；S105、杂种胚壮苗培养；S106、杂种胚生根培养；S107、炼苗移栽；S108、移栽田间。
S101、杂种获得：采摘四川野生中国樱桃北川桂溪居群3号（树较小，花红色）铃铛花期（花瓣已松动但未开放）的花朵为父本，带回室内摘下花药，置于20℃的条件下进行干燥爆粉，从花药中裂散出的花粉收集于干净的小瓶中，分别贴上标签后置于干燥的环境中保存备用，并在授粉前进行花粉的活力检测。在母本盛花期，晴天选择铃铛花期的中国樱桃地方栽培品种‘蒲江红花’樱桃（四川地方栽培品种，属于中国樱桃；花红色；果扁圆形；果皮着色多，鲜红色；果柄易分离；单果重1.30g；果肉淡红；风味甜酸甜度，品质良）母本花朵（保证花药未裂开、散粉而柱头又分泌粘液）去雄，于当天上午9:00进行人工授粉，授粉后立即套上硫酸纸袋，2周后去袋，于杂种硬核期（PF＞0.6)和果实成熟时采摘带核果实。
S102、杂种预处理：果实采收后去除果肉，取果核冲洗干净，晾干密封置于冰箱于4℃条件下贮存30d。
S103、杂种无菌材料的建立：将低温贮藏30d的杂种，室温环境中先用黑桃夹或小钉锤小心捣破果核，取出种仁，用自来水冲洗干净，在超净工作台上先用70%的酒精对种仁浸润1min，再用0.1%的HgCl2表面灭菌12min，无菌水冲洗4次；用无菌镊子取出已表面灭菌的种仁放于无菌培养皿中的无菌滤纸上，再用无菌解剖针或刀片小心去掉种仁上的种皮（一定勿伤胚根），最后将去皮种仁接种于初代培养基上先暗培养7d再转入光照条件下培养，培养条件为光照时间12h/d，光照强度2000Lx，温度25℃。
其中所用初代培养基组分为：1/2MS（1/2MS仅为大量元素减半，下同）+BA2.0mg/L+NAA1.0mg/L+GA30.2mg/L+水解酪蛋白（CH）1.0g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L（pH=5.8）；
S104、杂种胚继代增殖培养：将杂种胚初代培养萌发的无菌芽苗，剪去子叶和根系转接入到1/2MS+BA0.5mg/L+IBA0.3mg/L+GA31.0mg/L+CH1.0mg/L+Vc10.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L（pH=5.8）继代增殖培养基中，在光照时间12h/d、光照强度2000Lx、温度25℃环境中培养30d可增殖4倍。
S105、杂种胚壮苗培养：继代增殖4代后的将用于生根的杂种胚组培苗，接种于不添加任何植物生长调节剂的MS+蔗糖30g/L+琼脂7g/L（pH=5.8）培养基上，在光照时间12h/d、光照强度2000Lx、温度25℃环境中进行壮苗培养30d。
S106、杂种胚生根培养：杂种胚组培苗经过壮苗培养后，将株高1.5cm、生长健壮的芽苗（基部创面切去）接种于1/2MS+IBA0.3mg/L+蔗糖15g/L+琼脂5g/L（pH=5.8）生根培养基中，先弱光培养5d，再转入光照时间12h/d、光照强度2000Lx、温度25℃条件下培养30d。
S107、炼苗移栽：将生根7条以上、真叶数7片以上、株高1.5cm以上的健壮杂种胚培苗先在无菌培养室内逐步去除瓶膜炼苗5d，再转到室温环境下炼苗5d，准备移栽。
基质、花盆在移栽前2d用800倍多菌灵溶液浸泡10h，晾干备用，将生根杂种胚苗从培养瓶中小心取出，在流水下小心洗去根部培养基，避免损伤根系，去除枯黄、萎蔫的叶片，小心将植株移栽到盛装蛭石基质的塑料花盆中，浇透定根水，搭建塑料小拱棚，保持一定的湿度和温度，并注意通风透气。
S108、移栽田间：待杂种胚组培苗移栽蛭石基质60d、有新叶长出时，可将其从花盆中移栽到大棚或田间育苗地。以疏松、透气、具肥力的沙壤土为宜。如为田间育苗地，当气温较高、日照较强时须用遮阳网遮阴。移栽育苗地30d后可喷施叶面追肥。
实施实例2
一种新型樱桃种内、种间杂种胚的离体培养方法，如附图1所示，包含以下8个步骤：S101、杂种获得；S102、杂种预处理；S103、杂种无菌材料的建立；S104、杂种胚继代增殖培养；S105、杂种胚壮苗培养；S106、杂种胚生根培养；S107、炼苗移栽；S108、移栽田间。
S101、杂种获得：采摘四川野生中国樱桃北川桂溪居群2号（树体较大，花红色）铃铛花期的花朵为父本，于室内去花瓣取花药，置于20℃的条件下进行干燥爆粉，从花药中裂散出的花粉收集于干净的小瓶中，分别贴上标签后置于干燥的环境中保存备用，并在授粉前进行花粉的活力检测。同样在母本盛花期，晴天选择铃铛花期中国樱桃地方栽培品种‘蒲江白花’樱桃（四川地方栽培品种，属于中国樱桃；花白色；果长圆形；果皮着色少，红黄相间；果柄较易分离；单果重2.11g；果肉黄色-淡红；风味酸甜适度，品质优）母本花朵（保证花药未裂开、散粉而柱头又分泌粘液）去雄，于当天上午10:00进行人工授粉，授粉后立即套上硫酸纸袋，3周后去袋，于杂种硬核期（PF＞0.6)和果实成熟时采摘带核果实。
S102、杂种预处理：果实采收后去除果肉，取果核冲洗干净，晾干密封置于冰箱于4℃条件下贮存30d。
S103、杂种无菌材料的建立：将低温贮藏30d的杂种，室温环境中先用黑桃夹或小钉锤小心捣破果核，取出种仁，用自来水冲洗干净，在超净工作台上先用70%的酒精对种仁浸润1min，再用0.1%的HgCl2表面灭菌11min，无菌水冲洗4次；用无菌镊子取出已表面灭菌的种仁放于无菌培养皿中的无菌滤纸上，再用无菌解剖针或刀片小心去掉种仁上的种皮（一定勿伤胚根），最后将去皮种仁接种于初代培养基上先暗培养7d再转入光照条件下培养，培养条件为光照时间12h/d，光照强度2000Lx，温度24℃。
其中所用初代培养基组分为：1/2MS+BA2.0mg/L+IBA1.0mg/L+CH1.0g/L+GA30.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L（pH=5.8）；
S104、杂种胚继代增殖培养：将杂种胚初代培养萌发的无菌芽苗，剪去子叶和根系转接入到1/2MS+BA0.5mg/L+IBA0.3mg/L+GA31.0mg/L+CH1.0mg/L+Vc10.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L（pH=5.8）继代增殖培养基中，在光照时间12h/d、光照强度2000Lx、温度24℃环境中培养30d可增殖4倍。
S105、杂种胚壮苗培养：继代增殖3代后的将用于生根的杂种胚组培苗，接种于不添加任何植物生长调节剂的MS+蔗糖30g/L+琼脂7g/L（pH=5.8）培养基上，在光照时间12h/d、光照强度2000Lx、温度24℃环境中进行壮苗培养30d。
S106、杂种胚生根培养：杂种胚组培苗经过壮苗培养后，将株高1.5cm、生长健壮的芽苗（基部创面切去）接种于1/2MS+IBA0.3mg/L+蔗糖15g/L+琼脂5g/L（pH=5.8）生根培养基中，先弱光培养5d，再转入光照时间12h/d、光照强度2000Lx、温度24℃条件下培养30d。
S107、炼苗移栽：将生根7条以上、真叶数7片以上、株高1.5cm以上的健壮杂种胚培苗先在无菌培养室内逐步去除瓶膜炼苗3d，再转到室温环境下炼苗5d，准备移栽。
基质、花盆在移栽前2d用800倍多菌灵溶液浸泡10h，晾干备用，将生根杂种胚苗从培养瓶中小心取出，在流水下小心洗去根部培养基，避免损伤根系，去除枯黄、萎蔫的叶片，小心将植株移栽到盛装蛭石基质的塑料花盆中，浇透定根水，搭建塑料小拱棚，保持一定的湿度和温度，并注意通风透气。
S108、移栽田间待杂种胚组培苗移栽蛭石基质60d、有新叶长出时，可将其从花盆中移栽到大棚或田间育苗地。以疏松、透气、具肥力的沙壤土为宜。如为田间育苗地，当气温较高、日照较强时须用遮阳网遮阴。移栽育苗地20d后可喷施叶面追肥。
实施实例3
一种新型樱桃种内、种间杂种胚的离体培养方法，如附图1所示，包含以下8个步骤：S101、杂种获得；S102、杂种预处理；S103、杂种无菌材料的建立；S104、杂种胚继代增殖培养；S105、杂种胚壮苗培养；S106、杂种胚生根培养；S107、炼苗移栽；S108、移栽田间。
S101、杂种获得：采摘四川野生中国樱桃北川桂溪居群5号（树较小，花红色）铃铛花期的花朵为父本，于室内去花瓣取花药，置于20℃的条件下进行干燥爆粉，从花药中裂散出的花粉收集于干净的小瓶中，分别贴上标签后置于干燥的环境中保存备用，并在授粉前进行花粉的活力检测。同样，在母本盛花期，晴天选择铃铛花期欧洲甜樱桃栽培品种‘红灯’（果肾脏形；果皮红色至紫红色，富有光泽；果梗粗短。单果重9.2g。果肉淡黄；肉质半软、汁多，肉质肥厚，酸甜适口。大，离核）母本花朵（保证花药未裂开、散粉而柱头又分泌粘液）去雄，于当天上午12:00进行人工授粉，授粉后立即套上硫酸纸袋，3周后去袋，于杂种硬核期（PF＞0.6)和果实成熟时采摘带核果实。
S102、杂种预处理：果实采收后去除果肉，取果核冲洗干净，晾干密封置于冰箱于4℃条件下贮存30d。
S103、杂种无菌材料的建立：将低温贮藏30d的杂种，室温环境中先用黑桃夹或小钉锤小心捣破果核，取出种仁，用自来水冲洗干净，在超净工作台上先用70%的酒精对种仁浸润1min，再用0.1%的HgCl2表面灭菌10min，无菌水冲洗4次；用无菌镊子取出已表面灭菌的种仁放于无菌培养皿中的无菌滤纸上，再用无菌解剖针或刀片小心去掉种仁上的种皮（一定勿伤胚根），最后将去皮种仁接种于初代培养基上先暗培养7d再转入光照条件下培养，培养条件为光照时间12h/d，光照强度2000Lx，温度23℃。
其中所用初代培养基组分为：1/2MS+BA2.0mg/L+IBA1.0mg/L+GA30.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L（pH=5.8）；
S104、杂种胚继代增殖培养：将杂种胚初代培养萌发的无菌芽苗，剪去子叶和根系转接入到1/2MS+BA0.5mg/L+IBA0.3mg/L+GA31.0mg/L+CH1.0mg/L+Vc10.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L（pH=5.8）继代增殖培养基中，在光照时间12h/d、光照强度2000Lx、温度23℃环境中培养30d可增殖4倍。
S105、杂种胚壮苗培养：继代增殖3代后的将用于生根的杂种胚组培苗，接种于不添加任何植物生长调节剂的MS+蔗糖30g/L+琼脂7g/L（pH=5.8）培养基上，在光照时间12h/d、光照强度2000Lx、温度24℃环境中进行壮苗培养30d。
S106、杂种胚生根培养：杂种胚组培苗经过壮苗培养后，将株高1.5cm、生长健壮的芽苗（基部创面切去）接种于1/2MS+IBA0.3mg/L+蔗糖15g/L+琼脂5g/L（pH=5.8）生根培养基中，先弱光培养5d，再转入光照时间12h/d、光照强度2000Lx、温度23℃条件下培养30d。
S107、炼苗移栽：将生根7条以上、真叶数7片以上、株高1.5cm以上的健壮杂种胚培苗先在无菌培养室内逐步去除瓶膜炼苗3d，再转到室温环境下炼苗5d，准备移栽。
基质、花盆在移栽前2d用800倍多菌灵溶液浸泡10h，晾干备用，将生根杂种胚苗从培养瓶中小心取出，在流水下小心洗去根部培养基，避免损伤根系，去除枯黄、萎蔫的叶片，小心将植株移栽到盛装蛭石基质的塑料花盆中，浇透定根水，搭建塑料小拱棚，保持一定的湿度和温度，并注意通风透气。
S108、移栽田间：待杂种胚组培苗移栽蛭石基质50d、有新叶长出时，可将其从花盆中移栽到大棚或田间育苗地。以疏松、透气、具肥力的沙壤土为宜。如为田间育苗地，当气温较高、日照较强时须用遮阳网遮阴。移栽育苗地25d后可喷施叶面追肥。
实施实例4
一种新型樱桃种内、种间杂种胚的离体培养方法，如附图1所示，包含以下8个步骤：S101、杂种获得；S102、杂种预处理；S103、杂种无菌材料的建立；S104、杂种胚继代增殖培养；S105、杂种胚壮苗培养；S106、杂种胚生根培养；S107、炼苗移栽；S108、移栽田间。
S101、杂种获得：采摘四川野生中国樱桃北川桂溪居群2号（树体较大，花红色）铃铛花期的花朵为父本，于室内去花瓣取花药，置于20℃的条件下进行干燥爆粉，从花药中裂散出的花粉收集于干净的小瓶中，分别贴上标签后置于干燥的环境中保存备用，并在授粉前进行花粉的活力检测。同样，在母本盛花期，晴天选择铃铛花期四川野生中国樱桃北川桃龙居群1号（树体高大，花白色，花量大）母本花朵（保证花药未裂开、散粉而柱头又分泌粘液）去雄，于当天上午10:00进行人工授粉，授粉后立即套上硫酸纸袋，3周后去袋，于杂种硬核期（PF＞0.6)和果实成熟时采摘带核果实。
S102、杂种预处理：果实采收后去除果肉，取果核冲洗干净，晾干密封置于冰箱于4℃条件下贮存30d。
S103、杂种无菌材料的建立：将低温贮藏30d的杂种，室温环境中先用黑桃夹或小钉锤小心捣破果核，取出种仁，用自来水冲洗干净，在超净工作台上先用70%的酒精对种仁浸润1min，再用0.1%的HgCl2表面灭菌11min，无菌水冲洗4次；用无菌镊子取出已表面灭菌的种仁放于无菌培养皿中的无菌滤纸上，再用无菌解剖针或刀片小心去掉种仁上的种皮（一定勿伤胚根），最后将去皮种仁接种于初代培养基上先暗培养7d再转入光照条件下培养，培养条件为光照时间12h/d，光照强度2000Lx，温度23℃（图7）。
其中所用初代培养基组分为：1/2MS+BA2.0mg/L+IBA1.0mg/L+GA30.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L（pH=5.8）；
S104、杂种胚继代增殖培养：将杂种胚初代培养萌发的无菌芽苗，剪去子叶和根系转接入到1/2MS+BA0.5mg/L+IBA0.3mg/L+GA31.0mg/L+CH1.0mg/L+Vc10.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L（pH=5.8）继代增殖培养基中，在光照时间12h/d、光照强度2000Lx、温度23℃环境中培养30d可增殖4倍。
S105、杂种胚壮苗培养：继代增殖3代后的将用于生根的杂种胚组培苗，接种于不添加任何植物生长调节剂的MS+蔗糖30g/L+琼脂7g/L（pH=5.8）培养基上，在光照时间12h/d、光照强度2000Lx、温度23℃环境中进行壮苗培养30d。
S106、杂种胚生根培养：杂种胚组培苗经过壮苗培养后，将株高1.5cm、生长健壮的芽苗（基部创面切去）接种于1/2MS+IBA0.3mg/L+蔗糖15g/L+琼脂5g/L（pH=5.8）生根培养基中，先弱光培养5d，再转入光照时间12h/d、光照强度2000Lx、温度24℃条件下培养30d。
S107、炼苗移栽：将生根7条以上、真叶数7片以上、株高1.5cm以上的健壮杂种胚培苗先在无菌培养室内逐步去除瓶膜炼苗3d，再转到室温环境下炼苗5d，准备移栽。
基质、花盆在移栽前2d用800倍多菌灵溶液浸泡10h，晾干备用，将生根杂种胚苗从培养瓶中小心取出，在流水下小心洗去根部培养基，避免损伤根系，去除枯黄、萎蔫的叶片，小心将植株移栽到盛装蛭石基质的塑料花盆中，浇透定根水，搭建塑料小拱棚，保持一定的湿度和温度，并注意通风透气。
S108、移栽田间：待杂种胚组培苗移栽蛭石基质60d、有新叶长出时，可将其从花盆中移栽到大棚或田间育苗地。以疏松、透气、具肥力的沙壤土为宜。如为田间育苗地，当气温较高、日照较强时须用遮阳网遮阴。移栽育苗地20d后可喷施叶面追肥。
Claims (9)
1.一种新型樱桃种内、种间杂种胚的离体培养方法，其特征在于，所述离体培养方法包括以下步骤：
杂种获得、杂种预处理、杂种无菌材料的建立、杂种胚继代增殖培养、杂种胚壮苗培养、杂种胚生根培养、炼苗移栽、移栽田间。
2.如权利要求1所述新型樱桃种内、种间杂种胚的离体培养方法，其特征在于，所述杂种获得是将父本铃铛花期的花朵，带回室内摘下花药，置于20℃的条件下进行干燥爆粉，从花药中裂散出的花粉收集于干净的小瓶中，分别贴上标签后置于干燥的环境中保存备用，并在授粉前进行花粉的活力检测；同样在母本盛花期，选择铃铛花期的母本花朵去雄，进行人工授粉，授粉后立即套上硫酸纸袋，2～3周后去袋，于杂种硬核期和果实成熟时采摘带核果实。
3.如权利要求1所述新型樱桃种内、种间杂种胚的离体培养方法，其特征在于，所述杂种预处理是将采摘的带核果实去除果肉，取果核冲洗干净，晾干后密封置于4℃条件下贮存30d。
4.如权利要求1所述新型樱桃种内、种间杂种胚的离体培养方法，其特征在于，所述杂种无菌材料的建立是将预处理的杂种在室温环境中小心捣破果核，取出种仁，用70%的酒精对种仁浸润1min，再用0.1%的HgCl2表面灭菌10～12min，无菌水冲洗4～5次，然后用无菌镊子取出已灭菌种仁放于无菌培养皿中的无菌滤纸上，再用无菌解剖针或刀片小心去掉种仁上的种皮，最后将去皮种仁接种于初代培养基上先暗培养7d再转入光照条件下培养，培养条件为光照时间12h/d，光照强度2000Lx，温度23～25℃。
5.如权利要求1所述新型樱桃种内、种间杂种胚的离体培养方法，其特征在于，所述杂种胚继代增殖培养，应将杂种胚初代培养萌发的无菌芽苗，剪去子叶和根系转接入到1/2MS+BA0.5mg/L+IBA0.3mg/L+GA31.0mg/L+CH1.0mg/L+Vc10.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L继代增殖培养基中，在光照时间12h/d、光照强度2000Lx、温度23～25℃环境中培养30d可增殖4倍。
6.如权利要求1所述新型樱桃种内、种间杂种胚的离体培养方法，其特征在于，所述杂种胚壮苗培养是将继代培养的杂种胚组培苗接种于不添加任何植物生长调节剂的组分为MS+蔗糖30g/L+琼脂7g/L壮苗培养基上，在光照时间12h/d、光照强度2000Lx、温度23～25℃环境中进行壮苗培养30d。
7.如权利要求1所述新型樱桃种内、种间杂种胚的离体培养方法，其特征在于，所述杂种胚生根培养是将经过壮苗培养后，将株高1.0cm以上、生长健壮的芽苗接种于组分为1/2MS+IBA0.3mg/L+蔗糖15g/L+琼脂5g/L的生根培养基中，先弱光培养5d，再转入光照时间12h/d、光照强度2000Lx、温度23～25℃条件下培养30d。
8.如权利要求1所述新型樱桃种内、种间杂种胚的离体培养方法，其特征在于，所述炼苗移栽将生根7条以上、真叶数7片以上、株高1.5cm以上的健壮杂种胚培苗先在无菌培养室内逐步去除瓶膜炼苗3～5d，再转到室温环境下炼苗3～5d。
9.如权利要求1所述新型樱桃种内、种间杂种胚的离体培养方法，其特征在于，所述移栽田间是待杂种胚组培苗移栽蛭石基质50～60d、有新叶长出时，可将其从花盆中移栽到大棚或田间育苗地。
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