CN105284620B

CN105284620B - 一种特早熟桃杂交胚挽救成苗的方法

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Publication number: CN105284620B
Application number: CN201510759469.8A
Authority: CN
Inventors: 杜纪红; 叶正文; 苏明申; 周慧娟; 李雄伟
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-11-09
Filing date: 2015-11-09
Publication date: 2017-10-13
Anticipated expiration: 2035-11-09
Also published as: CN105284620A

Abstract

一种特早熟桃杂交胚挽救成苗的方法，摘取特早熟桃七到八分熟的果实，果实消毒后破核取出胚珠并接种在生长培养基中进行胚珠培养，再将幼胚接种至分化培养基中进行幼胚分化培养，将打破休眠的胚进行胚萌发培养，再进行移栽。本发明进行特早熟桃杂交胚挽救时机适宜，在胚珠培养与胚萌发过程中开发出了合适的培养基，提高了杂交胚的发育率，提高了正常胚的比例，胚挽救苗整齐健壮，胚生长力可以达到83％以上，分化力达到60％，培养力达到50％，大大提高了特早熟桃杂交后代胚挽救成苗的基数，从而能得到更多的特早熟桃杂交后代植株群体，提高了特早熟桃杂交胚挽救成苗率，方法可操作性强、容易掌握。

Description

一种特早熟桃杂交胚挽救成苗的方法

技术领域

本发明涉及植物育种技术领域，具体涉及一种特早熟桃杂交胚挽救成苗的方法。

背景技术

果实成熟期在育种上是一项重要的经济性状。我国南方地区6月份进入梅雨季节，这个时期成熟的桃子受天气影响，大多品质不好，并且雨季影响市民对桃的购买能力，使得早熟桃在上海地区的发展受到制约，但是上海地区5月底到6月上旬天气晴朗，雨水少，如果能把早熟桃成熟期提前到这个时间，将会丰富我国桃品种资源、增加桃果品市场供应，促进南方地区桃产业的发展。

桃成熟早、品质好，栽培管理省工，亩产值收入高，因而创造特早熟类型更有重要意义，也是近代各国果树育种学家向往和追求的目标之一。但当人们旨在创造特早熟新品种时，却常常会遇到杂种种胚不育的问题，阻碍着育种工作的进展。

激素含量的异常会导致种子败育。陈伟2000年研究荔枝败育品种开始出现败育时IAA、GA₁₊₃、CTK含量急剧下降，可能是生长促进物质含量的不足影响胚的细胞分裂与生物大分子的合成，造成生理代谢的紊乱及物质和能量亏损，使胚不能正常发育，最终导致败育。黄碧光等(1997)年在蕉柑幼果发育过程中也发现了这种现象。

胚培养在桃遗传育种中的应用最早开始于1933年，Tukey首先进行了果实生长快慢与桃胚大小关系的研究，并开展了桃胚的培养。20世纪40年代起胚培养技术开始广泛应用于果树育种。近些年来，通过桃胚培养技术已经选育出了许多优良品种，特别是早熟品种。如春蕾、春花、早花露、早霞露、玫瑰露、Mayfire、Golderest、华光、艳光等。

但是，在胚挽救过程中，品种基因型、取样接种时间、培养基种类与相态、植物生长调节剂、碳源、培养环境、移栽方式等都会对胚挽救的萌发率和成苗率产生影响，且各因子相互作用，特早熟桃由于种胚很小，并且发育过程中出现败育现象，其胚培过程需要先让胚长大然后再萌发成苗，操作复杂，成苗率低，严重限制了特早熟桃的育种效率。

因此，很有必要深入开展特早熟桃的胚挽救技术研究，以提高特早熟桃胚挽救育种的成苗率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特早熟桃杂交胚挽救成苗的方法，有效地促进特早熟桃杂交胚发育，在离体组织培养条件下能发育成苗，且萌发后的试管苗健壮整齐，提高特早熟桃中胚挽救育种效率。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种特早熟桃杂交胚挽救成苗的方法，包括以下步骤：

1)取样接种

在特早熟桃品种杂交授粉后，摘取七到八分熟果实，对果实消毒，破核取出胚珠，将胚珠接种在生长培养基中；所述的生长培养基中包含SH培养基、植物生长调节剂、蔗糖和活性炭；

2)胚珠培养

将步骤1)中接种至生长培养基中的胚珠进行暗培养，暗培养的温度为20～28℃，培养20～40天，得到膨大的胚珠；

3)幼胚分化培养

将步骤2)中膨大的胚珠剥去种皮，得到幼胚，将长度大于1mm的幼胚转接到分化培养基中，于2～7℃低温暗培养70～90天，得到打破休眠的胚；

4)胚萌发培养

将打破休眠的胚进行光照培养，培养温度18～23℃，培养7～15天后得到试管苗；

5)移苗

将具有3～6片真叶、5条以上须根的试管苗移栽到基质中，移到温室中进行常规管理，得到幼苗，在终霜期后将幼苗移栽到大田中。

进一步，步骤1)中对果实消毒的方法为：先用体积分数为70～85％酒精浸没果实，消毒10～20min，然后用20～30％次氯酸钠浸没果实，消毒10～20min。

优选地，步骤1)中所述的生长培养基中的植物生长调节剂为吲哚乙酸和赤霉素。

又进一步，步骤1)中所述的生长培养基包含SH培养基、吲哚乙酸1～2.5mg/L、赤霉素0.5～1.5mg/L、蔗糖55～65g/L和活性炭0.5～2.5g/L。

优选地，步骤2)胚珠培养中暗培养温度为22～26℃，培养25～35天。

进一步，步骤3)中的低温暗培养温度为4～5℃，所述分化培养基为木本培养基。

进一步，步骤5)中移栽入基质的试管苗具有5～6片真叶，5条以上须根，基质为进口草炭：珍珠岩＝1：1～3，体积比，将试管苗移栽到基质中后罩住保湿，3天后打开透气。

本发明的SH(Stewart and Hsu)培养基的pH为5.8，成分见表1：

表1

主要成份	mg/L
		七水硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)	493
二水氯化钙(CaCl₂·2H₂O)	441.06
		硝酸钾(KNO₃)	5055.0
磷酸二氢钾(KH₂PO₄)	272.18
		七水硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)	8.34
碘化钾(KI)	0.83
		六水氯化钴(CoCl₂·6H₂O)	0.024
七水硫酸锌(Zn SO₄·7H₂O)	8.6
		五水硫酸铜(Cu SO₄·5H₂O)	0.025
硼酸(H₃BO₃)	6.183
		二水钼酸纳(Na₂MoO₄.2H₂O)	0.242
四水硫酸锰(Mn SO₄·4H₂O)	16.9
		乙二胺四乙酸二钠(Na₂-EDTA)	11.167
氯化铵(NH₄Cl)	535.0
		盐酸硫胺(Thiamine-HCl)	1.349
盐酸吡哆素(Pyroxidine-HCl)	0.822
		烟酸(Nicotinic Acid)	0.492

本发明的木本培养基(Woody Plant medium，简称WPM培养基)的pH为5.8，其成分见表2：

表2

主要成份	mg/L
		硝酸铵(NH₄NO₃)	400
四水硝酸钙(Ca(NO₃)₂.4H₂O)	556
		硫酸钾(K₂SO₄)	990
二水氯化钙(CaCl₂·2H₂O)	96
		磷酸二氢钾(KH₂PO₄)	170
二水钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)	0.25
		七水硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)	370
一水硫酸锰(MnSO₄·H₂O)	22.4
		七水硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)	8.6
五水硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)	0.25
		硼酸(H₃BO₃)	6.2
七水硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)	27.8
		乙二胺四乙酸二钠(Na₂-EDTA)	37.3
肌醇(myo-Inositol)	100
		维生素B1(Thiamine HCl)	1.0
烟酸(Nicotinic acid)	0.5
		维生素B6(Pyridoxine HCl)	0.5
甘氨酸(Glycine)	2.0
		蔗糖	20000～30000
琼脂	5000～7000

本发明在特早熟桃品种杂交授粉后，采取七到八分熟的果实，采取时间适宜，若采样太早，则胚的生长力低，采样太晚时果实变软，不容易取核也容易发生污染。在接种时要严禁使用腐烂的果实，在移栽后的管理中立枯病与褐腐病是危害成活的主要病害，要早起发现与防治。

植物激素是代谢反应的产物，同时又在基因，蛋白质(酶)和细胞膜等各种水平上调节植物的生命活动。研究表明，胚的大小和形态受胚乳调控基因的影响，即胚乳特异基因通过调控胚乳发育影响胚的发育。Kinoshita等(1999)的研究也发现，胚乳中Mea基因的突变会导致胚乳败育，进而导致胚中途败育。对体细胞胚进行研究发现，激素通过调节控制胚胎发育相关基因的开启和关闭而影响胚胎的发育。

研究表明，胚乳败育在先，胚随后发生败育，胚的发育是依赖胚乳提供养料，因此，胚乳的退化会导致胚的中途败育。胚和胚乳的生理活性物质代谢失调，使胚乳不能从珠心得到营养，胚乳不能正常发育，同时，胚不能释放出分解酶溶解胚乳，使胚无法从胚乳中吸收养分，或根本就没有胚乳可供营养吸收，使胚在饥饿中夭亡。

合子胚的发育是在胚珠中进行的，胚珠中的生长促进物质促进了胚胎的细胞分裂和生长、核酸和蛋白质的合成以及光合产物的输入和积累，这对胚胎的正常发育无疑是至关重要，胚珠中生长促进物质亏损可能影响胚胎的细胞分裂和分化，生物大分子的合成和营养物质的输入，从而阻碍了胚胎的正常发育，导致胚败育的发生，因此，胚珠中生长抑制物质和生长促进物质的平衡失调是导致胚败育的重要原因。

吲哚乙酸(IAA)与赤霉素(GA3)为生长促进物质，脱落酸(ABA)为生长抑制物质，易败育和不易败育品种的(IAA+GA3)/ABA比值存在显著差异，在胚珠败育的关键期，易败育品种的IAA和GA3含量比不败育品种的含量低，(IAA+GA3)/ABA比值低，在胚胎发育期，IAA与GA3含量亏缺将会导致胚胎发育停止。

本发明特早熟桃的胚珠培养过程中，添加了外源性生长促进物质—吲哚乙酸与赤霉素，促进了胚珠对营养物质的吸收，维持了胚性生长，促进了幼胚的生长。本发明添加的吲哚乙酸和赤霉素都能使细胞伸长生长，吲哚乙酸可以直接影响细胞的伸长、分裂和分化，赤霉素可以促进吲哚乙酸的合成，通过促使合成生长素来实现促使细胞生长的目的，避免胚败育的发生。

同时，本发明的生长培养基中添加了蔗糖，幼胚的生长需要较高浓度的蔗糖，提供能量的同时，提高了渗透压，在这种较高的渗透压下胚珠才能够长大，另外，本发明添加的活性炭有利于吸收胚生长过程中的有害物质。

本发明采用了较低的胚萌发的培养温度18～23℃，与自然生长条件下桃种子萌发的环境温度相接近，在较低的培养温度条件下，获得的幼苗的株高得到提升，萌发率比常规的培养温度为28～30℃的条件下提高13～22％，在温室移栽后存活率提高了16％，并且，培养温度较高时萌发的幼苗会出现顶部坏死的现象，而本发明的培养条件下避免了幼苗出现顶部坏死的现象。

本发明在胚珠培养过程中，使用的分化培养基能够使胚的生长力(即胚珠在生长培养基上培养后长度大于1毫米的幼胚数目×100％/接种胚珠数)达到83.3％，而常规培养则为55％；长大的胚中正常胚率(即正常胚/所有长度大于1mm的胚数)提高，所述的正常胚为在生长培养基培养结束后具有两瓣规则子叶的胚，本发明长大的胚中有88％的正常胚，而常规培养仅有12％的正常胚；分化力(即胚在分化培养基上的成苗数×100％/大于1毫米的幼胚)提高，所有长大的胚中经过分化培养后有60％能够发育成正常的幼苗，而常规培养为6％；大大提高了成苗率，使本发明培养力(胚成苗数×100％/接种胚珠)达到50％，而常规方法为4％。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)本发明所采用的方法中，添加了适量的植物生长调节剂，特别是吲哚乙酸与赤霉素，弥补了胚败育过程中缺乏的激素，促进胚珠吸收营养，使胚的细胞能够正常分裂与生长，从而能有效促进特早熟桃杂交胚在离体条件下继续发育，提高胚珠与胚发育率，促进胚萌发，增加了杂交后代成苗的基数，从而能得到更多的杂交后代。

2)利用本发明所获得的特早熟桃杂交胚发育率高，正常胚比例高，胚挽救苗整齐健壮，胚生长力达到了83％，分化力达到60％，培养力达到50％，大大提高了特早熟桃杂交后代胚挽救成苗的基数，从而能得到更多的特早熟桃杂交后代植株群体，提高了特早熟桃杂交胚挽救成苗率，方法可操作性强、容易掌握。

附图说明

图1本发明实施例采样时的七到八分熟的果实。

图2本发明实施例的胚珠长大后形成的正常胚。

图3发明实施例将打破休眠的幼胚移出冷库进行培养后萌发的试管苗。

图4发明实施例移栽到基质中的幼苗。

图5发明实施例移栽后成活并生长2个月的幼苗。

图6对比例的胚珠长大后形成的畸形胚。

图7对比例的胚萌发后得到的试管苗。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例一种提高特早熟桃胚挽救成苗的方法，包括以下步骤：

取样接种及胚珠培养：在盛花期将中油9号(母本)与沪油018(父本)进行人工去雄授粉杂交，授粉后，在果实成熟前3～4天(七到八分熟，参见图1)，果实的消毒方法为先用70～85％酒精浸没果实，消毒10～20min，然后用次氯酸钠水溶液(市售有效氯含量为5.2％的次氯酸钠水溶液与水配制，其中，有效氯含量为5.2％的次氯酸钠水溶液的体积分数为20～30％)浸没果实，消毒10～20min。将在超净工作台用灭菌的剪刀对果实破核取种，把种子接种到生长培养基中，在25℃暗培养80～90天；

其中，生长培养基包含：SH培养基、1.5mg/L的IAA、0.5mg/L的GA3、蔗糖55g/L和1.5g/L的活性炭。

幼胚分化培养：将SH培养基内的胚珠，剥去种皮，接种到分化培养基中(参见图2)，4℃低温暗培养70～90天；分化培养基为WPM培养基。

胚萌发培养：将经过低温打破休眠的胚，放在18～23℃光照培养得到试管苗，参见图3。

成苗的标准：经过萌发培养后上部正常发育且须根数大于5条的可以移栽的苗，移栽前的试管苗，上部真叶正常，胚轴正常伸长。

移苗：所用移栽基质为进口草炭：珍珠岩1：3，基质进行高温高压灭菌，当幼苗真叶达到3～6片，根数达到5条以上并且健壮的试管苗移苗到移栽基质中(参见图4)，于18～26℃进行光照培养(参见图5)，注意保湿，在终霜期结束后将幼苗移栽到室外露天进行栽培培养。移栽至基质中后注意地上部要注意保湿，根部不要积水，后期要注意预防立枯病、根腐病与白粉病。

本发明实施例中，步骤5)移栽至基质中时白天温度不超过30℃，夜间不低于15℃，平均温度在25℃以下，保持8℃以上的昼夜温差，能显著提高成活率。

进一步，移栽基质中前将基质用500倍多菌灵进行喷洒消毒，移栽后用一次性塑料杯罩住幼苗保湿，3天后慢慢揭开盖子，逐渐透气，一周后除去盖子，栽后浇水不宜过多，否则会出现烂根现象。幼苗生长期每隔两周浇一次营养液，当根系充满营养钵时换盆。

对比例

除在生长培养基中不添加植物生长调节剂，其它培养条件采用与本发明实施例中相同的方法。

参见图6，可见，对比例中培养方法的胚珠长大后形成的畸形胚多，栽培出试管苗后有顶部枯死和胚轴不能伸长等现象，参见图7，其中左边的试管苗没有根，中间的试管苗顶端枯死，右边的试管苗的上胚轴比较短。

对比本发明实施例和对比例在培养过程中获得的培养数据，见表3：

表3

	本发明实施例	对比例
			胚珠接种数	30	29
长度大于1mm的胚数	25	16
			畸形胚数	3	14
正常胚数	22	2
			正常苗数	15	1

由获得的培养数据计算的正常胚率、胚生长力、分化力以及培养力见表4。

表4

	本发明实施例	对比例
			正常胚率	88％	12％
胚生长力	83％	55％
			分化力	60％	6％
培养力	50％	3％

从表3和表4可以看出，本发明实施例杂交胚的发育率高，正常胚的比例高，胚挽救苗整齐健壮，胚生长力可以达到83％以上，分化力达到60％，培养力达到50％，各指标均大大优于对比例。

利用本发明进行特早熟桃杂交胚挽救，大大提高了特早熟桃杂交后代胚挽救成苗的基数，能得到更多的特早熟桃杂交后代植株群体，提高了特早熟桃杂交胚挽救成苗率，方法可操作性强、容易掌握。

Claims

1.一种特早熟桃杂交胚挽救成苗的方法，包括以下步骤：

1)取样接种

在特早熟桃品种杂交授粉后，摘取七到八分熟果实，对果实消毒，破核取出胚珠，将胚珠接种在生长培养基中；所述的生长培养基中包含SH培养基、植物生长调节剂、蔗糖和活性炭，具体地，所述生长培养基为SH培养基、吲哚乙酸1～2.5mg/L、赤霉素0.5～1.5mg/L、蔗糖55～65g/L和活性炭0.5～2.5g/L；

其中，SH培养基的pH为5.8，成分如下：

成份 mg/L 七水硫酸镁(MgSO₄·7H₂O) 493 二水氯化钙(CaCl₂·2H₂O) 441.06 硝酸钾(KNO₃) 5055.0 磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 272.18 七水硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O) 8.34 碘化钾(KI) 0.83 六水氯化钴(CoCl₂·6H₂O) 0.024 七水硫酸锌(Zn SO₄·7H₂O) 8.6 五水硫酸铜(Cu SO₄·5H₂O) 0.025 硼酸(H₃BO₃) 6.183 二水钼酸纳(Na₂MoO₄.2H₂O) 0.242 四水硫酸锰(Mn SO₄·4H₂O) 16.9 乙二胺四乙酸二钠(Na₂-EDTA) 11.167 氯化铵(NH₄Cl) 535.0 盐酸硫胺(Thiamine-HCl) 1.349 盐酸吡哆素(Pyroxidine-HCl) 0.822 烟酸(Nicotinic Acid) 0.492

2)胚珠培养

3)幼胚分化培养

将步骤2)得到的膨大的胚珠剥去种皮，得到幼胚，再将长度大于1mm的幼胚转接到分化培养基中，于2～7℃低温暗培养70～90天，得到打破休眠的胚；

所述分化培养基为木本培养基；

其中，木本培养基的pH为5.8，成分如下：

成份 mg/L 硝酸铵(NH₄NO₃) 400 四水硝酸钙(Ca(NO₃)₂.4H₂O) 556 硫酸钾(K₂SO₄) 990 二水氯化钙(CaCl₂·2H₂O) 96 磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 170 二水钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.25 七水硫酸镁(MgSO₄·7H₂O) 370 一水硫酸锰(MnSO₄·H₂O) 22.4 七水硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 8.6 五水硫酸铜(CuSO₄·5H₂O) 0.25 硼酸(H₃BO₃) 6.2 七水硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O) 27.8 乙二胺四乙酸二钠(Na₂-EDTA) 37.3 肌醇(myo-Inositol) 100 维生素B1(Thiamine HCl) 1.0 烟酸(Nicotinic acid) 0.5 维生素B6(Pyridoxine HCl) 0.5 甘氨酸(Glycine) 2.0 蔗糖 20000～30000 琼脂 5000～7000

4)胚萌发培养

5)移苗

将具有3～6片真叶、5条以上须根的试管苗移栽到基质中，在温室中进行常规管理，得到幼苗，在终霜期后将幼苗移栽到大田中；

所述基质为进口草炭：珍珠岩＝1：1～3，体积比。

2.根据权利要求1所述的特早熟桃杂交胚挽救成苗方法，其特征在于，步骤1)中对果实消毒的方法为：先用70～85％酒精浸没果实，消毒10～20min，然后用次氯酸钠水溶液浸没果实，消毒10～20min。

3.根据权利要求1所述的特早熟桃杂交胚挽救成苗方法，其特征在于，步骤2)胚珠培养中，暗培养的温度为22～26℃，培养25～35天。

4.根据权利要求1所述的特早熟桃杂交胚挽救成苗方法，其特征在于，所述步骤3)幼胚分化培养时低温暗培养的温度为4～5℃。

5.根据权利要求1所述的特早熟桃杂交胚挽救成苗方法，其特征在于，步骤5)中，移栽的试管苗具有5～6片真叶、5条以上须根。

6.根据权利要求1所述的特早熟桃杂交胚挽救成苗方法，其特征在于，步骤5)中，将试管苗移栽到基质中后罩住保湿，3天后打开透气。