CN112273234B - 一种桃胚挽救过程中畸形苗转化成正常植株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种桃胚挽救过程中畸形苗转化成正常植株的方法,涉及植物繁育技术领域。本发明所述方法对早熟桃胚挽救过程中出现的畸形苗按照其外观形态进行分类研究,对于胚根和胚芽均不正常的A类畸形苗,切取子叶段接种到诱导培养基中,可以有50%左右的胚能发出正常的新稍,在新稍5~10cm时可以切成多个茎段转接到生根培养基中进行扩繁和保存;对于无胚根,胚芽正常伸长的B类畸形苗,去掉胚根,可以接种子叶段、带叶茎段、顶端到生根培养基中,接种后根生长迅速,根系粗壮,上部新稍生长快,叶片肥厚,叶色浓绿,根据需要可以再转接扩繁,也可以用于保种。本发明所述方法转化率达到50%以上,有效的提高了胚挽救育种效率。
Description
技术领域
本发明属于植物繁育技术领域,具体涉及一种桃胚挽救过程中畸形苗转化成正常植株的方法。
背景技术
植物胚是一个具有全能性的多细胞结构,通常胚能正常发育成熟,而且可以直接播种生长成为完整植株。但是早熟桃和极早熟桃种胚发育时间短,只有65~90天左右,积累的干物质少,因而播种不能萌发或萌发率极低,有些品种胚会早期败育或者退化,对于这些品种需要通过离体培养进行胚挽救工作,创造适宜的条件让胚在体外继续发育直至成苗。
但是由于多种原因,包括不同的杂交组合、不同的培养基、不同激素浓度,甚至不同年份等都会造成胚培苗中常常出现一定比例的畸形苗,畸形苗无法移栽成活,大大降低了胚挽救效率。畸形苗的形态主要表现为:第一种,种胚白化,无法转绿,不能萌发;第二种,胚根不生长,胚轴和胚芽皱缩在子叶基部,真叶卷曲;第三种,上部胚轴正常伸长,胚芽真叶正常,但是胚根须根少于5根或者没有须根;第四种,上部胚芽顶端干枯,根系正常;第五种,顶端枯死,根系没有须根;第六种,胚根正常,没有胚芽。不管是哪种情况都不具备移栽成苗的可能,这些畸形比例在不同的杂交组合中可以达到5%~50%,严重影响胚挽救的成苗率。通过查询文献,发现出现这种问题的原因主要是胚发育不完善造成的,没有茎尖生长点,或者没有根尖生长点。由于胚挽救过程中畸形苗的出现占了不小的比例,其严重制约了利用胚挽救技术进行早熟桃育种的效率。
本专利将早熟桃胚挽救过程中出现的畸形苗按照其外观形态进行分类研究,对其进行了转化利用试验,转化率达到50%以上,有效的提高了胚挽救育种效率。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种桃胚挽救过程中畸形苗转化成正常植株的方法,转化率高,有效提高了胚挽救育种效率和畸形苗的应用范围。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种桃胚挽救过程中畸形苗转化成正常植株的方法,包括以下步骤:(1)收集桃胚挽救过程中产生的畸形苗,并对所述畸形苗分类:A类畸形苗的胚根萌发或不萌发,胚芽萌发但不能伸长生长;B类畸形苗的胚根发育不正常,胚芽正常生长或顶端枯死;
(2)将所述A类畸形苗带有子叶的部分组织插入诱导培养基中进行诱导培养,得子叶腋芽萌发形成的植株;所述诱导培养基以1/2MS培育基为基本培养基,还包括:2mg/L 6-BA,30mg/L蔗糖和7g/L琼脂,pH值为5.8;
(3)将所述子叶腋芽萌发形成的植株移栽入生根培养基中进行生根培养,得正常植株;所述生根培养基以WPM培养基为基本培养基,还包括:1.0mg/L IAA、30mg/L蔗糖和7g/L琼脂,pH值为5.8;
(4)将所述B类畸形苗切割后插入所述生根培养基中进行生根培养,得到正常植株;
步骤(2)和(4)之间不存在时间上的先后顺序。
优选的,步骤(1)所述畸形苗为桃胚挽救后经培育20~30d的畸形苗。
优选的,步骤(2)所述带有子叶的部分组织包括剔除子叶上部和子叶下部0.5cm以外的组织。
优选的,步骤(2)所述诱导培养的温度为18~23℃,,光照时间为12h/d,光照强度为5000Lx;直至子叶腋芽萌发,长成2~3cm高的植株。
优选的,步骤(3)所述生根培养的温度为18~25℃,光照时间为12h/d,光照强度为5000Lx。
优选的,步骤(4)所述切割包括将所述B类畸形苗的子叶部分、茎段部分和茎尖部分分离。
优选的,利用所述切割后的子叶部分、茎段部分和茎尖部分进行生根培养的温度为18~25℃,光照时间为12h/d,光照强度为5000Lx。
优选的,待步骤(3)和步骤(4)所述正常植株的下部须根达5条以上,茎部正常伸长,真叶多于5片之后,进行移栽。
优选的,所述移栽用基质包括草炭、蛭石和珍珠岩的混合基质,所述混合基质中草炭、蛭石和珍珠岩的体积比为1:1:1。
本发明提供了一种桃胚挽救过程中畸形苗转化成正常植株的方法,首先将早熟桃胚挽救过程中出现的畸形苗按照其外观形态进行分类研究,针对存在生长点异常的A类畸形苗和B类畸形苗进行转化,对于A类畸形苗通过剪头去尾,打破顶端优势,刺激子叶基部的腋芽萌发,形成新的植株,然后再通过生根培养,得到完整的植株幼苗;而对于B类畸形苗可以将胚培苗分成三部分,三部分均可正常生长生根,但是以子叶部分生长最为迅速和健壮,接种后根系生长迅速且粗壮,上部新稍生长快,叶片肥厚,叶色浓绿,根据需要可以再转接扩繁,也可以用于保种。在本发明实施例中,通过对沪油002×中油9号的杂交胚进行胚挽救后产生的畸形苗进行转化,成苗率50%以上,大大提高了育种效率。
附图说明
图1为畸形苗的形态图,其中①为A类畸形苗,根部发育,茎部畸形;②为A类畸形苗,根部不发须根,茎部畸形;③为B类畸形苗,根部须根生长缓慢,茎尖卷曲或者枯死;④为C类畸形胚,无法挽救;
图2为A类畸形苗诱导培养后的形态,图2中的左、中、右分别表示接种后、腋芽萌发、腋芽生长;
图3为B类畸形苗切割成三段进行生根培养图,图3中的左、中、右分别表示茎尖部分、茎段部分和子叶部分;
图4为B类畸形苗的三段生根状态,图4中的左、中、右分别表示茎尖生根、茎段部分生长、子叶部分成苗生根;
图5中的左、中、右分别表示畸形苗生根状态、畸形苗移栽初期杯子保温和畸形苗移栽成活。
具体实施方式
本发明提供了一种桃胚挽救过程中畸形苗转化成正常植株的方法,包括以下步骤:(1)收集桃胚挽救过程中产生的畸形苗,并对所述畸形苗分类:A类畸形苗的胚根萌发或不萌发,胚芽萌发但不能伸长生长;B类畸形苗的胚根发育不正常,胚芽正常生长或顶端枯死;
(2)将所述A类畸形苗的带有子叶的部分组织插入诱导培养基中进行诱导培养,得子叶腋芽萌发形成的植株;所述诱导培养基以1/2MS培育基为基本培养基,还包括:2mg/L6-BA,30mg/L蔗糖和7g/L琼脂,pH值为5.8;
(3)将所述子叶腋芽萌发形成的植株移栽入生根培养基中进行生根培养,得正常植株;所述生根培养基以WPM培养基为基本培养基,还包括:1.0mg/L IAA、30mg/L蔗糖和7g/L琼脂,pH值为5.8;
(4)将所述B类畸形苗切割后插入所述生根培养基中进行生根培养,得到正常植株;
步骤(2)和(4)之间不存在时间上的先后关系。
本发明收集桃胚挽救过程中产生的畸形苗,并对所述畸形苗分类:A类畸形苗的胚根萌发或不萌发,胚芽萌发但不能伸长生长;B类畸形苗的胚根发育不正常,胚芽正常生长或顶端枯死。本发明所述畸形苗优选为桃胚挽救后经培育20~30d的畸形苗,此时的畸形苗转化成功率较高。在本发明中,可将畸形苗划分为三类,其中A类畸形苗,胚根萌发但根量极少,或者胚根不萌发,胚芽虽然萌发但均畸形,皱缩无法正常伸长生长(胚根和胚芽均不正常,图1中①和②);B类畸形苗,胚芽可以发育成正常的茎叶,但是顶部枯死,胚根发育不正常(无胚根,胚芽正常,图1中③);C类畸形苗胚根和胚芽均没有萌发(图1中④)。其中C类畸形苗由于没有生长点,无法挽救成功。
本发明将所述A类畸形苗的带有子叶的部分组织插入诱导培养基中进行诱导培养,得子叶腋芽萌发形成的植株;所述诱导培养基以1/2MS培育基为基本培养基,还包括:2mg/L 6-BA,30mg/L蔗糖和7g/L琼脂,pH值为5.8。本发明优选对所述A类畸形苗进行处理后再做诱导培养,所述处理包括剔除子叶上部和子叶下部0.5cm以外的组织,将得到的子叶段组织进行诱导培养。本发明进行所述诱导培养时,将所述子叶段组织竖直向下插入所述诱导培养基中,于18~23℃,昼夜12h/12h,组培架上进行所述诱导培养,光照强度优选为5000Lx。本发明所述A类畸形苗,通过剪头去尾(切除子叶上部和下部0.5cm以外的部分),打破顶端优势,刺激子叶基部的腋芽萌发,可以有50%左右的胚能发出正常的新稍,促进形成新的植株。
得子叶腋芽萌发形成的植株后,本发明将所述子叶腋芽萌发形成的植株移栽入生根培养基中进行生根培养,得正常植株;所述生根培养基以WPM培养基为基本培养基,还包括:1.0mg/L IAA、30mg/L蔗糖和7g/L琼脂,pH值为5.8。本发明优选待所述植株生长至3~7cm高时,转接到所述生根培养基上。本发明所述生根培养时,优选将所述茎段竖直向下插入所述生根培养基,所述生根培养的温度优选为18~25℃,光照时间优选为12h/d,光照强度优选为5000Lx。
本发明将所述B类畸形苗切割后插入所述生根培养基中进行生根培养,得到正常植株。本发明进行所述生根培养时,优选将所述B类畸形苗的子叶部分、茎段部分和茎尖部分切割分离,三部分均可正常生长生根,以子叶部分生长最为迅速和健壮,接种后根生长迅速,根系粗壮,上部新稍生长快,叶片肥厚,叶色浓绿,根据需要可以再转接扩繁,也可以用于保种。本发明所述生根培养的温度优选为18~25℃,光照时间优选为12h/d,光照强度优选为5000Lx。
无论是A类畸形苗转化得到的正常植株,还是B类畸形苗转化得到的正常植株,待所述正常植株的下部须根达5条以上,茎部正常伸长,真叶多于5片之后,均可进行移栽。本发明在所述移栽之前优选包括洗净所述正常植株根部的培养基,而后进行移栽,所述移栽用基质优选包括草炭、蛭石和珍珠岩的混合基质,所述混合基质中草炭、蛭石和珍珠岩的体积比优选为1:1:1。本发明在所述移栽结束后,优选还包括浇稀释800倍多菌灵水溶液,然后每根苗盖一次性塑料杯保湿,3~5d幼苗缓苗成活后慢慢揭开杯子透气,再进行移栽后培养,所述移栽后培养的温度优选为18~25℃,光照时间优选为12h/d,光照强度优选为5000Lx(图5)。
下面结合实施例对本发明提供的一种桃胚挽救过程中畸形苗转化成正常植株的方法进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
A类畸形苗的诱导
试验材料为经过胚培养但是不能正常萌发生长的畸形胚,胚根不生长,胚轴和胚芽皱缩在子叶基部,真叶卷曲,该组合为沪油002×中油9号的杂交胚。在超净工作台中,将畸形胚的胚根及胚轴切除,仅留子叶及子叶中间的胚轴,将带子叶的部分接种到表1所示诱导培养基中,23℃光照培养一个月后进行调查,统计生根和发芽的比例(表2),生根是指基部能够发根,发芽指上部长出正常茎叶。
表1畸形胚挽救诱导培养基组分
表2不同培养基配方对畸形胚生根与成梢的影响
A培养基对畸形胚的生根与上部的生长没有影响。B培养基有20%畸形胚可以发根,有20%胚能够发出正常新梢,B培养基对畸形胚的挽救有一定效果。C处理有33.33%的苗子可以发根,16.67%的苗子可以发出正常新捎。D与E上部都没有再生新梢,但是E下部的生根率能够达到71.43%。以上结果说明了6-BA对畸形胚转化有效果,GA3与6-BA在2mg/L的浓度条件下均对转化没有作用,单纯的IAA对生根有促进作用,但是不能促进胚发芽。GA3、6-BA、IAA三者都存在时也没有效果。综合比较BC培养基有转化作用,但是转化比例过低。
实施例2
A类畸形苗的诱导
试验材料为经过胚培养但是不能正常萌发生长的畸形胚,胚根不生长,胚轴和胚芽皱缩在子叶基部,真叶卷曲,该组合为沪油002×中油9号的杂交胚。在超净工作台中,将畸形胚的胚根及胚轴切除,仅留子叶及子叶中间的胚轴,将带子叶的部分接种到表3所示培养基中,23℃光照培养一个月后进行调查,统计生根和发芽的比例(表4),表明1/2MS更适合畸形胚的芽分化。
表3不同培养基配方对畸形胚转化率的影响
实施例3
A类畸形苗的诱导应用
试验材料为经过胚培养但是不能正常萌发生长的畸形胚,胚根不生长,胚轴和胚芽皱缩在子叶基部,真叶卷曲。在超净工作台中,将畸形胚的胚根及胚轴切除,仅留子叶及子叶中间的胚轴,将带子叶的部分接种到诱导培养基中(1/2MS+2mg/L 6-BA+30mg/L蔗糖+7g/L琼脂,pH值为5.8),23℃光照培养一个月后进行调查,统计生根和发芽比例(表4,图2),不同杂交组合的畸形苗转化比例从16~80%不等,平均值达到53.62%。
表4畸形胚挽救
实施例4
A类畸形苗诱导后的生根和成苗
畸形胚诱导萌发后,当新稍长到3~5cm时转接到生根培养基(WPM+1.0mg/L IAA+30mg/L蔗糖+7g/L琼脂,pH值为5.8)中。为了减少污染带来的损失,每个杂交后代单株接种到2~3个新稍到不同的组培瓶中进行生根。
表5A类畸形胚诱导后生根
实施例5
B类畸形苗不同培养基类型的生根效果比较
培养基为1/2MS+1mg/L IAA与WPM+1mg/L IAA进行对比。组合为表4或表5中的杂交胚组合。每个畸形苗切割成三段进行生根培养。子叶、顶芽、茎段,统计总的生根苗数量如表6所示,WPM+1mg/L IAA培养基生根率较1/2MS+1mg/L IAA高,组培苗叶色浓绿,粗壮。
表6不同培养基对根与新稍生长的影响
实施例6
B类畸形苗不同部位生根效果比较
使用WPM+1mg/LIAA培养基作为生根培养基,比较图3所示的不同部位生根效果,结果如表7和图4所示,带子叶茎段发根与成苗率都在80%,但是带子叶的接种后新茎段生长迅速,苗比较壮。顶芽接种后上部生长与发根的比例达到100%,但是顶芽部接种后先生根,上部生长缓慢,大约1个半月后上部才开始迅速生长,长成的植株根系旺盛但是上部较矮,茎段上部发芽生长的比例达到100%,生根率达到60%,生长规律与顶芽相似。三个部位均可以作为扩繁的材料,从苗子健壮程度考虑带子叶茎段较好。实际应用中为了增加成活比例,建议三个部分都进行接种。
表7不同取样部位对生长的影响
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种桃胚挽救过程中畸形苗转化成正常植株的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)收集桃胚挽救过程中产生的畸形苗,并对所述畸形苗分类:A类畸形苗的胚根萌发或不萌发,胚芽萌发但不能伸长生长;B类畸形苗的胚根发育不正常,胚芽正常生长或顶端枯死;
(2)将所述A类畸形苗带有子叶的部分组织插入诱导培养基中进行诱导培养,得子叶腋芽萌发形成的植株;所述诱导培养基以1/2MS培育基为基本培养基,还包括:2mg/L 6-BA,30mg/L蔗糖和7g/L琼脂,pH值为5.8;
(3)将所述子叶腋芽萌发形成的植株移栽入生根培养基中进行生根培养,得正常植株;所述生根培养基以WPM培养基为基本培养基,还包括:1.0mg/L IAA、30mg/L蔗糖和7g/L琼脂,pH值为5.8;
(4)将所述B类畸形苗切割后插入所述生根培养基中进行生根培养,得到正常植株;
步骤(2)和(4)之间不存在时间上的先后顺序。
2.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤(1)所述畸形苗为桃胚挽救后经培育20~30d的畸形苗。
3.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤(2)所述带有子叶的部分组织包括剔除子叶上部和子叶下部0.5cm以外的组织。
4.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤(2)所述诱导培养的温度为18~23℃,光照时间为12h/d,光照强度为5000Lx;直至子叶腋芽萌发,长成2~3cm高的植株。
5.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤(3)所述生根培养的温度为18~25℃,光照时间为12h/d,光照强度为5000Lx。
6.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤(4)所述切割包括将所述B类畸形苗的子叶部分、茎段部分和茎尖部分分离。
7.根据权利要求6所述方法,其特征在于,利用所述切割后的子叶部分、茎段部分和茎尖部分进行生根培养的温度为18~25℃,光照时间为12h/d,光照强度为5000Lx。
8.根据权利要求1所述方法,其特征在于,待步骤(3)和步骤(4)所述正常植株的下部须根达5条以上,茎部正常伸长,真叶多于5片之后,进行移栽。
9.根据权利要求8所述方法,其特征在于,所述移栽用基质包括草炭、蛭石和珍珠岩的混合基质,所述混合基质中草炭、蛭石和珍珠岩的体积比为1:1:1。
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