CN105359948B

CN105359948B - 杂种落叶松微扦插育苗方法

Info

Publication number: CN105359948B
Application number: CN201510578994.XA
Authority: CN
Inventors: 张守攻; 孙晓梅; 李魁鹏; 韩华
Original assignee: Research Institute of Forestry of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Research Institute of Forestry of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2015-09-11
Filing date: 2015-09-11
Publication date: 2018-08-28
Anticipated expiration: 2035-09-11
Also published as: CN105359948A

Abstract

本发明涉及一种杂种落叶松微扦插育苗方法。本发明方法包括如下步骤：(1)准备扦插材料：从日本落叶松×长白落叶松杂种无性系植株上采集当年生嫩枝，灭菌；(2)诱导生根：采用两步生根法进行，即：将灭菌后的嫩枝在含有生长素的改良L₉培养基中进行生根诱导后，再将嫩枝转入不含生长素的改良L₉培养基中进行生根培养，整个过程在光照培养箱中进行。采用本发明的方法进行扦插，显著提高了杂种落叶松插穗生根率，嫩枝生根率高达85.0％以上，30天左右可见不定根，平均每株生根根数为11条，有效缩短了优良种植材料的育苗周期，扩大了繁殖系数，开创了杂种落叶松优良种苗培育的新途径。

Description

杂种落叶松微扦插育苗方法

技术领域

本发明涉及一种杂种落叶松微扦插育苗方法，属于林业遗传育种领域。

背景技术

落叶松是松科的落叶乔木，主要分布在我国东北、内蒙古林区以及华北、西南的高山地区，是我国重要速生用材树种和生态造林树种，具有适应性强、早期速生、成林快、病虫害少等优点。日×长杂种落叶松由于聚合了日本落叶松母本的速生性和长白落叶松父本的环境适应性，从而在生长、抗性等方面表现出明显的超亲杂种优势。但受种间花期不遇、种子丰欠年等因素影响，通过人工制备杂种种子方式无法满足生产需要。

国内外对华北(L.principis-rupprechtii Mayr)、长白(L.olgensis Henry)、兴安(L.gmelinii(Rupr.)Rupr.)、日本(L.kaempferiLamb.Carr.)等落叶松的体胚发生、芽增殖和植株生根等组织离体培养技术进行了研究(吕守芳，2005；吴克贤，1996；齐力旺，1996；Ewald，2007；Lin,2004)，而培养材料的基因型和培养基成分是影响落叶松组培成功与否的关键。以芽为外植体的直接发生途径获得的植株具有遗传稳定性好、自然变异频率低、适应性强和移栽成活率高等优点。但芽增殖系数和不定根诱导率低一直是制约落叶松器官直接再生途径——组织培养的主要因素。

无性繁殖技术的发展，为杂种利用开辟了一条高效新途径，并形成了以人工控制授粉有性配制目标杂种为基础、采穗圃经营为主体、扦插繁殖利用为手段的落叶松杂种利用技术体系(王笑山，2000)，突破落叶松插穗生根困难的技术瓶颈，实现了落叶松无性扦插繁殖。但落叶松扦插需要用当年生半木质化嫩枝作插穗，目前生产中的技术应用只能在每年的6月下旬至7月初进行一次性户外扦插，受到树龄、部位、季节和取材数量等多种因素的限制，扦插育苗数量无法满足市场对于落叶松良种种苗的需求。

因此，需要开发一种新的落叶松扦插育苗方法，提高不定根诱导率和芽增殖系数，从而大量培育具有超亲杂种优势的落叶松种苗，满足市场需求。

发明内容

根据上述领域存在的不足和需求，本发明提供一种杂种落叶松微扦插育苗方法，该方法提高了嫩枝的不定根生根率，有效缩短了育苗周期。

本发明请求保护的技术方案如下：

一种杂种落叶松微扦插育苗方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)准备扦插材料：从日本落叶松×长白落叶松杂种无性系植株上采集当年生嫩枝，灭菌；

(2)诱导生根：采用两步生根法进行，即：将灭菌后的嫩枝在含有生长素的改良L₉培养基中进行生根诱导后，再将嫩枝转入不含生长素的改良L₉培养基中进行生根培养，整个过程在光照培养箱中进行；

所述含有生长素的改良L₉培养基的配方为：NAA2.0mg/L、IBA0.25mg/L、KNO₃633.33mg/L、NH₄NO₃550mg/L、KH₂PO₄56.67mg/L、CaCl₂·2H₂O 110.67mg/L、MgSO₄·7H₂O60.18mg/L、FeNaEDTA36.70mg/L、H₃BO₃6.20mg/L、ZnSO₄·H₂O 8.60mg/L、MnSO₄·H₂O16.90mg/L、Na₂M_OO₄·2H₂O 0.25mg/L、KI 0.83mg/L、CuSO₄·5H₂0 0.025mg/L、CoCl₂·6H₂O0.025mg/L、谷氨酸5mg/L、半胱氨酸5mg/L、甘氨酸25mg/L、蔗糖5000mg/L、琼脂5000mg/L，pH值为6.5；

所述不含生长素的改良L₉培养基的配方：KNO₃633.33mg/L、NH₄NO₃550mg/L、KH₂PO₄56.67mg/L、CaCl₂·2H₂O 110.67mg/L、MgSO₄·7H₂O 60.18mg/L、FeNaEDTA36.70mg/L、H₃BO₃6.20mg/L、ZnSO₄·H₂O 8.60mg/L、MnSO₄·H₂O 16.90mg/L、Na₂M_OO₄·2H₂O 0.25mg/L、KI0.83mg/L、CuSO₄·5H₂0 0.025mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L、谷氨酸5mg/L、半胱氨酸5mg/L、甘氨酸25mg/L、蔗糖5000mg/L、琼脂5000mg/L，pH值为6.5。

所述当年生嫩枝采自日本落叶松×长白落叶松杂种无性系的两年生无性系植株。

所述气候室以白炽灯为光源，光照期为每天16小时，光照强度2000～3000lx，温度23±2℃，空气湿度50％。

所述采集当年生嫩枝是指剪取长度为3-8cm的嫩枝作为插穗，并剪去嫩枝基部往上2cm内的叶片。

所述灭菌的步骤如下：先将嫩枝浸入洗涤液摇晃浸泡20-30min，刷洗后流水冲洗20-30min；然后在无菌条件下用体积百分比为15％的次氯酸钠溶液对嫩枝进行灭菌处理8-10min，再用灭菌水清洗嫩枝3次以上。

所述诱导生根步骤中，所述嫩枝在含有生长素的改良L₉培养基中进行生根诱导的诱导期为7-10天，在不含生长素的改良L₉培养基中进行生根培养的培养期为15天。

所述光照培养箱昼间培养温度为22℃，光照强度1500～2000lx，夜间培养温度为17℃，光暗周期时长为16/8小时。

上述方法，在准备扦插材料之前还包括构建微型采穗圃，以日本落叶松×长白落叶松无性系为繁殖材料，将两年生无性系植株培养在气候室内，作为采穗母株，构建室内微型采穗圃。

还包括如下移苗步骤：当组培苗根长达2.0㎝～3.0㎝时，将生根苗从光照培养箱移至育苗室，10-15天后移栽至营养土中培养；有嫩梢长出时，将其移栽到大田；

所述营养土的配方为草炭土：珍珠岩：干鸡粪＝6：2：2；

所述育苗室的培养条件为：光照6000Lx，16h光照，8h黑暗，室温21℃。

用于杂种落叶松微扦插育苗的生根培养基，其配方如下：KNO₃633.33mg/L、NH₄NO₃550mg/L、KH₂PO₄56.67mg/L、CaCl₂·2H₂O 110.67mg/L、MgSO₄·7H₂O 60.18mg/L、FeNaEDTA 36.70mg/L、H₃BO₃6.20mg/L、ZnSO₄·H₂O 8.60mg/L、MnSO₄·H₂O 16.90mg/L、Na₂M_OO₄·2H₂O 0.25mg/L、KI 0.83mg/L、CuSO₄·5H₂0 0.025mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L、谷氨酸5mg/L、半胱氨酸5mg/L、甘氨酸25mg/L、蔗糖5000mg/L、琼脂5000mg/L，pH值为6.5。

本发明在系统总结连续多年的无性系扦插生根试验和连续多年的野外无性系评比试验的基础上，以中国林科院林业所选育出的生长性状和扦插生根能力兼优的日×长杂种无性系日永8×长混18-10为研究对象，选取该无性系的嫩枝外植体为材料，进行器官直接再生组织离体培养技术的研究，摸索适合杂种落叶松嫩枝生长、芽增殖和不定根诱导的最佳培养基，将杂种落叶松插穗生根率提高至85％以上，有效缩短了优良种植材料的育苗周期，为构建杂种落叶松高效、稳定的组织培养再生体系，规模化生产杂种落叶松组培苗木提供技术保障。

相比传统的落叶松扦插技术,本发明提供的杂种落叶松微扦插育苗方法以生长和生根优良的杂种落叶松无性系为繁殖材料，通过构建室内微型采穗圃，选取所述繁殖材料当年生嫩枝，在室内可控条件下运用两步生根法利用微型采穗圃母株上的嫩枝进行生根诱导和生根培养，具有不受季节制约及嫩枝萌发数量多等优势,可在短期内规模繁殖性状稳定的良种苗木。国内外关于落叶松组培的研究所用外植体多为合子胚，培养出的苗木需要经过进一步的鉴定才能商业化，本发明以经测定的优良无性系为繁殖材料，通过改良生根培养配方和优化培养条件，可以有效地固定杂种优势，规模地繁殖性状稳定一致的良种苗木，不但可以节省土地，速度快，质量好，技术密集，更便于集约管理和工厂化生产，具有广阔的应用前景。

在本发明的优选实施例中，所述气候室内以白炽灯为光源，光照期为每天16小时，光照强度2000～3000lx，温度23±2℃，空气湿度50％。相对空气湿度的变化对内室培养的嫩枝材料灭菌后的污染率影响很大。当相对空气湿度大于50％时，随着空气湿度的增加，材料污染率会随之提高。将室内相对湿度控制在50％以下，选择15％的次氯酸钠10分钟灭菌的效果较好。该条件下灭菌后，嫩枝的无菌存活率达到了91.7％。

在本发明的一些实施例中，从采穗圃母株上剪取长度为3－8cm的嫩枝作为插穗，所述嫩枝长度优选为5－8cm，更优选为5cm；然后剪去嫩枝基部往上2cm内的叶片。对嫩枝进行灭菌处理时，优选先将嫩枝浸入洗涤液摇晃浸泡20－30min，刷洗后流水冲洗20－30min；然后在无菌条件下用体积百分比为15％的次氯酸钠溶液对嫩枝进行灭菌处理8－10min，再用灭菌水清洗嫩枝3次以上。

实验表明，杂种落叶松不适于培养基中添加IAA、IBA和NAA的一步生根法。本发明采用两步生根法进行不定根诱导，而在两步生根法中，NAA和IBA的配合使用取得很好的生根诱导效果。通过比较0.25mg·L^-1、1mg·L^-1和1.75mg·L^-1三个浓度的IBA配合2.0mg·L^- ¹NAA的诱导效果，结果表明，随着IBA浓度的提高，杂种落叶松的生根率、存活率和平均生根数都不断下降，平均生根时间不断延长。使用2.0mg/L NAA和0.25mg/L IBA诱导10天，杂种落叶松的生根率最高，达到92.9％。

本发明对L₉培养基的配方进行了优化，主要对谷胱甘肽合成前体氨基酸、pH、蔗糖、生根诱导期等因素对杂种落叶松不定根的影响进行了分析。结果显示5-50mg·L^-1浓度范围内谷氨酸对杂种落叶松嫩枝生根过程的存活率影响显著，此外谷氨酸对于杂种落叶松嫩枝的生根率也有明显影响。外源添加5mg·L^-1谷氨酸的生根效果最好。在培养基pH 5.2-7.5范围内，随着pH的升高，杂种落叶松的生根率也呈现升高的趋势，并且pH对杂种落叶松不定根形成的平均根数产生了显著影响。结合几个生根指标分析，培养基pH为6.5时，杂种落叶松生根效果最好。蔗糖对杂种落叶松的生根率和存活率都产生了显著影响。在培养基蔗糖浓度为2.5–7.5g·L^-1范围内，杂种落叶松的生根率、存活率和平均根数随着蔗糖浓度的提高而提高。当培养基蔗糖浓度超过10g·L^-1后，生根率、存活率和平均根数随着蔗糖浓度的提高而显著下降，且生根时间变长。结合几个生根指标分析，培养基蔗糖浓度为7.5g·L^-1时，杂种落叶松生根效果最好。综合所有试验因素和水平分析，诱导杂种落叶松嫩枝不定根发生效果最好的是：材料在含2.0mg·L^-1NAA、0.25mg·L^-1IBA及1/3大量元素的L9培养基中进行生根诱导处理10天后，转入不含生长素的含1/3大量元素的L9培养基中进行生根培养。L9基本培养基pH为6.5，蔗糖浓度为5g·L^-1，添加5mg·L^-1的谷氨酸。

所述光照培养箱昼间培养温度优选为22℃，光照强度1500～2000lx，夜间培养温度为17℃，光暗周期时长为16/8小时。

在本发明的优选实施例中，所述嫩枝在含有生长素的改良L₉培养基中进行生根诱导的诱导期为7-10天，在不含生长素的改良L₉培养基中进行生根培养的培养期为15天。

在本发明的一些实施例中，优选将生根苗从培养室移至育苗室内，移栽到浸透水的容器块中，10-15天后带着容器块移栽至营养钵内的营养土中，从而最大限度地减小移苗过程中对根部的损害。所述容器块优选规格为38mm的JIFFY容器块。

所述营养土的配方优选为草炭土：珍珠岩：干鸡粪＝6：2：2。

所述育苗室的培养条件优选为光照6000Lx，16h光照，8h黑暗，室温21℃。

将生根苗移栽至营养土后30-40天，有嫩梢长出时，即可适时将其移栽到大田。生根苗移栽到大棚后需搭拱棚，覆膜保湿，15-20天揭膜，揭膜后根据营养土的干燥情况及时浇水，维持良好的生长状况。

综上，本发明提供的杂种落叶松微扦插育苗方法，以经测定的优良无性系为繁殖材料，通过改良生根培养配方和优化培养条件，显著提高了杂种落叶松插穗生根率，扩大了繁殖系数，克服了常规扦插受季节和插穗数量等因素的限制，有效缩短了优良种植材料的育苗周期，开创了杂种落叶松优良种苗设施培育的新途径。

附图说明

图1和图2为本发明杂种落叶松微型采穗圃的照片。

图3和图4为本发明杂种落叶松嫩枝瓶内扦插的照片。

图5和图6为本发明杂种落叶松瓶内微扦插生根后根系的照片。

图7和图8为本发明杂种落叶松微扦插生根后移栽至容器内的植株生长的照片。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明进行详细说明，需要理解的是，下述实施方式仅作为对本发明的解释和说明，而不以任何形式限制本发明的保护范围。

植物材料：日×长杂种无性系日永8×长混18-10无性系两年生落叶松植株，由中国林科院林业所选育。

本发明实施例中未特别说明的生物化学试剂，均属于本领域常规试剂，可通过商购或本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。

实施例1、杂种落叶松微扦插育苗最佳条件的筛选

数据统计与分析方法：

植株无菌存活率＝无菌植株的株数/接种植株数。平均单个嫩枝萌发的隐芽数＝萌发的隐芽数/接种的嫩枝数。隐芽成枝率＝成枝的隐芽数/接种的总隐芽数。不定芽诱导率＝成功诱导出不定芽的休眠芽数/接种的休眠芽数。平均单个萌发休眠芽形成的不定芽数＝不定芽形成总个数/成功诱导的休眠芽数。生根率＝生根嫩枝数/处理接种的总嫩枝数。平均生根数＝处理总生根数/处理生根嫩枝数。平均生根时间＝处理中各嫩枝发根时间之和/处理中生根的嫩枝数。植株存活率＝处理存活嫩枝数/处理接种的总嫩枝数。

方差分析和多重比较用SPSS19.0进行。多重比较采用5％的Duncan检验，表中a,b,c,d,e等不同字母表示处理间差异显著。百分率数据在反正弦变换后再进行分析。

1、不同灭菌剂不同处理时间对外植体灭菌效果的影响

采用15％次氯酸钠、0.1％氯化汞、70％酒精3种灭菌剂(灭菌剂浓度是体积百分比),分别6min、8min、10min和12min 4个灭菌时间的双因素试验设计，共12个处理。每个处理接种20个外植体，每个处理重复3次。选取长约5cm的嫩枝，剪去嫩枝基部2cm内叶片。将嫩枝浸入洗涤液摇晃浸泡20min，刷洗后流水冲洗30min。在超净台中用灭菌水清洗3次以上，接入B培养基，4周后统计植株无菌存活率。

不同灭菌处理的灭菌效果见表1。各处理中，15％次氯酸钠处理10min嫩枝无菌存活率最高，达到91.7％，灭菌效果最好；其次是0.1％氯化汞处理8min，嫩枝无菌存活率84.6％；70％酒精处理6min，嫩枝无菌存活率达到82.8％。氯化汞属于重金属有害物质,残留的重金属会对植物造成伤害，同时氯化汞废液也需要特别处理，70％的酒精灭菌处理后嫩枝叶子明显变黄(这与处理过程中植物的叶绿素溶解于酒精有关)，而次氯酸钠相对温和。因此，采用15％的次氯酸钠处理8分钟，灭菌效果最好。无菌嫩枝生长如图3和图4所示。

表1.不同灭菌剂不同处理时间对外植体的灭菌效果

注：列中不同字母表示在0.05水平上差异显著。

2、两步生根法不同氨基酸和蔗糖的浓度、pH及诱导期对不定根形成的影响

将经灭菌处理的嫩枝材料接种于不同浓度的谷氨酸(5mg·L^-1、25mg·L^-1、50mg·L^-1)、半胱氨酸(5mg·L^-1、25mg·L^-1、50mg·L^-1)、甘氨酸(5mg·L^-1、25mg·L^-1、50mg·L^-1)、蔗糖(2.5g·L^-1、5mg·L^-1、7.5mg·L^-1)、不同pH(5.7、6.2、6.7)、不同生根诱导期(8d、11d、14d)组合的含1/3大量元素及2mg·L–1NAA的L9培养基进行生根诱导处理。经生根诱导后的材料转接入无生长调节剂、含与诱导培养基相同浓度的谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、蔗糖、pH及1/3大量元素的L9培养基进行生根培养。试验按照L18(37)的正交试验设计，各因素的1-3水平按照各因素括号内的水平从前到后依次设定，详见表2。每个处理接种20个萌发的隐芽，重复3次。处理8周后，统计不同处理材料的生根率、平均生根数、植株存活率。

极差结果如表2所示，影响生根率因素的主次顺序为：pH>谷氨酸>甘氨酸>蔗糖>诱导期>半胱氨酸。因素的最优水平为pH 6.7，谷氨酸50mg·L^-1，甘氨酸25mg·L^-1，蔗糖7.5g·L^-1，诱导期14d，半胱氨酸5mg·L^-1。按照极差结果分析，影响嫩枝存活因素的主次顺序为：谷氨酸>甘氨酸>pH>蔗糖>半胱氨酸>诱导期。因素的最优水平为谷氨酸5mg·L^-1，甘氨酸25mg·L^-1，pH 6.7，蔗糖7.5g·L^-1，半胱氨酸5mg·L^-1，诱导期14d。按照极差结果分析影响生根数因素的主次顺序为：pH>谷氨酸>诱导期>蔗糖>半胱氨酸>甘氨酸。因素的最优水平为pH6.2、谷氨酸50mg·L^-1、诱导期8d、蔗糖7.5g·L^-1、半胱氨酸50mg·L^-1、甘氨酸25mg·L^-1。不同处理组合的方差分析和多重比较结果如表3所示，谷氨酸的不同水平对于存活率的影响显著。5mg·L^-1谷氨酸的存活率显著高于25mg·L^-1谷氨酸的存活率。

由此可见,谷氨酸显著影响嫩枝生根过程的存活率。综合考虑,谷氨酸5mg·L^-1，半胱氨酸5mg·L^-1，甘氨酸25mg·L^-1，pH 6.7，蔗糖7.5g·L^-1，诱导期14d的组合生根效果好。

表2.氨基酸和蔗糖的浓度、pH及诱导期的变化影响不定根形成的极差分析

表3.氨基酸和蔗糖的浓度、pH及诱导期的变化影响不定根形成的方差分析及多重比较

注：列中不同字母表示在0.05水平上差异显著。*代表P<0.1；**代表P<0.05。

3、两步生根法中吲哚丁酸和蔗糖浓度、pH及生根诱导期的变化对不定根形成的影响

将经灭菌处理的嫩枝材料接种于不同浓度的吲哚丁酸(0.25mg·L^-1、1mg·L^-1、1.75mg·L^-1)、蔗糖(5g·L^-1、10g·L^-1、15mg·L^-1)、不同pH(6.5、7、7.5)、不同生根诱导期(10d、14d、18d)组合的含1/3大量元素及2mg·L^–1NAA的L9培养基进行生根诱导处理。经生根诱导后的材料转接入无生长调节剂、含与诱导培养基相同浓度的蔗糖、pH及谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、1/3大量元素的L9培养基进行生根培养(加入谷光氨肽氨基酸)。试验按照L18(37)的正交试验设计，各因素的1-3水平按照各因素括号内的水平从前到后依次设定，详见表4。每个处理接种20个萌发的隐芽，重复3次。处理8周后，统计不同处理材料的生根率、平均生根数、植株存活率、平均生根时间。

极差结果如表4所示，影响生根率因素的主次顺序为：蔗糖>IBA>诱导期>pH。因素的最优水平为蔗糖10g·L^-1，IBA0.25mg·L^-1，诱导期10d，pH 7.5。极差结果分析，影响嫩枝存活因素的主次顺序为：蔗糖>IBA＝诱导期＝pH。因素的最优水平为蔗糖5和10g·L^-1,IBA0.25和1.75mg·L^-1，诱导期10和18d,pH 7和7.5。极差结果分析，影响平均生根期因素的主次顺序为：诱导期>蔗糖>IBA>pH。因素的最优水平为诱导期10d，蔗糖5g·L^-1，IBA1.75mg·L^-1，pH 6.5。极差结果分析，影响平均根数因素的主次顺序为：蔗糖>pH>IBA>诱导期。因素的最优水平为蔗糖5g·L^-1，pH 6.5，诱导期10d，IBA0.25mg·L^-1。不同处理组合的方差分析和多重比较结果如表5所示。蔗糖和pH的不同水平对平均根数的影响达到了显著水平。

由此可见，蔗糖和pH对于杂种落叶松不定根发生的影响显著。综合考虑，诱导期10d，蔗糖10g·L^-1，IBA0.25mg·L^-1，pH 6.5对杂种落叶松生根处理的效果好。组培瓶内嫩枝生根如图5和图6所示。

表4.吲哚丁酸和蔗糖浓度、pH及生根诱导期的变化影响不定根形成的极差分析

表5.吲哚丁酸和蔗糖浓度、pH及生根诱导期的变化影响不定根形成的方差分析及多重比较

实施例2、杂种落叶松微扦插育苗方法

1、微型采穗圃的构建

将中国林科院林业所选育出的生长性状和扦插生根能力兼优的日×长杂种无性系日永8×长混18-10无性系两年生植株培养在气候室内，作为杂种落叶松微型采穗圃母株。气候室是以白炽灯为光源，一天光照期为16小时，光照强度2000～3000lx，温度23±2℃，空气湿度50％。

2、生根培养基配制

改良L₉培养基的组分及其浓度，大量元素：KNO₃633.33mg/L、NH₄NO₃550mg/L、KH₂PO₄56.67mg/L、CaCl₂·2H₂O 110.67mg/L、MgSO₄·7H₂O 60.18mg/L；铁盐：FeNaEDTA36.70mg/L；微量元素：H₃BO₃6.20mg/L、ZnSO₄·H₂O 8.60mg/L、MnSO₄·H₂O16.90mg/L、Na₂M_OO₄·2H₂O 0.25mg/L、KI 0.83mg/L、CuSO₄·5H₂0 0.025mg/L、CoCl₂·6H₂O0.025mg/L；有机质：谷氨酸5mg/L、半胱氨酸5mg/L、甘氨酸25mg/L、蔗糖5000mg/L、琼脂5000mg/L、pH值为6.5。

配制和分装培养基，经高压蒸汽灭菌锅灭菌处理后冷却后备用。

3、嫩枝灭菌处理

剪取杂种落叶松微型采穗圃母株上长约5cm的嫩枝，剪去嫩枝基部2cm内叶片。将嫩枝浸入洗涤液摇晃浸泡20min，刷洗后流水冲洗30min。以体积百分比为15％的次氯酸钠作为灭菌剂。在超净台内无菌条件下，嫩枝材料经灭菌剂处理10min后，在灭菌水中清洗3次以上。

4、杂种落叶松嫩枝生根诱导培养

经灭菌处理的杂种落叶松嫩枝接种于添加生长素为2.0mg/L NAA和0.25mg/L IBA的改良L₉培养基中进行10天的生根诱导培养。生根诱导培养在光照培养箱中进行。光照培养箱昼间培养温度为22℃，光照强度1500～2000lx，夜间培养温度为17℃。光暗周期时长为16/8小时。

5、杂种落叶松嫩枝生根培养

将经生根诱导培养的杂种落叶松嫩枝转接入不含生长素的改良L₉培养基中进行生根培养。生根培养在光照培养箱中进行，培养条件与步骤4中的生根诱导培养条件相同，培养期约为15天。

6、生根苗移栽

当组培苗根长达2.0㎝～3.0㎝时，将瓶苗从培养室移至育苗室，移栽到浸透水的规格38mm的JIFFY容器块(挪威公司，中文名叫捷菲)中，10-15天后带着容器块栽到营养钵中，营养土的配方为草炭土：珍珠岩：干鸡粪＝6：2：2。也可直接将生根苗移栽到营养钵中，营养土的配方同上。生根苗移栽后需搭拱棚，覆膜保湿，15-20天揭膜，揭膜后根据营养土的干燥情况及时浇水。育苗室条件：光照6000Lx，16h光照，8h黑暗，室温21℃。生根苗移栽后大约30-40天，有嫩梢长出，可适时移栽到大田。

实验结果：

以杂种落叶松无性系日永8×长混18-10的180枝嫩枝为材料运用本方法进行扦插，结果嫩枝生根率可达到85.0％以上，30天左右可见不定根，平均每株生根根数为11条。

Claims

1.一种杂种落叶松微扦插育苗方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）准备扦插材料：从日本落叶松×长白落叶松杂种无性系植株上采集当年生嫩枝，灭菌；

（2）诱导生根：采用两步生根法进行，即：将灭菌后的嫩枝在含有生长素的改良L₉培养基中进行7-10天的生根诱导后，再将嫩枝转入不含生长素的改良L₉培养基中进行15天的生根培养，整个过程在光照培养箱中进行；

所述含有生长素的改良L₉培养基的配方为：NAA 2.0mg/L、IBA 0.25 mg/L、KNO₃633.33mg/L、NH₄NO₃550mg/L、KH₂PO₄56.67mg/L、CaCl₂·2H₂O 110.67mg/L、MgSO₄·7H₂O60.18 mg/L、FeNaEDTA 36.70mg/L、H₃BO₃6.20 mg/L、ZnSO₄·H₂O 8.60mg/L、MnSO₄·H₂O16.90mg/L、Na₂M_OO₄·2H₂O 0.25mg/L、KI 0.83mg/L、CuSO₄·5H₂0 0.025mg/L、CoCl₂·6H₂O0.025mg/L、谷氨酸 5mg/L、半胱氨酸 5mg/L、甘氨酸 25mg/L、蔗糖 5000mg/L、琼脂5000mg/L，pH值为6.5；

所述不含生长素的改良L₉培养基的配方：KNO₃633.33mg/L、NH₄NO₃550mg/L、KH₂PO₄56.67mg/L、CaCl₂·2H₂O 110.67mg/L、MgSO₄·7H₂O 60.18 mg/L、FeNaEDTA 36.70mg/L、H₃BO₃6.20 mg/L、ZnSO₄·H₂O 8.60mg/L、MnSO₄·H₂O 16.90mg/L、Na₂M_OO₄·2H₂O 0.25mg/L、KI 0.83mg/L、CuSO₄·5H₂0 0.025mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L、谷氨酸 5mg/L、半胱氨酸5mg/L、甘氨酸 25mg/L、蔗糖 5000mg/L、琼脂 5000mg/L，pH值为6.5。

2.根据权利要求1所述的方法，所述当年生嫩枝采自日本落叶松×长白落叶松杂种无性系的两年生无性系植株。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述采集当年生嫩枝是指剪取长度为3-8cm的嫩枝作为插穗，并剪去嫩枝基部往上2cm内的叶片。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述灭菌的步骤如下：先将嫩枝浸入洗涤液摇晃浸泡20-30 min，刷洗后流水冲洗20-30 min；然后在无菌条件下用体积百分比为15%的次氯酸钠溶液对嫩枝进行灭菌处理8-10 min，再用灭菌水清洗嫩枝3次以上。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光照培养箱昼间培养温度为22℃，光照强度1500~2000lx，夜间培养温度为17℃，光暗周期时长为16/8小时。

6.根据权利要求1-5任一所述的方法，在准备扦插材料之前还包括构建微型采穗圃，以日本落叶松×长白落叶松无性系为繁殖材料，将两年生无性系植株培养在气候室内，作为采穗母株，构建室内微型采穗圃。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述气候室以白炽灯为光源，光照期为每天16小时，光照强度2000~3000lx，温度23±2°C，空气湿度50%。

8.根据权利要求7所述的方法，还包括如下移苗步骤：当组培苗根长达2.0 ㎝～3.0 ㎝时，将生根苗从光照培养箱移至育苗室，10-15天后移栽至营养土中培养；有嫩梢长出时，将其移栽到大田；

所述营养土的配方为草炭土：珍珠岩：干鸡粪=6：2：2；

所述育苗室的培养条件为：光照6000Lx，16h光照，8h黑暗，室温 21℃。

9.用于杂种落叶松微扦插育苗的生根培养基，其配方如下：KNO₃633.33mg/L、NH₄NO₃550mg/L、KH₂PO₄56.67mg/L、CaCl₂·2H₂O 110.67mg/L、MgSO₄·7H₂O 60.18 mg/L、FeNaEDTA36.70mg/L、H₃BO₃6.20 mg/L、ZnSO₄·H₂O 8.60mg/L、MnSO₄·H₂O 16.90mg/L、Na₂M_OO₄·2H₂O0.25mg/L、KI 0.83mg/L、CuSO₄·5H₂0 0.025mg/L、CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L、谷氨酸 5mg/L、半胱氨酸 5mg/L、甘氨酸 25mg/L、蔗糖 5000mg/L、琼脂 5000mg/L，pH值为6.5。