CN104839028B - 杂种落叶松离体培养不定芽诱导植株再生的方法 - Google Patents
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Abstract
杂种落叶松离体培养不定芽诱导植株再生的方法，涉及一种松树离体培养不定芽诱导植株再生的方法。是要解决现有杂种落叶松组织培养器官发生困难、植株再生率低、不定芽诱导率低的问题。方法：一、取经过预处理的杂种落叶松合子胚接种于培养基中，进行暗培养或光照培养至出现愈伤组织；二、将愈伤组织接种于培养基中光照培养，至长出不定芽；三、将带有不定芽的愈伤组织切成块转入培养基中，3周之后继代培养一次，进行不定芽伸长，转入培养基中进行不定芽的抽茎；四、将抽茎的不定芽转入培养基，光照培养以实现不定芽的生根。本发明方法不定芽诱导率为87.73％，抽茎率达75.96％，生根率达45％。用于杂种落叶松离体培养不定芽诱导植株再生。
Description
技术领域
本发明涉及一种松树离体培养不定芽诱导植株再生的方法。
背景技术
落叶松是我国主要的用材树种，在林业生产中占有重要地位，具有分布面积广，适应性强，生长迅速，耐寒能力强等特点。杂种落叶松(Hybrid Larch)是落叶松属中一个非常重要的速生树种，其遗传增益大，具有树干通直、圆满，木材坚硬、耐腐蚀等特点，是铁路、桥梁、造船、电业等方面的优良用材，也是我国东北地区的重要用材树种之一。由于杂种落叶松生长周期长，而采用常规育种技术进行新品种选育时间长、见效慢，同时还存在基因源缺乏和杂交不亲和等制约因素。通过转基因方法将目的基因直接导入受体系统并进行表达，可极大地缩短其育种周期而建立高效的组培再生体系是转基因的前提条件之一。落叶松组织器官发生困难、植株再生率低，严重的限制了落叶松快速生长。目前吴克贤等用长白落叶松的成熟胚、花芽和腋芽、幼嫩茎段作为外植体诱导出不定芽，但不定芽诱导分化率均较低，最高只有8.16％；王伟达等用长白落叶松的成熟胚为外植体也诱导出不定芽；但是诱导率都不是太高，再加上继代过程中部分死亡最终难以应用于实际生产与实践。目前还未见杂种落叶松遗传转化的研究报道，所以有必要对杂种落叶松离体培养诱导不定芽再生植株进行研究。
发明内容
本发明是要解决现有杂种落叶松组织培养器官发生困难、植株再生率低、不定芽诱导率低的问题，提供一种杂种落叶松离体培养不定芽诱导植株再生的方法。
本发明杂种落叶松离体培养不定芽诱导植株再生的方法，按以下步骤进行：
一、取经过预处理的杂种落叶松合子胚接种于含有2.0～2.5mg/L噻苯隆、1g/L肌醇、450mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、6.5g/L琼脂和30g/L蔗糖的BM改良培养基中，进行暗培养或光照培养至出现愈伤组织；
二、将愈伤组织接种于含有2.0～2.5mg/L噻苯隆的BM改良培养基中，在光照强度为33～36μmol·m-2·s-1，温度为23～25℃的环境中进行光照培养，至长出不定芽；
三、将带有不定芽的愈伤组织切成块转入含有0.1～1.0mg/L TDZ和0～0.04mg/LNAA的BM改良培养基中培养，在光照强度为32～38μmol·m-2·s-1，温度为22～24℃的环境中进行光照培养，3周之后继代培养一次，进行不定芽伸长，当不定芽伸长至2～3cm，将其转入含有0.05～1.0mg/L6-BA和0.05～1.0mg/LNAA的BM改良培养基中培养，进行不定芽的抽茎；
四、将抽茎的不定芽转入含有0.5mg/L IBA和1.0mg/L NAA的1/2BM改良培养基，控制培养基中蔗糖浓度为20g·L-1，在光照强度为32～38μmol·m-2·s-1，温度为22～24℃的环境中，进行光照培养以实现不定芽的生根。
本发明的有益效果：
本发明通过调控机制建立了高效、稳定的杂种落叶松不定芽诱导方法，利用本发明方法可解决杂种落叶松育种周期长、见效慢的问题，为落叶松的基因工程育种和遗传改良工作奠定基础。
本发明以杂种落叶松成熟胚为外植体进行不定芽的诱导，获得愈伤组织，愈伤组织诱导率高于90％，不定芽诱导率为87.73％，不定芽抽茎率高达75.96％，而不定芽生根率可达45％，现有落叶松组培研究大多集中在长白落叶松与兴安落叶松等，但不同种落叶松的组织培养体系均有差别，而杂种落叶松是落叶松种间杂交产生的可以充分利用杂种优势的优质落叶松，研究其组织培养体系具有重要的意义。本发明方法与现有技术相比产生了预料不到的技术效果，这对杂种落叶松离体培养而言是一大突破，对于杂种落叶松的大量扩繁和基因工程育种研究具有广泛的应用价值。
附图说明
图1为实施例1中杂种落叶松的愈伤组织照片；图2为实施例1中杂种落叶松不定芽的形成照片；图3为实施例1中杂种落叶松不定芽的伸长照片；图4为实施例1中杂种落叶松不定芽的抽茎照片；图5为实施例1中杂种落叶松不定芽的生根照片；图6为实施例1中杂种落叶松生长侧根照片。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式杂种落叶松离体培养不定芽诱导植株再生的方法，按以下步骤进行：
一、取经过预处理的杂种落叶松合子胚接种于含有2.0～2.5mg/L噻苯隆、1g/L肌醇、450mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、6.5g/L琼脂和30g/L蔗糖的BM改良培养基中，进行暗培养或光照培养至出现愈伤组织；
二、将愈伤组织接种于含有2.0～2.5mg/L噻苯隆的BM改良培养基中，在光照强度为33～36μmol·m-2·s-1，温度为23～25℃的环境中进行光照培养，至长出不定芽；
三、将带有不定芽的愈伤组织切成块转入含有0.1～1.0mg/L TDZ和0～0.04mg/LNAA的BM改良培养基中培养，在光照强度为32～38μmol·m-2·s-1，温度为22～24℃的环境中进行光照培养，3周之后继代培养一次，进行不定芽伸长，当不定芽伸长至2～3cm，将其转入含有0.05～1.0mg/L6-BA和0.05～1.0mg/LNAA的BM改良培养基中培养，进行不定芽的抽茎；
四、将抽茎的不定芽转入含有0.5mg/L IBA和1.0mg/L NAA的1/2BM改良培养基，控制培养基中蔗糖浓度为20g·L-1，在光照强度为32～38μmol·m-2·s-1，温度为22～24℃的环境中，进行光照培养以实现不定芽的生根。
本发明以杂种落叶松成熟胚为外植体进行不定芽诱导，获得诱导率较高的不定芽，不定芽诱导率为87.73％，对于杂种落叶松离体培养而言是一突破，而且愈伤组织生长较好且诱导率高于90％，这对于杂种落叶松的大量扩繁和基因工程育种研究具有广泛的应用价值。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一所述杂种落叶松为日本落叶松×兴安落叶松。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中所述经过预处理的杂种落叶松合子胚的获得方法：将成熟、饱满的杂种落叶松种子剥去种皮，用流水冲洗2天；然后在超净台中将去种皮的种子用质量浓度为70％的酒精消毒1分钟，用无菌水冲洗3次，再将种子转入质量浓度为4％的次氯酸钠溶液中，并加入2～4滴吐温20震荡消毒15分钟，之后再用无菌水清洗6次，再将胚乳剥去用0.5％次氯酸钠消毒2min，用无菌水清洗胚3次，即得到经过预处理的杂种落叶松合子胚。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一所述暗培养的条件为：温度为22～24℃。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤一所述光照培养的条件为：光照强度为32～38μmol·m-2·s-1，温度为22～24℃。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤三中转入含有0.2～0.8mg/L6-BA和0.2～0.8mg/LNAA的BM改良培养基。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤三中转入含有0.4～0.6mg/L6-BA和0.4～0.6mg/LNAA的BM改良培养基。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤三中转入含有0.05mg/L6-BA和0.2mg/LNAA的BM改良培养基。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤一、二和三中所述BM改良培养基包含以下成分：NH4NO3 200.0mg·L-1、KNO3 909.9mg·L-1、KH2PO4136.1mg·L-1、Ca(NO3)2·4H2O 236.2mg·L-1、Mg(NO3)2·6H2O 256.5mg·L-1、MgCl2·6H2O 101.7mg·L-1、MgSO4·7H2O 246mg·L-1、KI 4.15mg·L-1、H3BO3 15.5mg·L-1、MnSO4·4H2O 10.5mg·L-1、ZnSO4·7H2O 14.688mg·L-1、Na2MoO4·2H2O 0.125mg·L-1、CuSO4·5H2O0.1725mg·L-1、CoCl2·6H2O 0.125mg·L-1、FeSO4·7H2O2.78mg·L-1、Na2EDTA 3.73mg·L-1、肌醇1000mg·L-1、维生素B1 1.0mg·L-1、维生素B6 1.0mg·L-1、烟酸0.5mg·L-1、甘氨酸2.0mg·L-1和蒸馏水。其它与具体实施方式一至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤四所述1/2BM改良培养基包含以下成分：NH4NO3 100.0mg·L-1、KNO3 454.95mg·L-1、KH2PO468.05mg·L-1、Ca(NO3)2·4H2O118.1mg·L-1、Mg(NO3)2·6H2O 128.25mg·L-1、MgCl2·6H2O 50.85mg·L-1、MgSO4·7H2O 123mg·L-1、KI 4.15mg·L-1、H3BO3 15.5mg·L-1、MnSO4·4H2O 10.5mg·L-1、ZnSO4·7H2O 14.688mg·L-1、Na2MoO4·2H2O 0.125mg·L-1、CuSO4·5H2O0.1725mg·L-1、CoCl2·6H2O 0.125mg·L-1、FeSO4·7H2O2.78mg·L-1、Na2EDTA 3.73mg·L-1、Inositol 1000mg·L-1、Vitamin B1 1.0mg·L-1、Vitamin B6 1.0mg·L-1、Nicotinicacid 0.5mg·L-1、Glycine 2.0mg·L-1。。其它与具体实施方式一至九之一相同。
为验证本发明的有益效果，进行以下实验：
实施例1：
本实施例杂种落叶松离体培养不定芽诱导植株再生的方法，按以下步骤进行：
一、取经过预处理的杂种落叶松合子胚接种于含有2.0mg/L噻苯隆(TDZ)、1g/L肌醇、450mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、6.5g/L琼脂和30g/L蔗糖的BM改良培养基中，在光照强度为36μmol·m-2·s-1，温度为23℃的条件下进行光照培养至出现愈伤组织；
步骤一中所述经过预处理的杂种落叶松合子胚的获得方法：将成熟、饱满的杂种落叶松种子剥去种皮，用流水冲洗2天；然后在超净台中将去种皮的种子用质量浓度为70％的酒精消毒1分钟，用无菌水冲洗3次，再将种子转入质量浓度为4％的次氯酸钠溶液中，并加入2～4滴吐温20震荡消毒15分钟，之后再用无菌水清洗6次，再将胚乳剥去用0.5％次氯酸钠消毒2min，用无菌水清洗胚3次，即得到经过预处理的杂种落叶松合子胚。
二、将愈伤组织接种于含有2.0mg/L噻苯隆(TDZ)的BM改良培养基中，在光照强度为36μmol·m-2·s-1，温度为23℃的环境中进行光照培养，至长出不定芽；
三、将带有不定芽的愈伤组织切成块转入含有0.5mg/L TDZ的BM改良培养基中培养，在光照强度为36μmol·m-2·s-1，温度为23℃的环境中进行光照培养，3周之后继代培养一次，进行不定芽伸长，当不定芽伸长至2cm，将其转入含有0.05mg/L6-BA和0.2mg/LNAA的BM改良培养基中培养，进行不定芽的抽茎；
四、将抽茎的不定芽转入含有0.5mg/L IBA+1.0mg/L NAA的1/2BM改良培养基，控制培养基中蔗糖浓度为20g·L-1，在光照强度为36μmol·m-2·s-1，温度为23℃的环境中，进行光照培养以实现不定芽的生根。
步骤一所述杂种落叶松为日本落叶松11×兴安落叶松2。
所述BM改良培养基包含以下成分：NH4NO3 200.0mg·L-1、KNO3 909.9mg·L-1、KH2PO4136.1mg·L-1、Ca(NO3)2·4H2O 236.2mg·L-1、Mg(NO3)2·6H2O 256.5mg·L-1、MgCl2·6H2O 101.7mg·L-1、MgSO4·7H2O 246mg·L-1、KI 4.15mg·L-1、H3BO3 15.5mg·L-1、MnSO4·4H2O 10.5mg·L-1、ZnSO4·7H2O 14.688mg·L-1、Na2MoO4·2H2O 0.125mg·L-1、CuSO4·5H2O0.1725mg·L-1、CoCl2·6H2O 0.125mg·L-1、FeSO4·7H2O2.78mg·L-1、Na2EDTA 3.73mg·L-1、肌醇1000mg·L-1、维生素B1 1.0mg·L-1、维生素B6 1.0mg·L-1、烟酸0.5mg·L-1、甘氨酸2.0mg·L-1和蒸馏水。
步骤四所述1/2BM改良培养基包含以下成分：NH4NO3 100.0mg·L-1、KNO3454.95mg·L-1、KH2PO468.05mg·L-1、Ca(NO3)2·4H2O118.1mg·L-1、Mg(NO3)2·6H2O128.25mg·L-1、MgCl2·6H2O 50.85mg·L-1、MgSO4·7H2O 123mg·L-1、KI 4.15mg·L-1、H3BO315.5mg·L-1、MnSO4·4H2O 10.5mg·L-1、ZnSO4·7H2O 14.688mg·L-1、Na2MoO4·2H2O0.125mg·L-1、CuSO4·5H2O 0.1725mg·L-1、CoCl2·6H2O 0.125mg·L-1、FeSO4·7H2O2.78mg·L-1、Na2EDTA 3.73mg·L-1、Inositol 1000mg·L-1、Vitamin B1 1.0mg·L-1、Vitamin B6 1.0mg·L-1、Nicotinic acid 0.5mg·L-1、Glycine 2.0mg·L-1。
本实施例是方法中愈伤组织诱导率较高，为90.5％，愈伤组织呈紫红色、绿色、黄绿色，疏松或紧实，生长较快，愈伤组织照片如图1所示。
愈伤组织表面有绿色的、颗粒状芽原基产生，且不定芽的诱导率为87.73％，不定芽增殖系数的均值为4.48，生长旺盛，芽点大，呈嫩绿色，不定芽形成的照片如图2所示。
不定芽的伸长效果佳，伸长比率为205.72％，不定芽伸长的照片如图3所示。
本实施例的不定芽抽茎率为75.96％，不定芽抽茎照片如图4所示。不定芽生根的诱导率为45％，诱导形成的不定根数为2～4条，如图5所示，最长的不定根达4.0-5.0cm左右。再培养3周左右，不定根上长出许多侧根，如图6所示，这些侧根长达10cm以上，短达2cm左右。
上述实验由以下课题支持，国家高技术研究发展计划(863计划)“白桦、落叶松转基因育种技术研究”(2013AA102704)。
Claims (8)
1.杂种落叶松离体培养不定芽诱导植株再生的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、取经过预处理的杂种落叶松合子胚接种于BM改良培养基+2.0～2.5mg/L噻苯隆+1g/L肌醇+450mg/L谷氨酰胺+500mg/L水解酪蛋白+6.5g/L琼脂+30g/L蔗糖的培养基中，进行暗培养或光照培养至出现愈伤组织；
二、将愈伤组织接种于BM改良培养基+2.0～2.5mg/L噻苯隆的培养基中，在光照强度为33～36μmol·m-2·s-1，温度为23～25℃的环境中进行光照培养，至长出不定芽；
三、将带有不定芽的愈伤组织切成块转入BM改良培养基+0.1～1.0mg/LTDZ+0～0.04mg/L NAA的培养基中培养，在光照强度为32～38μmol·m-2·s-1，温度为22～24℃的环境中进行光照培养，3周之后继代培养一次，进行不定芽伸长，当不定芽伸长至2～3cm，将其转入BM改良培养基+0.05～1.0mg/L6-BA+0.05～1.0mg/LNAA的培养基中培养，进行不定芽的抽茎；
四、将抽茎的不定芽转入1/2BM改良培养基+0.5mg/L IBA+1.0mg/L NAA的培养基，控制培养基中蔗糖浓度为20g·L-1，在光照强度为32～38μmol·m-2·s-1，温度为22～24℃的环境中，进行光照培养以实现不定芽的生根；
所述BM改良培养基的组成为：NH4NO3 200.0mg·L-1、KNO3 909.9mg·L-1、KH2PO4136.1mg·L-1、Ca(NO3)2·4H2O 236.2mg·L-1、Mg(NO3)2·6H2O 256.5mg·L-1、MgCl2·6H2O101.7mg·L-1、MgSO4·7H2O 246mg·L-1、KI 4.15mg·L-1、H3BO3 15.5mg·L-1、MnSO4·4H2O10.5mg·L-1、ZnSO4·7H2O 14.688mg·L-1、Na2MoO4·2H2O 0.125mg·L-1、CuSO4·5H2O0.1725mg·L-1、CoCl2·6H2O 0.125mg·L-1、FeSO4·7H2O 2.78mg·L-1、Na2EDTA 3.73mg·L-1、肌醇1000mg·L-1、维生素B1 1.0mg·L-1、维生素B6 1.0mg·L-1、烟酸0.5mg·L-1、甘氨酸2.0mg·L-1和蒸馏水；
步骤四所述1/2BM改良培养基的组成为：NH4NO3 100.0mg·L-1、KNO3 454.95mg·L-1、KH2PO4 68.05mg·L-1、Ca(NO3)2·4H2O 118.1mg·L-1、Mg(NO3)2·6H2O 128.25mg·L-1、MgCl2·6H2O 50.85mg·L-1、MgSO4·7H2O 123mg·L-1、KI 4.15mg·L-1、H3BO3 15.5mg·L-1、MnSO4·4H2O 10.5mg·L-1、ZnSO4·7H2O 14.688mg·L-1、Na2MoO4·2H2O 0.125mg·L-1、CuSO4·5H2O 0.1725mg·L-1、CoCl2·6H2O 0.125mg·L-1、FeSO4·7H2O 2.78mg·L-1、Na2EDTA 3.73mg·L-1、肌醇1000mg·L-1、维生素B1 1.0mg·L-1、维生素B6 1.0mg·L-1、烟酸0.5mg·L-1和甘氨酸2.0mg·L-1。
2.根据权利要求1所述的杂种落叶松离体培养不定芽诱导植株再生的方法，其特征在于步骤一所述杂种落叶松为日本落叶松×兴安落叶松。
3.根据权利要求1或2所述的杂种落叶松离体培养不定芽诱导植株再生的方法，其特征在于步骤一中所述经过预处理的杂种落叶松合子胚的获得方法：将成熟、饱满的杂种落叶松种子剥去种皮，用流水冲洗2天；然后在超净台中将去种皮的种子用质量浓度为70％的酒精消毒1分钟，用无菌水冲洗3次，再将种子转入质量浓度为4％的次氯酸钠溶液中，并加入2～4滴吐温20震荡消毒15分钟，之后再用无菌水清洗6次，再将胚乳剥去用0.5％次氯酸钠消毒2min，用无菌水清洗胚3次，即得到经过预处理的杂种落叶松合子胚。
4.根据权利要求3所述的杂种落叶松离体培养不定芽诱导植株再生的方法，其特征在于步骤一所述暗培养的条件为：温度为22～24℃。
5.根据权利要求3所述的杂种落叶松离体培养不定芽诱导植株再生的方法，其特征在于步骤一所述光照培养的条件为：光照强度为32～38μmol·m-2·s-1，温度为22～24℃。
6.根据权利要求5所述的杂种落叶松离体培养不定芽诱导植株再生的方法，其特征在于步骤三中转入BM改良培养基+0.2～0.8mg/L6-BA+0.2～0.8mg/LNAA的培养基，进行不定芽的抽茎。
7.根据权利要求5所述的杂种落叶松离体培养不定芽诱导植株再生的方法，其特征在于步骤三中转入BM改良培养基+0.4～0.6mg/L6-BA+0.4～0.6mg/LNAA的培养基，进行不定芽的抽茎。
8.根据权利要求5所述的杂种落叶松离体培养不定芽诱导植株再生的方法，其特征在于步骤三中转入BM改良培养基+0.05mg/L6-BA+0.2mg/LNAA的培养基，进行不定芽的抽茎。
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