CN101218895B - 一种长白落叶松离体培养不定芽诱导植株再生的方法 - Google Patents
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Abstract
一种长白落叶松离体培养不定芽诱导植株再生的方法，它涉及一种松树离体培养不定芽诱导植株再生的方法。它解决了长白落叶松组织培养器官发生困难、植株再生率低，及目前用长白落叶松的成熟胚、花芽和腋芽、幼嫩茎段作为外植体不定芽诱导率低的问题。方法：一、合子胚培养诱导愈伤组织；二、诱导生长不定芽；三、继续培养并诱导生根，即得到长白落叶松离体再生植株。本发明以长白落叶松成熟种子为外植体进行不定芽诱导，获得了高诱导率的不定芽，比目前已有不定芽诱导技术提高9倍以上，而且愈伤组织诱导率均高于90％，对于长白落叶松的大量扩繁和基因工程育种研究具有广泛的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种松树离体培养不定芽诱导植株再生的方法。
背景技术
长白落叶松(Larix olgensis)主要分布于我国长白山、老爷岭及毗邻的朝鲜北部与俄罗斯远东地区，大量用于建筑业、装潢业、造纸业，是我国东北地区的重要用材树种之一。长白落叶松生长周期长，采用常规育种技术进行新品种选育时间长、见效慢，同时人工繁育还存在基因源缺乏和杂交不亲和等制约因素。通过转基因方法将目的基因直接导入受体系统并进行表达，可极大地缩短其育种周期，但建立高效的组织培养再生系统是转基因的前提条件之一。长白落叶松组织器官发生困难、植株再生率低，严重的限制了长白落叶松快速生长。目前只有吴克贤等用长白落叶松的成熟胚、花芽和腋芽、幼嫩茎段作为外植体诱导出不定芽(长白落叶松组织培养的研究，吴克贤、李伟、徐妙珍，林业科学，1996，32(2)：125-132)，但不定芽诱导诱导率均较低，最高只有8.16％，难以应用于实际生产与实践。
发明内容
本发明的目的是为了解决长白落叶松组织培养器官发生困难、植株再生率低，及目前用长白落叶松的成熟胚、花芽和腋芽、幼嫩茎段作为外植体不定芽诱导率低的问题，而提供的一种长白落叶松离体培养不定芽诱导植株再生的方法。
长白落叶松离体培养不定芽诱导植株再生的方法按以下步骤实现：一、取经过预处理的长白落叶松合子胚接种于额外添加6-苄基氨基嘌呤、肌醇、谷氨酰胺、水解酪蛋白、琼脂和蔗糖的BM培养基中，在温度为24±1℃的环境中进行暗培养或光照培养至出现愈伤组织；二、将愈伤组织置于温度为24±1℃的环境中进行光照培养，至长出不定芽；三、将带有不定芽的愈伤组织切成块放入额外添加活性碳和赤霉素的BM培养基中进行光照培养，4周之后继代培养一次，诱导生根，即得到长白落叶松离体再生植株；步骤一、二和三中光照培养都在30～40μmol/m2·s的条件下进行；步骤一BM培养基中6-苄基氨基嘌呤的浓度为1.0～4.0mg/L、肌醇的浓度为1g/L、谷氨酰胺的浓度为1g/L、水解酪蛋白的浓度为500mg/L、琼脂的浓度为6g/L、蔗糖的浓度为30g/L；步骤二中愈伤组织所用培养基与步骤一所用培养基相同；步骤三BM培养基中活性碳的加入量为BM培养基质量的1％、赤霉素的浓度为1.0mg/L。
本发明以长白落叶松成熟种子为外植体进行不定芽诱导，获得了高诱导率的不定芽，比目前已有不定芽诱导技术提高9倍以上，而且愈伤组织诱导率均高于90％，对于长白落叶松的大量扩繁和基因工程育种研究具有广泛的应用价值。
本发明通过调控机制建立了高效、稳定的长白落叶松不定芽诱导方法，利用本发明方法可实现长白落叶松苗木的大规模、短周期、高繁殖率工厂化生产；而且本发明还可作为基因工程的桥梁，缩短育种周期，解决长白落叶松育种周期长的问题，大幅度缩短林木育种与繁殖周期，为该树种的基因工程改良工作奠定基础。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式长白落叶松离体培养不定芽诱导植株再生的方法按以下步骤实现：一、取经过预处理的长白落叶松合子胚接种于额外添加6-苄基氨基嘌呤(BA)、肌醇、谷氨酰胺、水解酪蛋白、琼脂和蔗糖的BM培养基中，在温度为24±1℃的环境中进行暗培养或光照培养至出现愈伤组织；二、将愈伤组织置于温度为24±1℃的环境中进行光照培养，至长出不定芽；三、将带有不定芽的愈伤组织切成块放入额外添加活性碳和赤霉素(GA3)的BM培养基中进行光照培养，4周之后继代培养一次，诱导生根，即得到长白落叶松离体再生植株；步骤一、二和三中光照培养都在30～40μmol/m2·s的条件下进行；步骤一BM培养基中6-苄基氨基嘌呤的浓度为1.0～4.0mg/L、肌醇的浓度为1g/L、谷氨酰胺的浓度为1g/L、水解酪蛋白的浓度为500mg/L、琼脂的浓度为6g/L、蔗糖的浓度为30g/L；步骤二中愈伤组织所用培养基与步骤一所用培养基相同；步骤三BM培养基中活性碳的加入量为BM培养基质量的1％、赤霉素的浓度为1.0mg/L。
本实施方式步骤一BM培养基中的谷氨酰胺经过滤灭菌后在培养基温度降至50℃以下加入，并用NaOH和HCl调节步骤一BM培养基pH植至5.8。
本实施方式成熟的长白落叶松种子可放于4℃冰箱中保存。
本实施方式步骤一中将选择成熟、饱满的长白落叶松种子剥去种皮，用流水冲洗3天；然后在超净台中将去种皮的种子用质量浓度为70％的酒精消毒1分钟，再将酒精消毒过的种子转入质量浓度为1％的次氯酸钠溶液中，并加入2～4滴吐温20震荡消毒50分钟，之后再用无菌水清洗3次，再剥去胚乳将合子胚放入质量浓度为0.5％的次氯酸钠中浸泡2秒，即得到经过预处理的长白落叶松合子胚。
本实施方式步骤一预处理长白落叶松合子胚的过程中，污染率随次氯酸钠消毒时间的延长而降低，但是长时间次氯酸钠消毒也会增加对外植体的伤害，从而影响组织培养的整体效果(长白落叶松合子胚的存活率随消毒时间和次氯酸钠浸泡时间的延长而降低)。次氯酸钠消毒浓度、消毒时间与浸泡时间对长白落叶松合子胚的污染率和存活率的试验数据如表1所示(步骤一暗培养或光照培养1周后统计污染率，3周后统计胚的存活率)。
表1
| 次氯酸钠消毒浓度 | 次氯酸钠消毒时间 | 浸泡时间 | 污染率 | 存活率 |
| 1％ | 50(min) | 2s | 0 | 79.6％ |
| 1％ | 80(min) | 2s | 0 | 5.2％ |
| 2％ | 20(min) | 2s | 9.1％ | 72.7％ |
| 2％ | 50(min) | 1min | 0.5％ | 11.9％ |
| 2％ | 50(min) | 2s | 0 | 78.8％ |
| 2％ | 50(min) | 0 | 91.1％ | 8.9％ |
实验数据说明选用质量浓度为1％或2％的次氯酸钠消毒效果差异并不明显，综合考虑认为本实施方式用1％次氯酸钠消毒50分钟后再将胚在0.5％次氯酸钠中浸泡2秒为最佳的消毒方法。
本实施方式在光照培养条件下外植体(长白落叶松合子胚)在接种一周后开始膨大，子叶变绿，胚根部变为紫红色，逐渐脱分化形成愈伤组织；3～4周时一部分外植体子叶和子叶基部直接形成针叶和芽体，芽体继代培养后分化形成丛生芽；大约5周后在愈伤组织表面产生圆颗粒突起，并形成针叶，将愈伤组织继代后分化成不定芽。
本实施方式在暗培养条件下外植体(长白落叶松合子胚)接种一周后子叶脱分化为黄绿色或黄白色愈伤组织，胚根部变为白色愈伤组织，较光照条件下增殖快；3～4周时很少量外植体子叶基部形成针叶和芽体，且为黄绿色，一部分愈伤组织开始褐化；将愈伤组织在原培养基上继代并移至光照条件下，愈伤组织颜色变深变绿，约10天后在愈伤组织表面产生圆颗粒突起，继代后分化成不定芽。
本实施方式每个外植体(长白落叶松合子胚)形成较多(十几个至几十个不等)的不定芽。本实施方式试验证明暗培养条件下培养的愈伤组织生长速度快。
在不加入活性碳的步骤三BM培养基中培养3周后不定芽平均伸长0.29cm，在本实施方式步骤三BM培养基中培养3周后不定芽平均伸长0.39cm，表明活性碳对不定芽的伸长具有促进作用。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤一BM培养基中还加入萘乙酸(NAA)，培养基中萘乙酸的浓度为0.1～0.5mg/L。其它步骤及参数与实施方式一相同。
各种培养条件对愈伤组织诱导的效果(步骤二光照培养4周后进行统计)如表2所示。
表2
| 培养条件 | 激素组合(包括浓度mg/L) | 愈伤组织诱导率 | 愈伤组织生长状况 |
| 光照培养 | BA(1.0mg/L) | 96.8％ | 愈伤组紫红色、绿色、质地硬、疏松、生长快 |
| 光照培养 | BA(1.0mg/L)+NAA(0.1mg/L) | 98.3％ | 愈伤组紫红色、绿色、质地硬、疏松、生长快 |
| 光照培养 | BA(1.0mg/L)+NAA(0.5mg/L) | 100％ | 愈伤组紫红色、绿色、质地硬、疏松、生长快 |
| 光照培养 | BA(1.0mg/L)+NAA(0.8mg/L) | 97.5％ | 愈伤组浅紫红色、浅绿色、质地硬、致密、生长慢 |
| 光照培养 | BA(4.0mg/L) | 97.5％ | 愈伤组紫红色、绿色、质地硬、疏松、生长快 |
| 光照培养 | BA(4.0mg/L)+NAA(0.1mg/L) | 100％ | 愈伤组紫红色、绿色、质地硬、疏松、生长快 |
| 光照培养 | BA(4.0mg/L)+NAA(0.5mg/L) | 100％ | 愈伤组紫红色、绿色、质地硬、疏松、生长快 |
| 光照培养 | BA(4.0mg/L)+NAA(0.8mg/L) | 100％ | 愈伤组浅紫红色、浅绿色、质地硬、致密、生长慢 |
| 暗培养 | BA(1.0mg/L) | 100％ | 愈伤组黄绿色或黄白色、质地软、疏松、生长较快 |
| 暗培养 | BA(1.0mg/L)+NAA(0.1mg/L) | 100％ | 愈伤组黄绿色或黄白色、质地软、疏松、生长较快 |
| 暗培养 | BA(1.0mg/L)+NAA(0.5mg/L) | 90.0％ | 愈伤组黄绿色或黄白色、质地软、疏松、生长较快 |
| 暗培养 | BA(1.0mg/L)+NAA(0.8mg/L) | 98.8％ | 愈伤组黄绿色或黄白色、质地硬、致密、生长较快 |
| 暗培养 | BA(4.0mg/L) | 100％ | 愈伤组黄绿色或黄白色、质地软、疏松、生长较快 |
| 暗培养 | BA(4.0mg/L)+NAA(0.1mg/L) | 100％ | 愈伤组黄绿色或黄白色、质地软、疏松、生长较快 |
| 暗培养 | BA(4.0mg/L)+NAA(0.5mg/L) | 100％ | 愈伤组黄绿色或黄白色、质地软、疏松、生长较快 |
| 暗培养 | BA(4.0mg/L)+NAA(0.8mg/L) | 100％ | 愈伤组黄绿色或黄白色、质地硬、致密、生长较快 |
各种条件对不定芽的诱导率(步骤三光照培养3周后进行统计)如表3所示。
表3
| 愈伤组织来源 | 激素组合(包括浓度mg/L) | 不定芽诱导率 |
| 暗培养 | BA(1.0mg/L) | 73.8％ |
| 暗培养 | BA(1.0mg/L)+NAA(0.1mg/L) | 45.0％ |
| 暗培养 | BA(1.0mg/L)+NAA(0.5mg/L) | 30.0％ |
| 暗培养 | BA(1.0mg/L)+NAA(0.8mg/L) | 0％ |
| 暗培养 | BA(4.0mg/L) | 6.7％ |
| 暗培养 | BA(4.0mg/L)+NAA(0.1mg/L) | 11.7％ |
| 暗培养 | BA(4.0mg/L)+NAA(0.5mg/L) | 8.3％ |
| 暗培养 | BA(4.0mg/L)+NAA(0.8mg/L) | 0％ |
| 光照培养 | BA(1.0mg/L) | 36.7％ |
| 光照培养 | BA(1.0mg/L)+NAA(0.1mg/L) | 23.3％ |
| 光照培养 | BA(1.0mg/L)+NAA(0.5mg/L) | 16.7％ |
| 光照培养 | BA(1.0mg/L)+NAA(0.8mg/L) | 0％ |
| 光照培养 | BA(4.0mg/L) | 17.5％ |
| 光照培养 | BA(4.0mg/L)+NAA(0.1mg/L) | 13.3％ |
| 光照培养 | BA(4.0mg/L)+NAA(0.5mg/L) | 16.7％ |
| 光照培养 | BA(4.0mg/L)+NAA(0.8mg/L) | 0％ |
表3试验数据说明萘乙酸(NAA)对不定芽的分化具有抑制作用，而且随着萘乙酸(NAA)浓度的增加不定芽的诱导率不断降低。
Claims (3)
1.一种长白落叶松离体培养不定芽诱导植株再生的方法，其特征在于长白落叶松离体培养不定芽诱导植株再生的方法按以下步骤实现：一、取经过预处理的长白落叶松合子胚接种于额外添加6-苄基氨基嘌呤、肌醇、谷氨酰胺、水解酪蛋白、琼脂和蔗糖的BM培养基中，在温度为24+1℃的环境中进行暗培养或光照培养至出现愈伤组织；二、将愈伤组织置于温度为24±1℃的环境中进行光照培养，至长出不定芽；三、将带有不定芽的愈伤组织切成块放入额外添加活性碳和赤霉素的BM培养基中进行光照培养，4周之后继代培养一次，诱导生根，即得到长白落叶松离体再生植株；步骤一、二和三中光照培养都在30～40μmol/m2·s的条件下进行；步骤一BM培养基中6-苄基氨基嘌呤的浓度为1.0～4.0mg/L、肌醇的浓度为1g/L、谷氨酰胺的浓度为1g/L、水解酪蛋白的浓度为500mg/L、琼脂的浓度为6g/L、蔗糖的浓度为30g/L；步骤二中愈伤组织所用培养基与步骤一所用培养基相同；步骤三BM培养基中活性碳的加入量为BM培养基质量的1％、赤霉素的浓度为1.0mg/L。
2.根据权利要求1所述的一种长白落叶松离体培养不定芽诱导植株再生的方法，其特征在于步骤一BM培养基中还加入萘乙酸，培养基中萘乙酸的浓度为0.1～0.5mg/L。
3.根据权利要求1所述的一种长白落叶松离体培养不定芽诱导植株再生的方法，其特征在于步骤一中将选择成熟、饱满的长白落叶松种子剥去种皮，用流水冲洗3天；然后在超净台中将去种皮的种子用质量浓度为70％的酒精消毒1分钟，再将酒精消毒过的种子转入质量浓度为1％的次氯酸钠溶液中，并加入2～4滴吐温20震荡消毒50分钟，之后再用无菌水清洗3次，再剥去胚乳将合子胚放入质量浓度为0.5％的次氯酸钠中浸泡2秒，即得到经过预处理的长白落叶松合子胚。
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