CN110558234A - 一种基于带叶茎段的楸胚性愈伤组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于带叶茎段的楸胚性愈伤培养方法。本方法是将组培条件下生长30天的楸种子苗的茎切成2‑3 cm带叶茎段，插入愈伤诱导培养基中获得愈伤组织，将诱导出的愈伤组织转置于胚性愈伤诱导培养基中诱导出胚性愈伤组织，最后将诱导出的胚性愈伤组织转置于增殖培养基中增殖。本发明为楸树培育优质、抗性新品种及基因功能验证提供了重要的技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物工程技术的方法，尤其涉及一种植物组织培养技术，具体为楸胚性愈伤组织的诱导发生。
背景技术
楸（Catalpa bungei）是紫葳科（Bignoniaceae）梓属（Catalpa Scop.）的珍贵树种。楸的树体高大，树冠浓密，枝、叶、花都具有很高的观赏价值；木材质地坚韧，耐腐、耐磨、隔潮、不易虫蛀，具有极高的经济价值。然而，近年来楸病虫害比较严重，限制了其大面积推广。因此，提高楸的抗病虫性，培育抗病虫优质楸树新品种是目前迫切需要解决的主要问题。
传统的楸遗传改良主要是通过杂交育种的方式进行，但常规育种周期漫长，品种改良受到限制。利用现代分子生物学和基因工程技术，将目标基因整合到楸基因组中，获得相应的性状，快速、高效、目的性强，极大加快了育种的速度、提高了育种的效率，是解决楸抗病虫新品种培育的有效途径。高频率的再生系统是遗传转化体系的关键技术。
胚性愈伤组织具有再生能力强、保存期长及可周年遗传转化的优点，是进行遗传转化的最佳途径。目前，有关楸树组织培养技术的研究开展较多，但是，关于楸树胚性愈伤组织诱导的研究并不多见。陈发菊等人的中国发明专利CN105010143A“一种楸树的体外培养方法”以灭菌的楸树未成熟的子叶胚为外植体进行胚性愈伤组织的的诱导；王鹏等人的中国发明专利CN104041418A “一种诱导楸树体细胞胚发生的方法”和李冰等人的中国发明专利CN106818470A “一种提高楸树增殖系数的组织培养方法”，均以楸树成熟种子为外植体诱导胚性愈伤组织发生。本发明以楸带叶茎段为外植体进行胚性愈伤组织的诱导，建立稳定高频率发生的楸体细胞胚胎再生体系，为楸的遗传转化、基因工程育种、基因功能验证、种质资源保存、快速繁殖等提供良好的实验平台，具有十分重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种基于带叶茎段的楸胚性愈伤组织培养方法，为楸树培育优质多抗新品种提供一个成熟的再生体系。
为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案如下：
（1）楸组培种子苗的培育
将楸品系Q301的成熟种子用纱布包好，自来水冲洗30 min，75%酒精灭菌60 s，无菌水冲洗2次，再浸泡于0.1%氯化汞溶液18 min，无菌水冲洗5次后，将种子两端边缘种皮剪破接种于MS + 蔗糖30 g/L+ 琼脂3 g/L的种子苗培养基，25-28 ℃，光强1500 lx，12 h/d的光下培养；
（2）基于带叶茎段的愈伤组织的诱导
种子苗培养30 d后，将其茎切成2-3 cm带叶茎段，插入WPM + NAA 0.1 mg/L + 蔗糖30g/L+ 琼脂3 g/L的愈伤诱导培养基，25-28 ℃，光强1500 lx，12 h/d的光下培养，诱导愈伤组织；
（3）胚性愈伤组织的诱导
将诱导出的愈伤组织转置于DKW + 6-BA 0.6 mg/L + NAA 0.15 mg/L+ ZT 0.2 mg/L+ 蔗糖30 g/L+ 琼脂3 g/L的胚性愈伤诱导培养基中，25-28 ℃，光强1500 lx，12 h/d的光下培养，每隔30 d继代一次，直至诱导出胚性愈伤组织；
（4）胚性愈伤组织的增殖
将诱导出的胚性愈伤组织转置于MS + 6-BA 0.6 mg/L + NAA 0.15 mg/L+ ZT 0.2mg/L + 蔗糖30 g/L+ 琼脂3 g/L的胚性愈伤增殖培养基，25-28℃，光强1500lx，12 h/d的光下培养，每隔30 d继代一次，使胚性愈伤组织增殖。
所述步骤(1-4)中的培养基均调节pH值到5.8-6.0。
本发明至少提供以下有益效果：
本发明是以楸带叶茎段为外植体诱导胚性愈伤组织的培养方法，胚型愈伤组织获得率为39.53%。与以楸子叶为外植体相比，具有诱导时长短，操作简单，诱导效率高的优点。本发明为转基因生产及基因功能验证提供重要的技术支撑，可用于楸树的分子遗传改良，种质资源创新，也为其他林木的胚性愈伤组织诱导发生提供试验参考依据。
附图说明
图1：楸带叶茎段插入愈伤诱导培养基。
图2：愈伤诱导培养基上诱导的愈伤组织。
图3：胚性愈伤诱导培养基上诱导的胚性愈伤组织。箭头指示体细胞胚。
图4：胚性愈伤组织增殖培养。
具体实施方式：
下述实施案例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
下述实施案例中所有培养基均调节pH值到5.8-6.0。
实施案例1
（1）楸组培种子苗的培育
将成熟楸品系Q301的种子用纱布包好，依次进行自来水冲洗30 min，75%酒精表面灭菌60 s，无菌水冲洗2次，再浸泡于0.1%氯化汞溶液18 min，无菌水冲洗5次后，将种子两端边缘种皮剪破接种于种子苗培养基，25-28℃，光强1500lx，12 h/d的光下培养。
（2）基于带叶茎段的愈伤组织的诱导
种子苗培养30 d后，将其茎切成2-3 cm带叶茎段，插入愈伤诱导培养基，25-28 ℃，光强1500 lx，12 h/d的光下培养，20天即可长出浅黄色愈伤组织。如图1、图2所示。
（3）胚性愈伤组织的诱导
将诱导出的愈伤组织转置于胚性愈伤诱导培养基中，25-28 ℃，光强1500 lx，12 h/d的光下培养，诱导胚性愈伤组织。
诱导出的胚性愈伤组织为浅黄色、紧致、表面上呈颗粒状的愈伤组织，并且带有不同类型的体细胞胚，如图3所示。
上述步骤（1）所述的种子苗培养基是MS + 蔗糖30 g/L+ 琼脂3 g/L。
上述步骤（2）所述的愈伤诱导培养基是WPM + NAA 0.10 mg/L + 蔗糖30 g/L+ 琼脂3 g/L。
上述步骤（3）所述的胚性愈伤诱导培养基是DKW + 6-BA 0.60 mg/L + NAA 0.15mg/L+ ZT 0.2 mg/L + 蔗糖30 g/L+ 琼脂3 g/L。
实施案例2-5是在实施案例1步骤(1) 楸组培种子苗的培育的基础上进行，分别为一种楸愈伤组织诱导方法，其培养方法中所涉及的步骤与实施案例1类似，不同之处仅在于其中所涉及的技术参数的差别，具体如表1所示。
表1，实施案例1-5中不同技术参数设置
实施案例6-8是在实施案例1步骤(2)基于楸带叶茎段的愈伤组织获得的基础上进行，分别为一种楸胚性愈伤组织诱导方法，其培养方法中所涉及的步骤与实施案例1类似，不同之处仅在于其中所涉及的技术参数的差别，具体如表2所示。
表2，实施案例6-8中不同技术参数设置
将实施方案1、6-8中获得的胚性愈伤组织，按照本发明“一种基于带叶茎段的楸胚性愈伤组织培养方法”的步骤（4）进行如下操作：
（4）胚性愈伤组织的增殖
将诱导出的胚性愈伤组织转置于胚性愈伤增殖培养基（MS + 6-BA 0.60 mg/L + NAA0.15 mg/L+ ZT 0.2 mg/L + 蔗糖30 g/L+ 琼脂3 g/L），25-28 ℃，光强1500 lx，12 h/d的光下培养，每隔30 d继代一次，使胚性愈伤组织增殖，如图4所示。
Claims (6)
1.一种基于带叶茎段的楸胚性愈伤组织培养方法，其特征在于，包括下列步骤：
（1）楸组培种子苗的培育
将楸品系Q301成熟的种子用纱布包好，自来水冲洗30 min，75%酒精灭菌60 s，无菌水冲洗2次，再浸泡于0.1%氯化汞溶液18 min，无菌水冲洗5次，种子两端边缘种皮剪破，接种于种子苗培养基，25-28 ℃，光强1500 lx，12 h/d的光下培养；
（2）基于带叶茎段的愈伤组织的诱导
种子苗培养30天后，将其茎切成2-3 cm带叶茎段，插入愈伤诱导培养基，25-28 ℃，光强1500 lx，12 h/d的光下培养，每隔30 d继代一次，直至诱导出愈伤组织；
（3）胚性愈伤组织的诱导
将诱导出的愈伤组织转置于胚性愈伤诱导培养基中，25-28 ℃，光强1500 lx，12 h/d的光下培养，每隔30 d继代一次，直至诱导出诱导胚性愈伤组织；
（4）胚性愈伤组织的增殖
将诱导出的胚性愈伤组织转置于胚性愈伤增殖培养基，25-28 ℃，光强1500 lx，12 h/d的光下培养，每隔30 d继代一次，使胚性愈伤组织增殖。
2.如权利要求1所述的一种基于带叶茎段的楸胚性愈伤组织培养方法，其特征在于：所有培养基均调节pH值到5.8-6.0。
3.如权利要求1所述的一种基于带叶茎段的楸胚性愈伤组织培养方法，其特征在于：种子苗培养基是MS + 蔗糖30 g/L+ 琼脂3 g/L。
4.如权利要求1所述的一种基于带叶茎段的楸胚性愈伤组织培养方法，其特征在于：愈伤诱导培养基是WPM + NAA (1-Naphthylacetic aci，萘乙酸) 0.1 mg/L + 蔗糖30 g/L+琼脂3 g/L。
5.如权利要求1所述的一种基于带叶茎段的楸胚性愈伤组织培养方法，其特征在于：胚性愈伤诱导培养基是DKW + 6-BA (6-Benzylaminopurine，6-苄氨基腺嘌呤) 0.6 mg/L +NAA 0.15 mg/L+ ZT (Zeatin，玉米素) 0.2 mg/L + 蔗糖30 g/L+ 琼脂3 g/L。
6.如权利要求1所述的一种基于带叶茎段的楸胚性愈伤组织培养方法，其特征在于：胚性愈伤增殖培养基是MS + 6-BA 0.6 mg/L + NAA 0.15 mg/L+ ZT 0.2 mg/L + 蔗糖30 g/L+ 琼脂3 g/L。
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