CN104957041B

CN104957041B - 一种利用叶柄为外植体诱导乌桕植株再生的方法

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Publication number: CN104957041B
Application number: CN201510424543.0A
Authority: CN
Inventors: 吴丽芳; 侯金艳; 毛颖基; 刘文博; 赵薇薇; 穆燕
Original assignee: Hefei Institutes of Physical Science of CAS
Current assignee: Hefei Institutes of Physical Science of CAS
Priority date: 2015-07-16
Filing date: 2015-07-16
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2035-07-16
Also published as: CN104957041A

Abstract

本发明公开了一种利用叶柄为外植体诱导乌桕植株再生的方法，属于植物生物技术领域，对野外乌桕优良株系的带腋芽的茎段进行消毒、培养，获得乌桕无菌苗；切取无菌苗的叶柄作为外植体，并接种于诱导培养基中诱导不定芽或愈伤组织；将产生不定芽或产生愈伤组织的外植体，转接于增殖培养基中分别进行增殖培养；将增殖后的愈伤组织转入分化培养基中进行愈伤组织分化；将增殖后的不定芽丛或分化成不定芽点的愈伤组织转接于不定芽伸长培养基中；待丛生芽伸长后将其转到生根培养基中进行生根培养获得健壮的乌桕再生植株。本发明不仅为后期的乌桕优良株系的快繁提供了新的技术途径，而且为通过基因工程的方法对乌桕进行遗传改良提供了支撑。

Description

一种利用叶柄为外植体诱导乌桕植株再生的方法

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种利用叶柄为外植体诱导乌桕植株再生的方法。

背景技术

随着全球经济和社会的发展，对能源的需求日益增长，而化石燃料的储存量有限，可再生能源的发展受到越来越多的关注。乌桕(Sapium sebiferium Roxb)是我国的四大木本油料之一，属于大戟科乌桕属多功能树种。其适应性强，不仅耐干早、瘠薄和耐短期积水，且是抗盐性强的乔木树种之一；它的籽实含油率高，最高可达55％，是具有很好应用前景的生物能源树种；除了用于制取生物柴油外，乌桕种子还可提制“皮油”和“清油”，前者供制高级香皂、蜡纸、蜡烛等，后者供油漆、油墨等用，具有极高的经济价值；此外，乌桕还是集观果、观叶、观型与一身的优良的园林景观树种，具有重要的观赏价值，在我国已有1400年的栽培历史。

优良品种的培育对于提高乌桕产量、改善油脂品质具有重要意义。采用传统的育种方式对乌桕进行品种改良，不仅育种过程繁琐而且育种周期长；以基因工程、组织培养等生物技术对乌桕进行品种改良可大大缩短育种周期，提高育种效率。而利用基因工程手段对植物进行品种改良，需建立在高效、稳定的植株组培再生体系的基础上。

目前有关乌桕组培再生的研究已有报道，主要集中在利用种子实生苗和幼胚为外植体对乌桕植株进行快繁，这种再生体系的建立对于多年生乌桕优良种质的保存和扩繁意义不大。另外，有关利用带腋芽的茎段对乌桕优良株系进行快繁的研究，普遍存在污染率高、褐化严重、再生效率低等问题。

专利(乌桕组培不定芽高频率植株再生的方法，公开号101057556，公开日2007-10-24)公开了以下技术方案:取乌桕种子去除种皮,双氧水表面消毒后接种到种子发芽培养基中,长出完整的乌桕种子苗植株；将乌桕种子苗的纵向一分为二的子叶块、含未展开真叶的顶芽以及下胚轴和根切段,分别接种在适合顶芽、下胚轴和根等不定芽诱导培养基上,通过直接诱导不定芽或经过愈伤组织诱导获得嫩绿色不定芽丛；然后移入不定芽伸长培养基,获得伸长不定芽幼苗；再转入幼苗扩繁培养基进行扩大繁殖,将经扩繁的幼苗转接于生根培养基上,长成真叶展开且根系发达的健壮乌桕试管植株,最后移栽到室外在自然条件生长成活,得到乌桕的健壮苗,此种方法直接诱导丛生芽，以种子实生苗为材料来源很难保持母本植株优良性状，诱导率为70-90％。

专利(一种通过幼胚胚状体发生途径诱导乌桕植株再生的方法，公开号103004594A，公开日2013-04-03)公开了以下技术方案：首先取乌桕未成熟种子，剥去果壳后，在无菌操作台内进行表面消毒；然后剪开种壳取出未成熟合子胚，用镊子进行部分损伤后，接种于胚状体诱导培养基中，经过2个月左右黑暗培养，获得2种经不同发育途径产生的胚状体；将两种胚状体接种在相应的诱导培养基中进行继代和增殖培养；然后转至成苗培养基上诱导成苗；培养20-30d左右，待幼苗长成2-4片叶子时，进行炼苗移栽，获得健壮的乌桕再生苗，此种方法直接形成胚状体，幼胚为杂合体，作为材料来源很难保持母本植株优良性状，不利于后期的快繁研究，诱导率为90％。

专利(一种乌桕叶盘高效再生的方法，公开号104012416A，公开日2014-09-03)用优良乌桕株系离体无菌苗叶片为外植体，通过直接诱导丛生芽发生来获得乌桕再生植株，在此基础上一方面可以对乌桕优良株系进行快繁，另一方面也可利用分子生物学手段对相对优良的乌桕株系进行遗传改良；但由于叶片较薄，较嫩，在进行基因工程操作(农杆菌浸染或基因枪轰击)过程中容易受到机械损伤，影响转化效果。

叶柄相对于叶片而言耐受机械损伤能力较强，适于进行遗传转化研究，而目前尚无有关以乌桕叶柄为外植体建立乌桕再生体系的研究，上述报道和建立的乌桕再生体系并不适于叶柄的组培再生。本发明公开一种以野外优良单株为材料来源的叶柄直接和间接再生体系，为乌桕优良株系的快繁和遗传改良奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，运用植物组织培养技术，提供一种利用叶柄为外植体诱导乌桕植株再生的方法。该方法利用野外乌桕优良株系组培苗的叶柄为外植体，通过直接诱导不定芽和间接诱导愈伤组织两条途径建立乌桕高效再生体系，不仅为后期的乌桕优良株系的快繁提供了新的技术途径，而且为通过基因工程的方法对乌桕进行遗传改良提供了支撑。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种利用叶柄为外植体诱导乌桕植株再生的方法，包括以下步骤：

(1)对野外乌桕优良株系的带腋芽的茎段进行消毒、培养，获得乌桕无菌苗；

(2)切取步骤(1)中所获得的无菌苗的叶柄作为外植体，并接种于诱导培养基中诱导不定芽或愈伤组织；其中，无菌苗的叶柄在接种于诱导培养基前切成0.3～0.6cm大小的切段；愈伤组织的诱导培养基为：MS+0.2～2.0mg/L NAA+0.2～1.0mg/L 6-BA+0.01～0.1mg/L IAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂，pH＝5.8；

(3)将步骤(2)中产生不定芽或产生愈伤组织的外植体，转接于增殖培养基中分别进行不定芽和愈伤组织的增殖培养；其中，不定芽的增殖培养基为：MS+0.2～2.0mg/L 6-BA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂，pH＝5.8；愈伤组织的增殖培养基为：MS+1.0～3.0mg/L NAA+0.2～1.0mg/L 6-BA+0.01～0.2mg/L IAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂，pH＝5.8；

(4)将步骤(3)中增殖后的愈伤组织转入分化培养基中进行愈伤组织分化；其中，愈伤组织的分化培养基为：MS+0.5～2.0mg/L 6-BA+0.01～0.2mg/L IBA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂，pH＝5.8；

(5)将步骤(3)中增殖后的不定芽丛或步骤(4)中分化成不定芽点的愈伤组织转接于不定芽的伸长培养基中，进行不定芽的伸长；其中，不定芽的伸长培养基为：MS+0.2～1.0mg/L 6-BA+0.0～0.1mg/L IAA+0.01～0.1mg/L GA3+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂，pH＝5.8；

(6)待不定芽伸长后将其转到生根培养基中进行生根培养；2～3周后，待苗长至3～4cm,并伴有2～4个真叶时进行驯化、移栽，获得健壮的乌桕再生植株；

其中，所述步骤(2)中的不定芽的诱导培养基为：MS+2.0～4.0mg/L 6-BA+0.01～0.2mg/L IAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂，pH＝5.8；在乌桕叶柄再生的整个过程中除了叶柄诱导愈伤组织的培养条件为23±2℃、黑暗培养，其它再生过程的培养条件均为23±2℃、光照培养，光照强度2000～2200lx,光照时间为12～16h。

优选地，所述步骤(4)中的愈伤组织转入分化培养基前切成(0.3～0.5)×(0.3～0.5)cm²大小的切块。

与现有技术相比，本发明存在以下有益效果：

本发明具有以下突出优点：其一，叶柄取材于野外乌桕优良株系再生的无菌苗，一方面能保持母本植株的种质特性；另一方面可以避免野外直接取材污染率高的问题，取材方便、无污染，可以实现对野外乌桕优良单株的快繁；其二，再生过程简单、高效，通过简单的激素配比调节，可以同时建立两条不同的乌桕再生途径；其三，本发明中所用的叶柄外植体较本发明人前期建立的叶片再生体系中所采用的叶片外植体健壮，有较强的耐受基因工程操作过程中机械损伤的能力，适于农杆菌或基因枪介导的遗传改良。因此，本发明所提供的一种利用叶柄为外植体诱导乌桕植株再生的方法，不仅为后期的乌桕优良株系的快繁提供了新的技术途径，而且为以后通过基因工程的方法对乌桕进行品种改良提供了技术支持。

附图说明

附图1为诱导前的乌桕叶柄切段。

附图2为叶柄丛生芽的诱导。

附图3为叶柄丛生芽的增殖。

附图4为叶柄愈伤组织的诱导。

附图5为叶柄愈伤组织的增殖。

附图6为叶柄愈伤组织的分化。

附图7为两种不同再生途径所获得的不定芽的伸长。

附图8为乌桕无菌苗的生根。

附图9为乌桕再生植株的移栽。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1

一种利用叶柄为外植体诱导乌桕植株再生的方法，具体操作如下：

1、对野外乌桕优良株系的带腋芽的茎段进行消毒、培养，获得乌桕无菌苗；

2、切取第1步骤所获得的无菌苗的叶柄作为外植体，将叶柄切成0.5cm左右的切段,接种于不定芽诱导培养基中，于温度为25℃，光照强度为2000lx,光照周期为12/12h的条件下进行不定芽的诱导(图1)，其中所述的不定芽诱导培养基为MS+2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂，pH＝5.8；

3、光照培养2～3周后，叶柄两端诱导出不定芽(图2)，然后将产生不定芽的叶柄横切一分为二，转接于增殖培养中进行不定芽的增殖培养，其中所述的不定芽增殖培养基为：MS+0.75mg/L 6-BA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂，pH＝5.8；

4、3周后，将步骤3中增殖的不定芽丛(平均每个不定芽丛上有36.7个不定芽)(图3)转接于不定芽伸长培养基中，进行不定芽的伸长，其中所述的不定芽的伸长培养基为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.02mg/L GA3+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂，pH＝5.8；

5、待丛生芽伸长到2～3cm(图7)，进行生根培养，待苗长至3～4cm,并伴有2～4个真叶(图8)时，移至土中进行驯化、移栽，获得健壮的乌桕再生植株(图9)。

实施例2：

2、切取第1步骤所获得的无菌苗的叶柄作为外植体，将叶柄切成0.5cm左右的切段,接种于愈伤组织诱导培养基中，于温度为25℃，黑暗条件下诱导愈伤组织(图1)，其中所述的愈伤组织诱导培养基为MS+1.0mg/L NAA+0.4mg/L 6-BA+0.05mg/L IAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂，pH＝5.8；

3、黑暗培养2～3周后，将产生愈伤组织的外植体(图4)转接于增殖培养中，于温度为25℃，光照强度为2000lx,光照周期为12/12h的条件下进行愈伤组织增殖培养，其中所述的愈伤组织增殖培养基为：MS+2.0mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA+0.01mg/L IAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂，pH＝5.8；

4、培光照养2周后，将增殖后的愈伤组织(图5)切成0.3×0.5cm2大小，转接于分化培养基上，于温度为25℃，光照强度为2000lx,光照周期为12/12h的条件下进行愈伤组织分化研究，所述的愈伤组织分化培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+0.05mg/L IBA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂，pH＝5.8；

5、培养3～4周后将步骤4中的愈伤组织分化所获得的不定芽丛(图6)，转接于不定芽伸长培养基中，于温度为25℃，光照强度为2000lx,光照周期为12/12h的条件下，进行不定芽的伸长，其中所述的不定芽的伸长培养基为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.02mg/L GA3+0.01mg/L IAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂，pH＝5.8；

6、待丛生芽伸长到2～3cm(图7)，进行生根培养，待苗长至3～4cm,并伴有2～4个真叶(图8)时，移至土中进行驯化、移栽，获得健壮的乌桕再生植株(图9)。

对比试验

表1中列出了已报道的以乌桕不同材料为外植体对乌桕株系进行再生的研究与本发明所述的方法效果对比。可以看出，本发明具有无污染、无褐化、再生率高、能保持母本株系优良性状和有利于后期基因工程操作研究等优点，具有明显的有益效果。

表1：相关研究与本发明效果对比

文献1：韩珊，石大兴等.红叶乌桕茎段离体培养的研究[J].四川农业大学学报，2006年9月第24卷第3期。

文献2：郄亚微，徐有明等.能源林树种乌桕茎段离体培养与快速繁殖[J].东北林业大学学报，2009年12月第37卷第12期。

文献3：陈建勇，李宝银等.乌桕茎段诱导组培快繁技术研究[J].福建林业科技，2009年6月第36卷第2期。

文献4：蒋祥娥，欧阳绍湘等。乌桕的组织培养及植株再生研究[J].湖北林业科技，2010.1,20-22。

文献5：蒋泽平，倪竞德等.乌桕优选单株的离体快速繁殖技术研究[J].江苏林业科，技2011年10月第38卷第5期。

文献6：陈佳，陈凌艳等.乌桕离体快繁再生技术研究[J].西南林业大学学报，2013年第33卷第6期。

文献7：毕君，张往祥等.红叶乌桕组织培养技术研究[J].中国农学通报，2013,29(28)：60-65。

文献8：李建科等.野生乌桕的组培和再生[J].北方园艺，2010(13):164-166.

文献9：陈颖等.乌桕不同外植体高效再生探索[J].西北植物学报，2010,30(12)：2542-2549。

文献10：田良涛.乌桕胚乳三倍体植株再生与转基因研究[M].湖北大学硕士学位论文,2011。

专利1：李霞，何小兰.乌桕组培不定芽高频率植株再生的方法。专利号：CN100581352C。

专利2：吴丽芳，侯金艳等.一种通过幼胚胚状体发生途径诱导乌桕植株再生的方法。专利号：CN 103004594A。

专利3：吴丽芳，侯金艳等.一种乌桕叶盘高效再生的方法。公开号：CN104012416A。

以上所述的仅为本发明较佳的实例，并不用以限制本发明。本领域技术人员可以根据本发明所述的内容进行显而易见的等同变换，如不脱离本发明实质的基础上，对个步骤中的培养基成分在一定范围内作出一些调整，仍然没有超出本发明的范围。

Claims

1.一种利用叶柄为外植体诱导乌桕植株再生的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(2)切取步骤(1)中所获得的无菌苗的叶柄作为外植体，并接种于诱导培养基中诱导不定芽或愈伤组织；其中，无菌苗的叶柄在接种于诱导培养基前切成0.3～0.6cm大小的切段；愈伤组织的诱导培养基为：MS+0.2～2.0mg/L NAA+0.2～1.0mg/L 6-BA+0.01～0.1mg/LIAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂，pH＝5.8；

(5)将步骤(3)中增殖后的不定芽丛或步骤(4)中分化成不定芽点的愈伤组织转接于不定芽的伸长培养基中，进行不定芽的伸长；其中，不定芽的伸长培养基为：MS+0.2～1.0mg/L6-BA+0.0～0.1mg/L IAA+0.01～0.1mg/L GA3+3.0g/L蔗糖+0.7g/L琼脂，pH＝5.8；

2.根据权利要求1所述的利用叶柄为外植体诱导乌桕植株再生的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的愈伤组织转入分化培养基前切成(0.3～0.5)×(0.3～0.5)cm²大小的切块。