CN108901856A - 一种山茶属植物高效体细胞胚发生和植株再生的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种山茶属植物高效体细胞胚发生和植株再生的方法，将山茶属植物茶树、油茶或红山茶的组培苗切除3/4叶片，以带1/4叶片的茎段作为外植体，接种到体细胞胚诱导培养基上，在24～26℃、光照下培养，茎节及叶柄处形成体细胞胚；选取体细胞胚切成1～5mm厚的切片，将切片平铺至体细胞胚增殖培养基上，在24～26℃、光照下培养，可形成新的体细胞胚；将体细胞胚转移至植株再生培养基上，在24～26℃、光照下培养，可由体细胞胚再生出小植株。本发明以山茶属植物幼嫩茎段为外植体，建立了高效的体细胞胚发生和植株再生体系，可有效提高山茶属植物组培繁殖效率，从而为茶树、油茶和茶花等作物的种苗生产与基因工程改良等提供了技术支持。

Description

一种山茶属植物高效体细胞胚发生和植株再生的方法
技术领域
本发明涉及植物诱导再生技术领域，具体涉及一种山茶属植物高效体细胞胚发生和植株再生的方法。
背景技术
自古至今，山茶属植物在我国被广泛用作饮料(茶)、食用油(山茶油)和观赏花卉(茶花)。山茶属植物组织培养研究始于上世纪70年代，主要以茎尖、腋芽、茎段、叶片、子叶、下胚轴、胚和花药等组织为外植体，通过器官发生的方式，建立了植物再生技术。由于这些再生技术体系的植株再生效率或增殖效率较低，目前还难以在生产或基因工程上广泛应用。
上世纪80年代以来，通过体细胞胚发生方式的植株再生研究在山茶属植物上取得了一些进展。据报道，体细胞胚发生方式获得的再生植株具有发达的根系和较强生长势。多数报道采用山茶属植物幼嫩或成熟种子(子叶和胚轴等)作为外植体进行愈伤组织或体细胞胚诱导并再生植株(颜慕勤和陈平，油茶体细胞胚状体的发生，1980；庄承纪等，茶梅体细胞胚胎发生和植株的再生，1988；刘德华和廖利民，茶树组织培养的研究——Ⅰ.胚状体和胚性细胞团的形成及植株再生，1989；王玉书等，茶树未成熟胚组培育苗技术的研究，1990；Wachira和Ogada，In vitro regeneration of Camellia sinensis(L.)O.Kuntze bysomatic embryogenesis，1995；杜克久等，云南大叶茶体细胞胚发生及体细胞胚苗形成体系的建立，1997；张智俊等，油茶优良无性系子叶体细胞胚植株再生，2005；Roy，Somaticembryogenesis and plant regeneration from immature and mature cotyledonarytissues of cultivated darjeeling tea[Camellia sinensis(L).O.Kuntze]，2006；Lü等，Plant regeneration via somatic embryogenesis and shoot organogenesis fromimmature cotyledons of Camellia nitidissima Chi 2013；胡玉玲等，普通油茶体胚再生体系研究，2014)。由于山茶属植物是高度杂合的，根据孟德尔遗传规律，由种子繁育的后代将出现严重的性状分离。因此，上述以生殖器官-种子的某个部位作为外植体获得的无性繁殖后代将产生严重的农艺性状的分离，难以保持母本品种的全部优良特性。如果采用与母本品种遗传背景一致的营养器官作为外植体，离体培养获得的再生植株将不会发生性状分离，能够保持母本品种的优良特性。因此，以山茶属植物叶柄、茎节及根等营养器官组织作为外植体，诱导体细胞胚发生并再生植株的研究受到人们的关注并取得了重要进展(Vieitez等，Somatic Embryogenesis from Roots of Camellia japonica PlantletsCultured in Vitro，1991；王毅军等，茶(Camellia sinensis Kuntze)体培养体细胞胚胎发生的组织细胞学研究，1994；Akula和Dodd，Direct somatic embryogenesis in aselected tea clone,‘TRI-2025’(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)from nodalexplants，1998；刘德华等，茶树不同组织体细胞胚、不定芽分化的研究，1999；蔡冬元，油茶叶片脱分化后的再分化技术研究，2014)。但是，前人的研究报道中，由外植体诱导获得体细胞胚的时间比较长，培养基成分比较复杂，或体细胞胚增殖效率较低，或植株再生效率较低，并因此限制了植株再生和扩繁的速度，从而导致上述植株再生体系仍然难以在茶树、油茶或茶花的种苗生产或基因工程领域广泛应用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种山茶属植物高效体细胞胚发生和植株再生的方法，有效提高体细胞胚诱导和增殖效率，从而建立更加高效的山茶属植物的植株再生体系。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种山茶属植物高效体细胞胚发生和植株再生的方法，包括如下步骤：
S1、体细胞胚诱导：从保存培养基上选取茶树、油茶或红山茶组培苗，切除3/4叶片，以带1/4叶片的茎段作为外植体，接种到体细胞胚诱导培养基上，在24～26℃、光照条件下培养8～12周，茎节及叶柄处形成体细胞胚；所述保存培养基以MS培养基为基本培养基，并添加蔗糖20～40g/L和琼脂8g/L，pH为5.8～6.0；所述体细胞诱导培养基以MS培养基为基本培养基，并添加6-苄基氨基腺嘌呤(6-BA)1.0～2.0mg/L、蔗糖20～40g/L和琼脂8g/L，pH为5.8～6.0；
S2、体细胞胚增殖：选取步骤S1中形成的体细胞胚，切片，将切片平铺至体细胞胚增殖培养基上，在24～26℃、光照条件下培养8周，在切片周边及表面形成新的体细胞胚；所述体细胞胚增殖培养基以MS培养基为基本培养基，添加噻苯隆(TDZ)0～0.1mg/L、蔗糖20～40g/L和琼脂8g/L，pH为5.8～6.0；
S3、植株再生：选取步骤S2培养得到的体细胞胚转移至植株再生培养基上，在24～26℃、光照条件下培养8～12周，由体细胞胚再生出完整小植株；所述植株再生培养基以1/4MS培养基为基本培养基，并添加蔗糖20～40g/L和琼脂8g/L，pH为5.8～6.0。
进一步地，步骤S1中的组培苗为继代培养4～6周的组培苗。
进一步地，所述体细胞诱导培养基中含6-苄基氨基腺嘌呤(6-BA)1.5mg/L。
进一步地，步骤S1中，作为外植体的茎段的长度为0.5～1.5cm，且带有一个节。
进一步地，步骤S1中，作为外植体的茎段45度角斜插于所述体细胞胚诱导培养基上。
进一步地，步骤S1中，光照条件为：光照强度为10μmol m–2s–1，每日光照12小时，黑暗12小时；步骤S2和步骤S3中，光照条件均为：光照的强度为54μmol m–2s–1，每日光照12小时，黑暗12小时。
进一步地，步骤S2和步骤S3中，选取的体细胞胚的直径为10～12mm；
进一步地，步骤S2中，用手术刀将体细胞胚切成厚度为1～5mm的切片。优选地，步骤S2中，用手术刀将体细胞胚切成厚度为2mm的切片。
进一步地，步骤S2中，所述体细胞胚增殖培养基中含有所述噻苯隆(TDZ)0.05mg/L。
本发明的有益效果在于：
(1)采用山茶属植物幼嫩茎段作为外植体，在体细胞胚诱导阶段(步骤S1)，优化了培养中生长调节剂的组成以及培养环境参数。从效果来看，体细胞胚诱导形成时间为8～12周，与现有技术报道相比，大大缩短了体细胞胚的诱导周期。
(2)在体细胞胚增殖阶段(步骤S2)，将体细胞胚切片，将体细胞胚切片平铺在添加了噻苯隆(TDZ)培养基上，使切片充分的获得营养供应和生长调节剂的刺激，促使切片周边及伤口能够更高频率地形成次级体细胞胚，从而显著提高体细胞胚增殖效率，每个增殖周期(8周)体细胞胚数量可增殖40～80倍。与现有的技术报道相比，体细胞胚增殖效率显著提高。本发明技术更利于山茶属植物植株的高效快速再生和扩繁，同时也为山茶属植物基因工程改良提供技术支持。
本发明采用山茶属植物组培苗的幼嫩茎段作为外植体，建立了高效的体细胞胚发生、增殖和植株再生体系。外植体经过8～12周培养，体细胞胚诱导率可达80.5％；体细胞胚增殖阶段，每个增殖周期(8周)体细胞胚数量可增殖40～80倍；细胞胚经过8～12周再生培养，植株再生率可达90.8％。
具体实施方式
以下将对本发明作进一步的描述，需要说明的是，以下实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
一种山茶属植物高效体细胞胚发生和植株再生的方法，包括如下步骤：
S1、体细胞胚诱导：从保存培养基上选取茶树、油茶或红山茶组培苗，切除3/4叶片，以带1/4叶片的茎段作为外植体，接种到体细胞胚诱导培养基上，在24～26℃、光照条件下培养，茎节及叶柄处形成体细胞胚；所述保存培养基以MS培养基为基本培养基，并添加蔗糖20～40g/L和琼脂8g/L，pH为5.8～6.0；所述体细胞诱导培养基以MS培养基为基本培养基，并添加6-苄基氨基腺嘌呤(6-BA)1.0～2.0mg/L、蔗糖20～40g/L和琼脂8g/L，pH为5.8～6.0；
S2、体细胞胚增殖：选取适宜大小的体细胞胚，用手术刀切片，将切片平铺至体细胞胚增殖培养基上，在24～26℃、光照条件下培养，在切片周边及表面形成新的体细胞胚；所述体细胞胚增殖培养基以MS培养基为基本培养基，添加噻苯隆(TDZ)0～0.1mg/L、蔗糖20～40g/L和琼脂8g/L，pH为5.8～6.0。体细胞胚可按此方式连续不断的进行增殖培养；
S3、植株再生：选取步骤S2培养得到的体细胞胚转移至植株再生培养基上，在24～26℃、光照条件下培养，由体细胞胚再生出完整小植株；所述植株再生培养基以1/4MS培养基(1/4MS的大量元素，全量的微量元素和全量的有机物)为基本培养基，并添加蔗糖20～40g/L和琼脂8g/L，pH为5.8～6.0。
进一步地，步骤S1中的组培苗为继代培养4～6周的组培苗。
优选地，所述体细胞诱导培养基中含6-苄基氨基腺嘌呤(6-BA)1.5mg/L。
进一步地，步骤S1中，作为外植体的茎段的长度为0.5～1.5cm，且带有一个节。优选地，作为外植体的茎段的长度为1cm。
进一步地，步骤S1中，作为外植体的茎段45度角斜插于所述体细胞胚诱导培养基上。
进一步地，步骤S1中，光照条件为：光照强度为10μmol m–2s–1，每日光照12小时，黑暗12小时。
进一步地，步骤S1中，接种到体细胞胚诱导培养基上后在24～26℃、光照条件下培养为8～12周。
进一步地，步骤S2中，选取的体细胞胚的直径为10～12mm。
进一步地，步骤S2中，用手术刀将体细胞胚切成厚度为1～5mm的切片。优选地，用手术刀将体细胞胚切成厚度为2mm的切片。
进一步地，步骤S2中，所述体细胞胚增殖培养基中含有所述噻苯隆(TDZ)0.05mg/L。
进一步地，步骤S2中，光照条件为：光照的强度为54μmol m–2s–1，每日光照12小时，黑暗12小时。
进一步地，步骤S2中，将切片平铺至体细胞胚增殖培养基上后在24～26℃、光照条件下培养8周。
进一步地，步骤S3中，所述体细胞胚的直径为10～12mm。
进一步地，步骤S3中，选取步骤S2培养得到的新的体细胞胚转移至植株再生培养基上后培养8～12周。
进一步地，步骤S3中，光照条件为：光照的强度为54μmol m–2s–1，每日光照12小时，黑暗12小时。
表1所示为体细胞胚切片的厚度对体细胞胚增殖的影响的实验结果。
表1
注：体细胞胚增殖倍数是指体细胞胚数量增加倍数，培养基中不含TDZ。
从表1中可以看出，切片厚度为2mm时体细胞胚增殖倍数最大。表2所示为噻苯隆(TDZ)浓度对体细胞胚增殖的影响的实验结果。
表2
注：体细胞胚增殖倍数是指体细胞胚数量增加倍数，体细胞胚切片厚度为2mm。
从表2可以看出，当噻苯隆(TDZ)的浓度为0.05mg/L，体细胞胚增殖倍数最大。
对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种山茶属植物高效体细胞胚发生和植株再生的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、体细胞胚诱导：从保存培养基上，选取茶树、油茶或红山茶组培苗，切除3/4叶片，以带1/4叶片的茎段作为外植体，接种到体细胞胚诱导培养基上，在24～26℃、光照条件下培养8～12周，茎节及叶柄处形成体细胞胚；所述保存培养基以MS培养基为基本培养基，并添加蔗糖20～40g/L和琼脂8g/L，pH为5.8～6.0；所述体细胞诱导培养基以MS培养基为基本培养基，并添加6-苄基氨基腺嘌呤(6-BA)1.0～2.0mg/L、蔗糖20～40g/L和琼脂8g/L，pH为5.8～6.0；
S2、体细胞胚增殖：选取步骤S1中形成的体细胞胚，切片，将切片平铺至体细胞胚增殖培养基上，在24～26℃、光照条件下培养8周，在切片周边及表面形成新的体细胞胚；所述体细胞胚增殖培养基以MS培养基为基本培养基，添加噻苯隆(TDZ)0～0.1mg/L、蔗糖20～40g/L和琼脂8g/L，pH为5.8～6.0；
S3、植株再生：选取步骤S2培养得到的体细胞胚转移至植株再生培养基上，在24～26℃、光照条件下培养8～12周，由体细胞胚再生出完整小植株；所述植株再生培养基以1/4MS培养基为基本培养基，并添加蔗糖20～40g/L和琼脂8g/L，pH为5.8～6.0。
2.根据权利要求1所述的山茶属植物高效体细胞胚发生和植株再生的方法，其特征在于，步骤S1中的组培苗为继代培养4～6周的茶树、油茶或红山茶组培苗。
3.根据权利要求1所述的山茶属植物高效体细胞胚发生和植株再生的方法，其特征在于，所述体细胞诱导培养基中含6-苄基氨基腺嘌呤(6-BA)1.5mg/L。
4.根据权利要求1所述的山茶属植物高效体细胞胚发生和植株再生的方法，其特征在于，步骤S1中，作为外植体的茎段的长度为0.5～1.5cm，且带有一个节。
5.根据权利要求1所述的山茶属植物高效体细胞胚发生和植株再生的方法，其特征在于，步骤S1中，作为外植体的茎段45度角斜插于所述体细胞胚诱导培养基上。
6.根据权利要求1所述的山茶属植物高效体细胞胚发生和植株再生的方法，其特征在于，步骤S1中，光照条件为：光照强度为10μmol m–2s–1，每日光照12小时，黑暗12小时；步骤S2和步骤S3中，光照条件均为：光照的强度为54μmol m–2s–1，每日光照12小时，黑暗12小时。
7.根据权利要求1所述的山茶属植物高效体细胞胚发生和植株再生的方法，其特征在于，步骤S2和步骤S3中，选取的体细胞胚的直径为10～12mm。
8.根据权利要求1所述的山茶属植物高效体细胞胚发生和植株再生的方法，其特征在于，步骤S2中，用手术刀将体细胞胚切成厚度为1～5mm的切片。
9.根据权利要求8所述的山茶属植物高效体细胞胚发生和植株再生的方法，其特征在于，步骤S2中，用手术刀将体细胞胚切成厚度为2mm的切片。
10.根据权利要求1所述的山茶属植物高效体细胞胚发生和植株再生的方法，其特征在于，步骤S2中，所述体细胞胚增殖培养基中含有所述噻苯隆(TDZ)0.05mg/L。
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