CN101558743A - 一种山茶未成熟胚再生胚状体的方法 - Google Patents

一种山茶未成熟胚再生胚状体的方法 Download PDF

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Inventor
李纪元
范正琪
李辛雷
田敏
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Abstract

本发明主要涉及一种山茶未成熟胚再生胚状体的方法,按以下步骤进行:将种子剥去内外种皮,去除胚根和胚芽,将子叶切成薄片,接种在胚状体诱导培养基上,培养温度为25±2℃,光照光强为2500~3000Lx,光照时间为12h/d,胚状体诱导培养基为MS+1.0mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA;将诱导的子叶形胚状体从母体上分离下来,接种在胚状体生长培养基上,胚状体生长培养基为MS+0.16-BA mg·L-1+0.01NAA mg·L-1+40g·L-1sugar,在苗高1-2厘米时移至1/2MS培养基上。本发明的有益效果是:本发明培养基配方简单,操作工艺简便,培养时间短,再生频率高,成本低,有利于大规模生产山茶及实现外源基因的遗传转化。

Description

一种山茶未成熟胚再生胚状体的方法
技术领域
本发明涉及山茶花组织培养方法,属于生物技术领域,是一种山茶未成熟胚再生胚状体的方法。
背景技术
山茶花(Camellia)是世界著名的观赏木本花卉,其栽培历史悠久。常用的无性繁殖方法是扦插、分株和嫁接,由于山茶花是一种生长比较缓慢的植物,特别是一些名贵和优良品种,育性较差,种质资源缺乏,扦插时生根率极低,繁殖系数低,远远不能满足市场需要。因此利用组织培养技术快速、大量繁殖山茶花优良品种具有重要意义。此外,近年来发展起来的植物基因遗传转化技术突飞猛进,山茶花的组织培养为该方向的发展奠定了基础。在组织培养中器官发生途径成苗较快,但生根较难,且遗传稳定性较差,而胚状体成苗途径中胚状体具有两极性结构,利用这一途径进行无性繁殖,繁殖速度快,遗传稳定性高,能克服器官发生途径生根难的问题。另外,诱导胚状体成苗,通过胚性细胞克隆,人工种子工厂化生产、突变体诱导筛选、种质资源保存和利用均具有重要意义。国内外在红山茶、云南山茶花、油茶等山茶属植物的体细胞胚状体诱导有过报道,但再生率都较低,阻碍了下一步工作进展。
发明内容
本发明的目的是针对山茶花组织培养再生植株困难的技术瓶颈,提供一种山茶未成熟胚再生胚状体的方法。
本发明目的通过以下技术方案来实现:这种山茶未成熟胚再生胚状体的方法,该方法按以下步骤进行:
(1)将山茶花未成熟果子用自来水冲洗干净,再用洗衣粉浸泡10分钟,自来水冲洗;然后转移到无菌超净台上去除果皮后,用体积比为75%乙醇表面消毒30秒,无菌水冲洗2遍,用重量比为0.1%的HgCl2中浸泡15——20分钟,无菌水冲洗5——6遍;
(2)将种子剥去内外种皮,去除胚根和胚芽,将子叶切成薄片,接种在胚状体诱导培养基上,培养温度为25±2℃,光照光强为2500~3000Lx,光照时间为12h/d,胚状体诱导培养基为MS+1.0mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA;
(3)将诱导的子叶形胚状体从母体上分离下来,接种在胚状体生长培养基上,胚状体生长培养基为MS+0.16-BA mg·L-1+0.01NAA mg·L-1+40g·L-1sugar,在苗高1-2厘米时移至1/2MS培养基上。
本发明的有益效果是:本发明培养基配方简单,操作工艺简便,培养时间短,再生频率高,成本低,有利于大规模生产山茶及实现外源基因的遗传转化。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明,但本发明的内容并不局限于此。
实施例:这种山茶未成熟胚再生胚状体的方法,材料为浙江红山茶8月未成熟果实。将采集的果实用自来水冲洗干净,再用洗衣粉浸泡10分钟,自来水冲洗。然后转移到无菌超净台上去除果皮后,用体积比为75%乙醇表面消毒30秒,无菌水冲洗2遍,用重量比为0.1%的HgCl2中浸泡15——20分钟,无菌水冲洗5——6遍。无菌条件下剥去种子外层种壳及内层种皮,取出具有两旁肥厚子叶的成熟种胚,子叶切成薄片,接种在胚状体诱导培养基上,培养基为MS+1.0mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA+40g·L-1sugar。培养温度为25±2℃,光照光强为2500~3000Lx,光照时间为12h/d。切成薄片的子叶在培养基上培养3天后,一些子叶开始变绿,一周后子叶表面凹凸不平,3-4周后表面形成乳黄色的颗粒状突起,在光照条件下慢慢变绿,40天以后小颗粒长成具有2片子叶状的胚状体。其再生频率达55%以上。
将胚状体从母体上分离下来,接种在胚状体生长培养基上,培养基为MS+0.16-BAmg·L-1+0.01NAA mg·L-1+40g·L-1sugar。在其上生长一周后,胚状体开始两极生长,两片叶子慢慢张大,根向下钻入培养基,并有很多须根长出。生长1周后苗高1-2厘米,移至1/2MS培养基上,苗可健壮生长,半月后小植株长至3-5厘米高,已有多片叶子,温室条件下锻炼一周左右,移栽入土。
除上述实施例外,本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案,均落在本发明要求的保护范围。

Claims (1)

1、一种山茶未成熟胚再生胚状体的方法,其特征在于:该方法按以下步骤进行:
(1)将山茶花未成熟果子用自来水冲洗干净,再用洗衣粉浸泡10分钟,自来水冲洗;然后转移到无菌超净台上去除果皮后,用体积比为75%乙醇表面消毒30秒,无菌水冲洗2遍,用重量比为0.1%的HgCl2中浸泡15——20分钟,无菌水冲洗5——6遍;
(2)将种子剥去内外种皮,去除胚根和胚芽,将子叶切成薄片,接种在胚状体诱导培养基上,培养温度为25±2℃,光照光强为2500~3000Lx,光照时间为12h/d,胚状体诱导培养基为MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA;
(3)将诱导的子叶形胚状体从母体上分离下来,接种在胚状体生长培养基上,胚状体生长培养基为MS+0.16-BA mg·L-1+0.01NAA mg·L-1+40g·L-1 sugar,在苗高1-2厘米时移至1/2MS培养基上。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102613089A (zh) * 2012-04-25 2012-08-01 江苏省林业科学研究院 一种二十年生木荷大树高效离体繁殖方法
CN103081807A (zh) * 2013-02-01 2013-05-08 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法
CN108901856A (zh) * 2018-09-18 2018-11-30 广东省农业科学院茶叶研究所 一种山茶属植物高效体细胞胚发生和植株再生的方法

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