CN116058279A - 一种定向高效选育香味蝴蝶兰新品种的方法 - Google Patents
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Abstract
本技术发明通过亲本选择与人工杂交、果实预处理与消毒、实生苗培育中固体和浅层液体悬浮培养结合、早期开花评价与株系群体构建三性评价同步法，建立了定向选育香味蝴蝶兰新品的方法。本方法有效提高蝴蝶兰育种效率，育种周期缩18个月以上,育种效率提高28.6％。
Description
技术领域
本发明申请涉及新品种选育技术领域，具体涉及一种定向高效选育香味蝴蝶兰新品种的方法。
背景技术
蝴蝶兰产业发展迅速但育种研究特别是定向选育技术方面落后，研究相对集中在种苗繁育、盆花生产方面，新品种选育技术滞后导致品种对外依赖程度高。
蝴蝶兰杂交育种周期长，涉及从杂交结实、无菌播种、组培及田间育苗、开花评价、优良单株再扩繁和评价等多个技术环节，且各环节生长期长，常规杂交选育一个新品种需要7～8年时间。目前蝴蝶兰香味型品种倍受市场欢迎，但已有的近3万个品种中具香味的品种不足百个，在市场上可见的更是只有寥寥几个，而且香味品种都是以迷你型小花为主。其原因主要由于香味型品种多为原生种及其后代，花瓣和萼片腊质程度高，在常规杂交中香味型品种做母本时杂交后花瓣难枯萎，而且果实小、发育缓慢、后期果实皱缩、开裂和败育问题突出，而用做父本时与其它品种亲合性较差，早期花朵和刚膨大子房枯萎脱落严重。本发明主要针对上述问题，通过改进杂交育种中亲本选择、种子苗培育及评价等技术环节，达到提高香味型品种的育种效率、缩短育种周期、培育中花型香味蝴蝶兰品种的目的。
发明内容
为解决或部分解决相关技术中存在的问题，本发明申请提供一种定向高效选育香味蝴蝶兰新品种的方法。本发明通过亲本选择与人工杂交、果实预处理与消毒、实生苗培育中固体和浅层液体悬浮培养结合、早期开花评价与株系群体构建三性评价同步法，建立了定向培育香味蝴蝶兰新品的方法，缩短了育种周期18个月以上、提高育种效率28.6％。
一种定向高效选育香味蝴蝶兰新品种的方法，包括以下步骤：
(1)亲本选择与人工杂交
选择香味品种为母本，中花型优良品种为父本，人工授粉时取父本开放时间不超过6天花朵的花粉团进行前处理，再对母本花序基部1～3朵开放时间不超过8天花朵将处理过的花粉团放入到母本花朵的蕊柱腔内，授粉后要及时摘除花序上未授粉的花朵；
(2)果实预处理与消毒
将步骤1授粉后120～150天，采收变黄或变圆滑的果实，并用酒精擦试后在4～5℃低温下预处理2～3天，取出后消毒并漂洗；
(3)种子萌芽诱导
将经步骤2消毒果荚在无菌条件下纵向切开，取果实内絮丝状物或种子接种到萌芽诱导培养基表面进行培养，培养30天后，絮丝状物或种子开始变绿，继续培养到90～100天，形成小芽团或具有叶片小苗；
(4)浅层液体悬浮培养分散实生苗
将在步骤3诱导获得的小芽团或小苗转接到浅层液体培养中悬浮培养，培养50～60天后，形成分散且有叶片实生苗；
(5)实生苗株系早期评价与群体构建
挑选步骤4浅层液体悬浮培养后长势好、健壮、叶面积0.3cm2以上的小苗按单株编号，按照常规的蝴蝶兰继代增殖和生根方法进行继代和生根培养，继代周期为60～70天，继代增殖2～3次后，每个实生苗单株株系选择5株大苗生根培养,用于早期开花评价，对每个株系生根后剩余材料继续继代增殖用于株系群体构建，群体材料达到60～80株/株系时生根培养；
(6)后代株系早期开花评价
步骤5中用于早期开花评价的生根苗瓶内培养70天后，取出移栽到的成型透水性育苗基质块中,移栽前15天每天用清水喷透，之后每天用自配液肥1次性喷透，培养100～120天，长出新根且最长叶超过8cm时，将基质块及苗换到规格合适的基质为水草的营杯中继续培养100～120天，然后按照蝴蝶兰常规的低温催花方处理110～130天后，后代株系开花时进行早期性状评价；
(7)株系群体评价
将步骤5中生根培养的60～80株群体材料，按步骤6的方法移栽、管理，待开花后进行一致性、稳定性、特异性评价。
进一步的，步骤(1)中以香味型品种‘香味小红’或‘彼自豪’为母本，‘芳美西施’或‘玉观音’为父本。
进一步的，步骤(1)中所述前处理的具体步骤为在GA50mg/L+硼20mg/L的溶液中浸泡5～10分钟。
进一步的，步骤(2)中所述酒精为75％酒精。
进一步的，步骤(2)中所述消毒并漂洗的具体步骤为用3～5％次氯酸钠溶液浸泡15～25分钟后无菌水漂洗。
进一步的，步骤(3)中所述诱导培养基的配方为花宝1号1～2g+白糖15g+牛骨蛋白胨0.5～1.0g+香蕉60g+土豆15g+琼脂粉5.5g，培养条件为：温度27～30℃，光照3000～5000LX。
进一步的，步骤(4)中所述浅层培养基的配方为花宝1号0.5～1.0g+花宝2号0.2～0.5g+白糖15g+牛骨蛋白胨1g+善存多维元素片0.5g+肌醇0.1g+香蕉40g+苹果25g+活性炭1g，培养基厚度为0.5～0.6ml。
进一步的，步骤(4)中所述悬浮培养的条件为：旋转摇床转速80～100r/分钟，全天2000Lx光照，温度27℃。
进一步的，步骤(6)中所述自配液肥为2500倍N～P～K为20～20～20平衡肥+10000倍微肥。
进一步的，步骤(6)中育苗阶段培养条件为：日温28～30℃，夜温23～26℃；低温催花条件：日温18～20℃，夜温16～18℃。
应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明申请。
本发明的有益技术效果：
1、提高香味品种杂交结实和无菌组培效率
通过定向选配香味亲本、花粉团前处理，克服香味品种杂交中早期不亲合、中期败育、后期结实差的问题；在实生苗培育阶段，通过果实预处理、种子在固体萌芽诱导培养基上培养与浅层液体悬浮培养交替结合，解决了果实进种率和种子萌芽低、种子苗在瓶内成团聚集导致的生长缓慢和单株难分问题，杂交结实果率提高36.1％,获得实生苗率提高30.0％。
2、缩短育种时间和提高育种效率
通过优化育种环节、步骤和方法，累计可缩短育种时间18个月以上，育种效率提高28.6％。具体体现在通过在组培阶段采用早期开花评价与株系群体构建评价同步进行法和育苗阶段采用两步移栽催花法。
2.1同步进行瓶内培养阶段早期开花评价与构建株系群体评价：在实生苗瓶内培养中，每个实生株系先出瓶5株进行早期评价后，继续继代2～3代(120～180天)后就可达到株系群体构和评价所需的种苗数，这样在早期评价获得优良后代的同时株系群体一致性、稳定性和特异性的三性评价紧接着完成，较现有技术在单株实生苗开花评价后再取花梗进行组培扩繁株系群体，出瓶培育成开花株系评价缩短了15.1个月。
2.2组培苗出瓶后采用两步移栽催花法：组培苗出瓶后育苗先在成型透水基质块(荷兰进口quick plug)中培育，由于基质块透水和透气性好，苗期采用在可增加水肥用量1倍的大水大肥管理下不仅不会导致烂苗和烂根，而且生长快，与出瓶育苗时采用水肥管理难的水草基质相比，烂根和烂苗引起的死亡率降低15％以上，小苗二次移栽时间可缩短15～20天。二次移栽到8.5*10cm育苗杯中培育成苗就可催花，较常规要经过先在1.7寸杯中培养后移到2.8寸杯，最后还要移到3.5寸杯中培养催花苗相比，可缩短3个月以上。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明申请的可选实施方式。虽然表述了本发明申请的可选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明申请而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本发明申请更加透彻和完整，并且能够将本发明申请的范围完整地传达给本领域的技术人员。
在本发明申请使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明申请。在本发明申请和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
为更清楚起见，下面通过以下实施例进行详细说明。
实施例1
1、亲本选择与人工杂交
以香味型品种‘香味小红’为母本，‘芳美西施’为父本。人工授粉时取父本开放时间为4天花朵上的花粉团，在GA50mg/L+硼20mg/L的溶液中浸泡8分钟，对母本花序基部1～3朵开放时间在1～8天的花朵将处理过的花粉团放入到母本花朵的蕊柱腔内，授粉后要摘除花序上未授粉的花朵，挂牌标明组合及授粉时间。
2、果实预处理与消毒
按步骤1授粉20天后，子房明显膨大，到130天时，采收微黄果实并用75％酒精擦试后在4～5℃低温下冷藏2天，取出后再用3.0％的次氯酸钠溶液浸泡25分钟后无菌水漂洗。
3、种子萌芽诱导
将经步骤2消毒果荚在超净工作台上纵向切开，取果实内的絮丝状物挑出放到萌芽诱导培养基表面培养，培养30天后，絮丝状物上开始长出绿点，继续培养到100天时，形成小芽点和具有叶片小苗。所述1升萌芽诱导培养基配方：花宝1号1g+白糖15g+牛骨蛋白胨1.0g+香蕉60g+土豆15g+琼脂粉5.5g，培养条件为：温度27～30℃，光照3000～5000LX。
4、浅层液体悬浮培养分散实生苗
将在步骤3诱导获得的芽点和小苗转接浅层液体培养中悬浮培养，培养60天后，形成分散且有叶片实生苗。所述浅层液体培养基为：花宝1号0.5g+花宝2号0.5g+白糖15g+牛骨蛋白胨1g+善存多维元素片0.5g+肌醇0.1g+香蕉40g+苹果25g+活性炭1g，培养基厚度为0.5～0.6ml，悬浮培养条件为：旋转摇床转速80r/分钟，全天2000Lx光照，温度27℃。
5、实生株系早期评价与群体构建
优选步骤4中长势好、健壮、叶面积0.3cm2以上的小苗，从1号开始依次进行单株编号，对每个单株按照常规蝴蝶兰继代增殖和生根方法进行继代和生根培养，继代周期60天，继代2～3次后，每个实生苗单株株系选择5株大苗生根培养,用于早期开花评价，对每个株系生根后剩余材料继续继代增殖用于株系群体构建，群体材料达到80株/株系时生根培养,用于新品种三性评价。
6、后代株系早期开花评价
步骤5中用于早期开花评价的生根苗瓶内培养60天后，取出移栽到5*5cm的成型透水性育苗基质块(quick plug)中,移栽前15天每天用清水喷透，之后每天用2500倍N～P～K为20～20～20平衡肥+10000倍微肥1次性喷透，培养100天，长出新根且最长叶超过8cm时，将基质块及苗换到8.5*10cm基质为水草的营杯中继续培养110天，然后按照蝴蝶兰常规的低温催花方处理120天后，后代株系开花时早期性状评价。所述育苗培养条件为：日温28～30℃，夜温23～26C℃；低温催花条件：日温18～20℃，夜温16～18℃。
7、株系群体评价和新品种申报
步骤5中继续继代增殖用于株系群体构建的材料扩繁达到所需生根苗数量时进行生根培养，按步骤6的方法移栽、管理，待开花后进行一致性、稳定性、特异性评价，对满足三性评价且具有香味的株系进行新品种申报。
实施例2：实施例2除以下步骤不同外，其余步骤与实施例1相同。
1、亲本选配与杂交：以‘彼自豪’为母本，香味品种‘玉观音’为父本。
2、果实前处理与消毒：步骤1授粉后140天时，采收变黄的果实并用75％酒精擦试后在4～5℃低温下冷藏2天，取出用5.0％的次氯酸钠浸泡15分钟，然后无菌水漂洗。
3、种子萌芽诱导
将经步骤2消毒果荚在无菌条件纵向切开，取果实内絮丝状物及种子接种到萌芽诱导培养基表面进行培养。所述萌芽诱导培养基为：花宝1号2g+白糖15g+牛牛骨蛋白胨0.5g+香蕉60g+土豆15g+琼脂粉5g，培养条件为：温度27～30℃，光照3000～5000LX。
4、浅层液体悬浮培养分散实生苗
将在步骤3诱导获得的小苗转接浅层液体培养中悬浮培养，培养50天后，形成分散且有叶片实生苗。所述浅层液体培养基为：花宝1号1.0g+花宝2号0.2g+白糖15g+牛骨蛋白胨1g+善存多维元素片0.5g+肌醇0.1g+香蕉40g+苹果25g+活性炭1g，培养基厚度为0.5～0.6ml，悬浮培养条件为：旋转摇床转速100r/分钟，光照2000Lx全天光照，温度27℃。
实施例3对比试验：通过以下试验：(1)亲本品种选择对早期亲合性、中期败育和结实影响，(2)株系早期评价结合群体构建方法对缩短育种时间影响。通过试验进一步验证本发明中通过亲本选配、株系群体构建、早期开花评价方法对提高定向育种效率的效果。
(1)香味品种为父母本时对提高结果率和实生苗数的影响
选择以香味品种‘彼自豪’、‘香味小红’为母本，分别与父本‘玉观音’和‘芳美西施’进行正交和反交，每个组合选3株母本，对每株基部3朵花人工授粉，统计杂交后不亲合率、早期亲合性、中期败育、结果率和平均每果实苗数，结果见下表1：
表1：不同亲本组合对结果及果荚苗数的影响
注：
(1)不亲合和不亲合率(％)：授粉后25～30天花朵萎蔫或脱落为杂交不亲合。
不亲合率＝不亲合花朵数/授粉总花朵数×100。
(2)中期败育和中期败育率(％)：授粉70～80天子房有明显膨大后又皱缩或变黄为中期败育。中期败育率(％)＝中期败育花朵数/杂交总花朵数×100。
(3)结果和结果率(％)：授粉120天后果实变黄或圆润饱满为结果。
结果率(％)＝结果花朵数数/杂交总花朵数×100。
(4)每个果实出苗数(株)：絮丝状物或种子经萌芽诱导和悬浮培养后获的实生苗数/结果数。
从上表1可以看出：采用香味品种作为母本可以显著提高杂交结果率和种子的萌芽率。以香味品种作为母本时，早期不亲合率为5.56％、结果率为55.56％，较作为父本时不亲合率降低38.89％，结果率提高36.11％,平均每个果荚培育获得实生苗数增加30％，而中期败育率差异不显著。
(2)株系早期评价结合群体构建方法对缩短育种周期的影响
采用实施例1和2中‘彼自豪’*‘玉观音’和‘香味小红’*‘芳美西施’两个组合在步骤4获得的分散单株实生苗，选择大小一致的9株苗为材料，采用以下两种方法进行试验。
方法一：实生苗株系早期评价与构建株系群体同步法，按本发明步骤5方法，单株继代2～3次后先生根5株用于早期开花评价，每株系瓶内材料继续继代增殖到80株时生根用于新品种三性评价；
方法二：按常规方法，将实生苗单株生根后进行开花评价，然后再选优良单株的花梗为外植体组培进种、组培增殖、构建株系群体数达到80株时生根用于三性评价。
试验结果见下表2：
表2：不同株系群体构建方法所需育种时间：
注：(1)以上数据为每个组合方法9个材料的平均值。
从表2结果可以看出：采用实生苗株系早期评价与构建株系群体同步法与常规实生苗单株开花评价后再构建株系群体法相比，从配组杂交到新品种申报的育种时间分别为37.7个月和52.8个月，缩短15.1个月,育种效率提高28.6％。
通过以上实施例，进一步验证了本发明技术可提高定向选育获得香味品种效率，缩短新品种选育时间的效果。本发明方法不仅适用于难培育香味品种育种，还可用于其它类型蝴蝶兰的新品种选育。
以上已经描述了本发明申请的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术的改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。
Claims (10)
1.一种定向高效选育香味蝴蝶兰新品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)亲本选择与人工杂交
选择香味品种为母本，中花型优良品种为父本，人工授粉时取父本开放时间不超过6天花朵的花粉团进行前处理，再对母本花序基部1～3朵开放时间不超过8天花朵将处理过的花粉团放入到母本花朵的蕊柱腔内，授粉后要摘除花序上未授粉的花朵；
(2)果实预处理与消毒
将步骤1授粉后120～150天，采收变黄或变圆滑的果实，并用酒精擦试后在4～5℃低温下预处理2～3天，取出后消毒并漂洗；
(3)种子萌芽诱导
将经步骤2消毒果荚在无菌条件下纵向切开，取果实内絮丝状物或种子接种到萌芽诱导培养基表面进行培养，培养30天后，絮丝状物或种子开始变绿，继续培养到90～100天，形成小芽团或具有叶片小苗；
(4)浅层液体悬浮培养分散实生苗
将在步骤3诱导获得的小芽团或小苗转接到浅层液体培养中悬浮培养，培养50～60天后，形成分散且有叶片实生苗；
(5)实生苗株系早期评价与群体构建
挑选步骤4浅层液体悬浮培养后长势好、健壮、叶面积0.3cm2以上的小苗按单株编号，按照常规的蝴蝶兰继代增殖和生根方法进行继代和生根培养，继代周期为60～70天，继代增殖2～3次后，每个实生苗单株株系选择5株大苗生根培养,用于早期开花评价，对每个株系生根后剩余材料继续继代增殖用于株系群体构建，群体材料达到60～80株/株系再时生根培养；
(6)后代株系早期开花评价
步骤5中用于早期开花评价的生根苗瓶内培养70天后，取出移栽到的成型透水性育苗基质块中,移栽前15天每天用清水喷透，之后每天用自配液肥1次性喷透，培养100～120天，长出新根且最长叶超过8cm时，将基质块及苗换到规格合适的基质为水草的营杯中继续培养100～120天，然后按照蝴蝶兰常规的低温催花方处理110～130天后，后代株系开花时进行早期性状评价；
(7)株系群体评价
将步骤5中生根培养的60～80株群体材料，按步骤6的方法移栽、管理，待开花后进行一致性、稳定性、特异性评价。
2.根据权利要求1所述定向高效选育香味蝴蝶兰新品种的方法，其特征在于，步骤(1)中以香味型品种‘香味小红’或‘彼自豪’为母本，‘芳美西施’或‘玉观音’为父本。
3.根据权利要求1所述定向高效选育香味蝴蝶兰新品种的方法，其特征在于，步骤(1)中所述前处理的具体步骤为在GA50mg/L+硼酸20mg/L的溶液中浸泡5～10分钟。
4.根据权利要求1所述定向高效选育香味蝴蝶兰新品种的方法，其特征在于，步骤(2)中所述酒精为75％酒精。
5.根据权利要求1所述定向高效选育香味蝴蝶兰新品种的方法，其特征在于，步骤(2)中所述消毒并漂洗的具体步骤为用3～5％次氯酸钠溶液浸泡15～25分钟后无菌水漂洗。
6.根据权利要求1所述定向高效选育香味蝴蝶兰新品种的方法，其特征在于，步骤(3)中所述诱导培养基的配方为花宝1号2～3g+白糖15g+牛骨蛋白胨0.5～1.0g+香蕉60g+土豆15g+琼脂粉5.5g，培养条件为：温度27～30C°，光照3000～5000LX。
7.根据权利要求1所述定向高效选育香味蝴蝶兰新品种的方法，其特征在于，步骤(4)中所述浅层培养基的配方为花宝1号0.5～1.0g+花宝2号0.2～0.5g+白糖15g+牛骨蛋白胨1g+善存多维元素片0.5g+肌醇0.1g+香蕉40g+苹果25g+活性炭1g，培养基厚度为0.5～0.6ml。
8.根据权利要求1所述定向高效选育香味蝴蝶兰新品种的方法，其特征在于，步骤(4)中所述悬浮培养的条件为：旋转摇床转速80～100r/分钟，全天2000Lx光照，温度27℃。
9.根据权利要求1所述定向高效选育香味蝴蝶兰新品种的方法，其特征在于，步骤(6)中所述自配液肥为2500倍N～P～K为20～20～20平衡肥+10000倍微量元素肥。
10.根据权利要求1所述定向高效选育香味蝴蝶兰新品种的方法，其特征在于，步骤(6)中育苗阶段培养条件为：日温28～30℃，夜温23～26℃；低温催花条件：日温18～20℃，夜温16～18℃。
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