CN114208669B - 一种以茶树茎段为外植体建立高效再生体系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以‘中黄1号’茶树茎段为外植体，通过无菌体系的建立、诱导愈伤组织、愈伤组织诱导分化芽、芽生长发育、壮芽、生根、炼苗及移栽等步骤，解决了目前茎段无性系再生方法多为腋芽增殖、重复效果差以及无法满足遗传转化对高频再生体系的需求等问题，理论上还可进行农杆菌侵染的转基因试验。本发明建立了茶树茎段组织培养与植株高效再生体系，为茶树良种繁殖和遗传转化的研究奠定了一定的基础。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及到一种以‘中黄1号’茶树茎段为外植体的茶树组织培养再生体系的建立方法。
背景技术
茶[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]为山茶科山茶属多年生常绿灌木或乔木植物，是一种起源于我国的重要经济作物(陈宗懋.中国茶经[M].上海:上海文化出版社,1994:5.)，‘中黄1号’茶树品种是一种适制优质烘青茶的光照敏感型黄化品种，氨基酸含量是普通绿茶的2～3倍，抗逆性强，易于栽培管理，是我国选育的特色珍稀黄茶品种(虞富莲.中黄1号、中黄2号的特异性、一致性和稳定性[J].中国茶叶,2016,38(3):14-16.)。
目前，我国乃至世界茶树育种主要为常规系统育种和杂交育种，但受到诸多“瓶颈”的限制(Mondal TK,Bhattacharya A,Laxmikumaran M,Ahuja PS.Recent advances oftea(Camellia sinensis)biotechnology[J].Plant Cell,Tissue and OrganCulture.2004,76:195–254.)，如茶树育种周期长，茶树杂交育种难度大，成功率低和茶树利用自然变异难度大等(吴振铎.茶树组织培养的研究[J].中华农学会报.1976,93:30-42.)。利用植物组织培养来培育茶树，不仅可以保持优良性状，缩短育种年限，还可以避免环境对育种时间的限制，以及定向培育具有优良特异性状的新品种，实现批量化、大规模生产(刘静.茶树带腋芽茎段组织培养研究[J].陕西农业科学,2020,66(10):43-45.)。
组织培养的理论基础是植物细胞具有全能性，茶树组织培养从六十年代后期开始，由日本的胜尾清等首先开展茶树花药培养试验(胜尾清,陈文怀.茶树花药培养的研究(第一报)--培养基的组成与愈伤组织形成的关系[J].茶业通报,1981(S1):10.)，其后在国内外陆续进行了茶树种胚、茎、叶、茎尖和根等的培养研究(段运裳,茶树组织培养研究进展[J].福建茶叶.2007,(2):7-9.)。20世纪60年代末，英国剑桥大学为研究离体咖啡碱的合成首次进行了茶树茎段组织培养的研究(金惠淑,梁月荣.茶树生物技术研究进展[J].茶叶科学技术.1998,(2):1-4.)；1985年，Kato.M从茶树茎皮层组织诱导的愈伤组织中再生出芽，但分化率仅为20％左右(Kato M.Regeneration of plantles from tea stem callus[J].Japan J Breed,1985.35(4),317-322.)；2010年，雷攀登以茶树无性系品种龙井43号茎段为外植体，愈伤组织在BA 8.88μmol/L+IBA 0.49μmol/L培养12周后，愈伤组织再生率为52.6％(孙仲序,刘静,王玉军,等.山东茶树良种组织培养及繁殖能力的研究[J].茶叶科学,2000,202):129-132.)。关于茶树茎段组织培养的研究有大量报道，但多为腋芽增殖再生[黄燕芬,吴曦,周国兰,赵华富.茶树无菌播种建立植株再生体系[J].河南农业科学,2013,42(5):60-63.,张建华,毛平生,彭火辉.茶树的组培快繁技术初探[J].蚕桑茶叶通讯,2003,04:32-33.,谢恩俊,田维丽,陈正武,李岩,赵德刚.‘中黄1号’茶树带腋芽茎段组培快繁体系建立[J].分子植物育种,2020,18(15):5071-5080.,吴婉婉,孙威江,陈志丹.福鼎大白茶高效离体再生体系的优化[J].中国茶叶,2018:(9):22-25]，该再生体系只能用作植株的快速繁殖而很难再进行茶树的遗传转化，加之茎段建立的再生体系多数停留在愈伤组织阶段或存在再生芽分化率低和重复试验效果差的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以茶树茎段为外植体建立高效再生体系的方法，本方法以性状优良的‘中黄1号’茶树茎段为外植体，进行愈伤组织的诱导及植株再生体系的建立，不仅有利于保持茶树品种的遗传稳定性，还可促进茶树种质资源的保存，是一种可直接用于茶树遗传转化的高频再生体系。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种以茶树茎段为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于：所述茶树离体再生体系的构建是采用茎段作为外植体进行培养，经过愈伤组织阶段，分化再生芽，芽生长发育再成苗的过程；
其建立的方法包括步骤如下：
(1)外植体的选择
从茶树资源圃采集4月份的‘中黄1号’茶树新梢作为外植体，清洗表面尘垢；
(2)无菌体系的建立
将外植体置于超净台内，消毒清洗，沥干水分后切成0.5～1cm的带单腋芽茎段，在无菌状态下竖置于茶树扩繁培养基，接种量为每40毫升培养基接5～6株，培养2周后获得无菌苗，所述扩繁培养基为MS+1mg/L 6-BA+0.5mg/L IBA；
(3)愈伤组织的诱导
在超净状态下将无菌苗切为长度0.8-1.2cm茎段，横置于诱导培养基内，接种量为每25毫升培养基接4～5个外植体，所述诱导培养基为1/2MS+70mg/l硫酸腺嘌呤+3mg/l6-BA+0.2mg/LTDZ；
(4)愈伤组织诱导分化芽
取生长良好的愈伤组织从茎段整体中切下，并切成直径8～10毫米的愈伤组织块，转至分化培养基中，接种量每25毫升培养基接6～7块，分化培养基为MS+1mg/L6-BA+1mg/LTDZ+0.2mg/LIBA；
(5)芽的生长发育
将分化再生芽诱导增殖出的丛生芽分切，置于增殖培养基，栽插量每50毫升培养基接3～4棵，增殖培养基为MS+2mg/L6-BA+2mg/LNAA；
(6)壮芽
取高度约2～3cm，长势基本一致的芽移至壮芽培养基，栽插量每50毫升培养基接3～4棵，所述壮芽培养基为MS+0.7mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+1mg/LIBA；
(7)生根
取高度约5～6cm长势良好的无根苗，去除基部愈伤组织和多余的叶片，先用100mg/L IBA浸泡不定芽基部切口处10min，再栽插入生根培养基，栽插量每50毫升培养基接1棵，生根培养基1/2MS+1mg/LIBA+0.1mg/LNAA；
(8)炼苗及移栽
待组培苗的根长到超过3cm，叶片数达4～5片时，进行炼苗，再选生长健壮且已形成良好根系的小苗洗净培养基，直接栽入基质配比为营养土：蛭石＝2：1的疏松土壤中。
所述步骤(1)中新梢需剪除叶片，每一节位留下叶柄保护腋芽，所述清洗为加入2-3滴洗洁剂清洗，再用自来水冲洗2～3h，浸泡过程中不断晃动。
所述消毒清洗为先用75％酒精消毒1min，无菌水清洗3次，再用0.1％升汞消毒12min，无菌水清洗4次，消毒过程中不断搅动。
其中植物组织培养的各个阶段，外植体切口处均为斜切。
所述步骤(3)中的愈伤组织是切口处脱分化而形成的愈伤组织；所述步骤(4)中的芽是脱分化形成的愈伤组织经再分化而形成的芽。
所述步骤(4)中所述生长良好的愈伤组织的形态为质地较紧实不均匀，表面呈现红绿色隆起。
所述步骤(4)中所述生长良好的愈伤组织需在诱导培养基中培养18-22天。
其中植物组织培养各个阶段：培养室温度25±2℃；相对湿度70％～80％；光照强度：2000lx；光周期12h/d。
所述炼苗为自然光条件下，室温培养5-8天。
所述植物组织培养各个阶段，以MS为基本培养基，按不同的激素配比设计和筛选出各阶段最适培养基，培养基中蔗糖30g/L，琼脂7.5g/L，pH值5.8～6.2(培养基用1mol/LNaOH或HCl调节)，在恒温121℃和恒压1.1个大气压下消毒灭菌20min。
本发明以‘中黄1号’茶树茎段为外植体，分阶段进行组织培养后建立茶树高频可持续植株再生体系，为茶树组培快繁和遗传转化研究提供基础，对促进茶产业的可持续健康发展具有重要意义。本发明的显著优点在于：
本发明提供的茶树茎段再生体系的构建方法，以突变性的名优茶树品‘中黄1号’的茎段作为外植体，不仅有利于保持茶树品种的遗传稳定性，还可促进茶树种质资源的保存与开发。
本发明过程中首先大规模获得无菌苗，再从中切取无菌茎段作为外植体进行再生体系诱导建立工作，在整个过程中外植体的选取不受采样季节与消毒方法的影响。
本发明愈伤组织出芽率为72.3％，移栽成活率达62.5％，可以有效解决茶树优质种苗缺乏的问题，并为后续茶树遗传转化和分子育种提供技术参考。
本发明建立的再生体系不仅具有愈伤组织诱导率高、芽再生率高、增殖方式简单、遗传稳定特点，而且愈伤组织由于酚类物质含量较低，可成为遗传转化的对象。
本发明所建立的茶树离体再生体系，经愈伤组织阶段诱导出再生植株，克服了以腋芽增殖建立的再生体系中无法进行茶树遗传转化以及茎段再生过程中仅停留在愈伤组织阶段或再生芽分化率低和重复试验效果差等问题，提供了一个高再生率和高再生系数的茶无性系再生体系。本发明建立了茶树茎段组织培养与植株高效再生体系，为茶树良种繁殖和遗传转化的研究奠定了一定的基础。
附图说明
图1为本发明‘中黄1号’无菌体系建立过程，
其中A:生长7d；B:生长14d；C:继代培养；D:生长45d；
图2为本发明愈伤组织的诱导过程，
其中A:茎段外植体；B:茎段生长7d；C:茎段生长14d；D:茎段生长20d；
图3为本发明愈伤组织诱导分化芽过程，
其中A、B:分化7d；C、D:分化14d；
图4为本发明芽生长发育过程，
其中A:愈伤组织分化出芽；B:继代培养；C:继代培养7d；D:继代培养14d；
图5为本发明壮芽过程，
其中A:继代培养30d；B:壮芽10d；C:壮芽20d后；
图6为本发明生根、炼苗及移栽过程，
其中A：生根；B、C：移栽7d。
具体实施方案
以下结合实施例具体阐述本发明申请的具体方案，所有实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1
主要设备：超净工作台；植物组织培养室；高温高压灭菌锅；pH计
试剂与材料：
1.外植体材料：‘中黄1号’茶树茎段
2.主要试剂：
1)75％乙醇：医用型75％酒精，主要用于外植体的消毒；
2)1％氯化汞(HgCl2)：称取1克氯化汞溶于1升水中，用于外植体消毒；
3)洗洁剂
4)培养基：MS培养基
5)植物激素类：市场上购买的硫酸腺嘌呤、6-苄基腺嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸(IBA)、苯基噻二唑基脲(TDZ)、α-萘乙酸(NAA)
6)市场上购买的营养土和蛭石
一种以茶树茎段为外植体建立高效再生体系的方法，具体操作步骤如下：
(1)从茶树资源圃采集4月份的‘中黄1号’茶树新梢，使用洗洁剂清洗后自来水冲洗2～3h，去除茶树表面尘垢。
(2)将外植体置于超净台内，先用75％酒精消毒1min，无菌水清洗3次，再用0.1％升汞消毒12min，无菌水清洗4次，消毒过程中不断搅动，沥干水分后切成0.5～1cm的带单腋芽茎段，在无菌状态下竖置于茶树扩繁培养基(MS+1mg/L6-BA+0.5mg/LIBA)，接种量为每40毫升培养基接5～6株，成活率为79.2％，培养2周后获得无菌苗。
(3)于植物组织培养室内取‘中黄1号’茶树扩繁苗，在超净状态下去除叶片，切为1cm左右节间茎段，横置于1/2MS+70mg/l硫酸腺嘌呤+3mg/l6-BA+0.2mg/LTDZ培养基内，接种量为每25毫升培养基接4～5个外植体，20d后愈伤组织出芽率为72.3％，愈伤组织量多、生长速度快。
(4)取20d左右生长良好的愈伤组织从茎段整体中切下，并切成直径8～10毫米的愈伤组织块，转至MS+1mg/L6-BA+1mg/LTDZ+0.2mg/LIBA培养基，接种量每25毫升培养基接6～7块。20d后芽增殖系数可达4.3，生长迅速，长势好。
(5)将分化再生芽诱导增殖出的丛生芽分切，置于MS+2mg/L6-BA+2mg/LNAA培养基，栽插量每50毫升培养基接3～4棵，目的是促进其生长发育，20d后芽粗壮，长势好。
(6)取高度约2～3cm，长势基本一致的芽移至壮芽培养基(MS+0.7mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+1mg/LIBA)，栽插量每50毫升培养基接3～4棵，45d后平均株高4.1cm，茎粗壮，长势好。
(7)取高度约5～6cm，长势良好的无根苗，去除基部愈伤组织和多余的叶片，先用100mg/L IBA浸泡不定芽基部切口处10min，再栽插入生根培养基(1/2MS+1mg/LIBA+0.1mg/LNAA)，栽插量每50毫升培养基接1棵，培养60d后生根率53.3％，平均生根数4.7。
(8)待组培苗的根长到超过3cm，叶片数达4～5片时，即可进行炼苗(自然光条件下开瓶室温炼苗7d左右)，选生长健壮且已形成良好根系的小苗洗净培养基，直接栽入基质配比为营养土：蛭石＝2：1的疏松土壤中(试验中所用土壤基质均先进行高温高压灭菌)，加强保湿，避免强光照，避免36℃以上的高温及10℃以下的低温，成活率达62.5％。
实施例2：
主要设备：超净工作台；植物组织培养室；高温高压灭菌锅；pH计
试剂与材料：
1.外植体材料：‘中黄1号’茶树茎段
2.主要试剂：
(1)75％乙醇：医用型75％酒精，主要用于外植体的消毒；
(2)1％氯化汞(HgCl2)：称取1克氯化汞溶于1升水中，用于外植体消毒；
(3)洗洁剂
(4)培养基：MS培养基
(5)植物激素类：市场上购买的硫酸腺嘌呤、6-苄基腺嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸(IBA)、苯基噻二唑基脲(TDZ)、α-萘乙酸(NAA)
(6)市场上购买的营养土和蛭石
一种以茶树茎段为外植体建立高效再生体系的方法的具体操作步骤如下：
(1)从茶树资源圃采集5月份的‘中黄1号’茶树新梢，使用洗洁剂清洗后自来水冲洗3～4h，去除茶树表面尘垢。
(2)将外植体置于超净台内，先用75％酒精消毒1min，无菌水清洗3次，再用0.1％升汞消毒15min，无菌水清洗4次，消毒过程中不断搅动，沥干水分后切成0.5～1cm的带单腋芽茎段，在无菌状态下竖置于茶树扩繁培养基(MS+1mg/L6-BA+0.5mg/LIBA)，接种量为每40毫升培养基接5～6株，成活率为68.1％，培养2周后获得无菌苗。
(3)于植物组织培养室内取‘中黄1号’茶树扩繁苗，在超净状态下去除叶片，切为1cm左右节间茎段，横置于1/2MS+50mg/l硫酸腺嘌呤+3mg/l6-BA培养基内，接种量为每25毫升培养基接4～5个外植体，20d后愈伤组织出芽率为54.6％，愈伤组织量多、生长速度快。
(4)取20d左右生长良好的愈伤组织从茎段整体中切下，并切成直径8～10毫米的愈伤组织块，转至MS+1.5mg/L6-BA+1mg/LTDZ+0.2mg/LIBA培养基，接种量每25毫升培养基接6～7块。20d后芽增殖系数可达3.5，生长加快，长势较好。
(5)将分化再生芽诱导增殖出的丛生芽分切，置于MS+2mg/L6-BA+1.5mg/LNAA培养基，栽插量每50毫升培养基接3～4棵，目的是促进其生长发育，20d后芽较粗壮，长势好。
(6)取高度约2～3cm，长势基本一致的芽移至壮芽培养基(MS+0.7mg/L6-BA+0.3mg/LNAA+1.6mg/LIBA)，栽插量每50毫升培养基接3～4棵，45d后平均株高3.7cm，茎较，长势一般。
(7)取高度约5～6cm，长势良好的无根苗，去除基部愈伤组织和多余的叶片，栽插入生根培养基(1/2MS+1mg/LIBA+0.1mg/LNAA)，培养60d后生根率25.4％，平均生根数2.3。
(8)待组培苗的根长到超过3cm，叶片数达4～5片时，即可进行炼苗(自然光条件下开瓶室温炼苗7d左右)，选生长健壮且已形成良好根系的小苗洗净培养基，直接栽入基质配比为营养土：蛭石＝2：1的疏松土壤中(试验中所用土壤基质均先进行高温高压灭菌)，加强保湿，避免强光照，避免36℃以上的高温及10℃以下的低温，成活率达62.5％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (8)
1.一种以茶树茎段为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)外植体的选择
从茶树资源圃采集4月份的‘中黄1号’茶树新梢作为外植体，清洗表面尘垢；
(2)无菌体系的建立
将外植体置于超净台内，消毒清洗，沥干水分后切成0.5～1cm的带单腋芽茎段，在无菌状态下竖置于茶树扩繁培养基，接种量为每40毫升培养基接5～6株，培养2周后获得无菌苗，所述扩繁培养基为MS+1mg/L 6-BA+0.5mg/L IBA；
(3)愈伤组织的诱导
在超净状态下将无菌苗切为1cm节间茎段，横置于诱导培养基内，接种量为每25毫升培养基接4～5个外植体，所述诱导培养基为1/2MS+70mg/l硫酸腺嘌呤+3mg/l6-BA+0.2mg/LTDZ；
(4)愈伤组织诱导分化芽
取生长良好的愈伤组织从茎段整体中切下，并切成直径8～10毫米的愈伤组织块，转至分化培养基中，接种量每25毫升培养基接6～7块，分化培养基为MS+1mg/L6-BA+1mg/LTDZ+0.2mg/LIBA；
(5)芽的生长发育
将分化再生芽诱导增殖出的丛生芽分切，置于增殖培养基，栽插量每50毫升培养基接3～4棵，增殖培养基为MS+2mg/L6-BA+2mg/LNAA；
(6)壮芽
取高度2～3cm，长势基本一致的芽移至壮芽培养基，栽插量每50毫升培养基接3～4棵，所述壮芽培养基为MS+0.7mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+1mg/LIBA；
(7)生根
取高度5～6cm长势良好的无根苗，去除基部愈伤组织和多余的叶片，先用100mg/L IBA浸泡不定芽基部切口处10min，再栽插入生根培养基，栽插量每50毫升培养基接1棵，生根培养基1/2MS+1mg/LIBA+0.1mg/LNAA；
(8)炼苗及移栽
待组培苗的根长到超过3cm，叶片数达4～5片时，进行炼苗，再选生长健壮且已形成良好根系的小苗洗净培养基，直接栽入基质配比为营养土：蛭石＝2：1的疏松土壤中；
所述步骤(1)中新梢需剪除叶片，每一节位留下叶柄保护腋芽，所述清洗为加入2-3滴洗洁剂清洗，再用自来水冲洗2～3h，浸泡过程中不断晃动。
2.如权利要求1所述的一种以茶树茎段为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于：所述消毒清洗为先用75％酒精消毒1min，无菌水清洗3次，再用0.1％升汞消毒12min，无菌水清洗4次，消毒过程中不断搅动。
3.如权利要求1所述的一种以茶树茎段为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于：其中植物组织培养的各个阶段，外植体切口处均为斜切。
4.如权利要求1所述的一种以茶树茎段为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的愈伤组织是切口处脱分化而形成的愈伤组织；所述步骤(4)中的芽是脱分化形成的愈伤组织经再分化而形成的芽。
5.如权利要求1所述的一种以茶树茎段为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于：所述步骤(4)中所述生长良好的愈伤组织的形态为质地较紧实不均匀，表面呈现红绿色隆起。
6.如权利要求5所述的一种以茶树茎段为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于：所述步骤(4)中所述生长良好的愈伤组织需在诱导培养基中培养18-22天。
7.如权利要求1所述的一种以茶树茎段为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于：其中植物组织培养各个阶段，培养条件为培养室温度25±2℃；相对湿度70％～80％；光照强度：2000lx；光周期12h/d。
8.如权利要求1所述的一种以茶树茎段为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于：所述炼苗为自然光条件下，室温培养5-8天。
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