CN107517850A - 一种甜瓜单倍体的创制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物组织培养和育种领域，公开了一种甜瓜单倍体的创制方法，包括：A、对甜瓜花粉进行灭活；B、利用辐射花粉对当日开放的甜瓜雌花进行授粉；C、选取授粉后11‑12天的子房，取出幼胚在MS培养基上进行培养；D、挑出绿色胚在诱导培养基上进行培养；E、待芽长出后，取叶片用流式细胞仪进行倍性鉴定；F、对鉴定为单倍体的植株在生根培养基上诱导生根，形成单倍体植株。本方法适用于国内薄皮类型甜瓜品种。培育的单倍体植株经过田间筛选可直接用作育种材料，应用于甜瓜品种的选育，加快甜瓜育种进程。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养和育种技术，具体涉及一种甜瓜单倍体的创制方法。
背景技术
甜瓜是重要的园艺作物之一，新品种的推广和普及对于甜瓜生产的发展具有非常重要的作用。选育优质、丰产、抗逆性强、兼抗多种甜瓜主要病害、适应性强的甜瓜品种是甜瓜育种工作的发展方向。但传统的甜瓜育种方法存在分离后代难以稳定、聚合多种目标性状难度大，育种周期长，育种效率低等问题。仅靠传统的常规育种方法和现有种质资源难于育成突破性的品种。
单倍体育种方法利用花药培养、未受精子房培养以及辐射花粉授粉诱导后胚抢救等方法诱导产生单倍体，再对单倍体进行加倍，使每个单倍体带有的单一的染色体加倍成对，成为具有正常活力、能够正常结实的纯合体，其遗传性状稳定、不再产生分离，经过筛选后可直接作为育种材料加以利用。单倍体育种具有育种周期短(从杂交到获得稳定的纯系只需要2个世代的时间)、育种效率高(单倍体的基因型和表现性一致，提高了主要性状筛选的可靠性)，是目前在很多作物上广泛采用的一种育种方法。
目前单倍体育种在水稻等禾本科作物和十字花科蔬菜上应用较多，主要是花粉等小孢子培养。葫芦科蔬菜利用小孢子培养诱导单倍体比较困难，目前应用较多的是大孢子培养。甜瓜目前采用小孢子途径没有获得过成功，现在创制甜瓜单倍体都是采用大孢子途径，包括子房离体培养、胚珠离体培养和孤雌生殖诱导单倍体胚。前两种方法诱导单倍体的成功与否以及诱导的频率影响因素多，试验难度大；而孤雌生殖诱导单倍体胚，方法相对简单，技术可重复性好，成功率高，但诱导效率不高。针对上述问题，本发明采用辐射灭活花粉诱导甜瓜孤雌生殖，然后进行胚抢救创制甜瓜单倍体，方法简单，成功率高，诱导效率高。
发明内容
本发明的目的在于解决甜瓜大孢子培养诱导甜瓜单倍体效率较低的问题，提供了一种甜瓜单倍体的创制方法，该方法简单、高效，适用于大规模推广。
为了达到上述目的，本发明采取如下技术措施：
一种甜瓜单倍体的创制方法，包括下述步骤：
1)取清晨开花前的甜瓜雄花，灭活；
以上所述的方案中，优选的，在甜瓜雄花开放当日清晨，雄花开放前，摘取雄花，装入防水纸袋，用60Coγ射线辐射300-400Gy进行灭活；
2)用步骤1)中的雄花花粉对前一日套袋隔离、当日开放的雌花进行授粉，授粉后继续对雌花进行套袋隔离；
3)在授粉后的第11或12天，摘下经过授粉的子房，将表皮清洗干净，在超净工作台上用酒精溶液浸泡后再用升汞溶液浸泡进行消毒，无菌水冲洗后，用无菌纸吸干幼果表面水分，将幼果横切成3-5mm的薄片，挑取幼胚，接种于MS培养基上；
以上所述的方案中，优选的，所述的酒精为75％体积比的酒精，浸泡时间为30-60s；所述的升汞溶液的浓度为0.1％(质量比)，浸泡时间为8-10min；无菌水冲洗3-5次；
4)在MS培养基上培养10-12天的幼胚，挑取转为绿色的胚，转到配方为MS+0.3-0.5mg/L6-BA(细胞分裂素)+2.5％-3.5％Suc(蔗糖)+0.6％-1.0％Agar(琼脂)+0.15mg/L活性炭的诱导培养基上进行诱导培养，至芽长出；所述的百分比均为质量百分比；
5)取小植株的芽或叶片0.2-0.3cm2，制备单细胞悬浮液，浓度为1.0×105-1.0×107个/mL，用流式细胞仪进行检测；
6)将检测为单倍体的植株转到配方为MS+0.3-0.5mg/L 6-BA(细胞分裂素)+0.8-1.2mg/LNAA(萘乙酸)+3％Suc(蔗糖)的生根培养基上诱导生根；所述的百分比均为质量百分比。
7)当植株根系发育适宜时，开始炼苗，先将三角瓶封口打开，置于常温下生长2-3d，然后取出植株，洗净根部培养基，放入三角瓶中，倒入清水生长3-4d，再将植株移栽到装有基质的育苗钵，遮阴2-3天后，转为正常管理。
以上所述的方案中，优选的，甜瓜品种为白富康M288，所述的基质包括:草炭：珍珠岩＝1:1，体积比。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、利用300-400GY的60Coγ射线对甜瓜花粉进行灭活，在胚抢救过程中可获得更多的绿色胚，获得的单倍体植株最多；
2、通过调整培养基中蔗糖浓度、激素水平，并添加适量活性炭，使芽诱导效率大幅提高到25～30％，单倍体植株再生诱导率大于1.15％，并且正常苗的比例最高；
3、在分化初期利用流式细胞仪快速检测胚的倍性，缩短试验周期，提高增殖效率；
4、得到的单倍体植株质量优，置于生根培养基后100％生根；
5、组培苗经过过渡培养和遮阴处理，可使组培苗的移栽成活率提高到98％以上。
具体实施方式
本发明实施例所用技术方案，如未特别说明均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
一种甜瓜单倍体育种方法，包括下述步骤：
1)甜瓜品种为白富康M288，在甜瓜雄花开放当日清晨，雄花开放前，摘取雄花，装入防水纸袋，用60Coγ射线辐射300Gy灭活；
2)用步骤1)中的雄花花粉对前一日套袋隔离、当日开放的雌花进行授粉，授粉后继续对雌花进行套袋隔离；
3)在授粉后的第12天，摘下经过授粉的子房，将表皮清洗干净，在超净工作台上用75％体积比的酒精溶液浸泡60s，再用0.1％重量比的升汞溶液浸泡10min进行消毒，无菌水冲洗5次，用无菌纸吸干幼果表面水分，将幼果横切成5mm的薄片，挑取幼胚，接种于MS培养基上；
4)在MS培养基上培养10天的幼胚，挑取肉眼可见变为绿色的胚，转到配方为MS+0.5mg/L6-BA+3％Suc+0.8％Agar的诱导培养基上，进行40天诱导培养，至芽长出，幼胚诱导效率30％，所述的百分比均为质量百分比；
5)取小植株的芽或叶片约0.2cm2,制备单细胞悬浮液，浓度为1.0×105-1.0×107个/mL，用流式细胞仪进行检测；
6)经检测，单倍体植株再生诱导率为1.35％。对检测为单倍体的植株转到配方为MS+0.5mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+3％Suc+0.15mg/L活性炭的生根培养基上诱导生根，100％可生根，转到生根培养基10天后即可开始炼苗，所述的百分比均为质量百分比；
7)炼苗时，先将三角瓶封口打开，至于常温下生长2-3d，然后取出植株，洗净根部培养基，放入三角瓶中，导入清水生长3-4d，在将植株移栽到装有基质(草炭：珍珠岩＝1:1，体积比)的育苗钵，遮阴2-3天后，转为正常管理，移栽成活率为99％。
实施例2：
一种甜瓜单倍体的创制方法，包括下述步骤：
1)甜瓜品种为白富康M288，在甜瓜雄花开放当日清晨，雄花开放前，摘取雄花，装入防水纸袋，用60Coγ射线辐射400Gy灭活；；
2)用步骤1)中的雄花花粉对前一日套袋隔离、当日开放的雌花进行授粉，授粉后继续对雌花进行套袋隔离；
3)在授粉后的第11天，摘下经过授粉的子房，将表皮清洗干净，在超净工作台上用75％体积比的酒精溶液浸泡30s，再用0.1％重量比的升汞溶液浸泡8min进行消毒，无菌水冲洗3次，用无菌纸吸干幼果表面水分，将幼果横切成3mm的薄片，挑取幼胚，接种于MS培养基上进行培养；
4)在MS培养基上培养12天的幼胚，挑取转为绿色的胚，转到配方为MS+0.3mg/L6-BA+2.5％Suc+0.6％Agar+0.15mg/L活性炭的诱导培养基上，进行40天诱导培养，至芽长出，芽诱导效率25％，所述的百分比均为质量百分比；
5)取小植株的芽或叶片0.2-0.3cm2，制备单细胞悬浮液，浓度为1.0×105-1.0×107个/mL，用流式细胞仪进行检测；
6)经检测，单倍体植株再生诱导率为1.18％。对检测为单倍体的植株转到配方为MS+0.3mg/L 6-BA+0.8mg/L NAA+3％Suc的生根培养基上诱导生根，100％生根，转到生根培养基10天后即可开始炼苗，所述的百分比均为质量百分比；
7)当植株根系发育适宜时，开始炼苗，先将三角瓶封口打开，至于常温下生长2-3d，然后取出植株，洗净根部培养基，放入三角瓶中，导入清水生长3-4d，在将植株移栽到装有基质(草炭：珍珠岩＝1:1，体积比)的育苗钵，遮阴2-3天后，转为正常管理，移栽成活率为98％。
Claims (3)
1.一种甜瓜单倍体的创制方法，包括下述步骤：
1）取清晨开花前的甜瓜雄花，灭活；
2）用步骤1）中的雄花花粉对前一日套袋隔离、当日开放的雌花进行授粉，授粉后继续对雌花进行套袋隔离；
3）在授粉后的第11或12天，摘下经过授粉的子房，将表皮清洗干净，在超净工作台上用酒精溶液浸泡后再用升汞溶液浸泡进行消毒，无菌水冲洗后，用无菌纸吸干幼果表面水分，将幼果横切成3-5mm的薄片，挑取幼胚，接种于MS培养基上；
4）在MS培养基上培养10-12天的幼胚，挑取转为绿色的胚，转到配方为MS+0.3-0.5mg/L6-BA+ 2.5%-3.5% Suc+0.6%-1.0% Agar+0.15mg/L 活性炭的诱导培养基上进行诱导培养，至芽长出；
5）取小植株的芽或叶片0.2-0.3 cm2，制备单细胞悬浮液，浓度为1.0×105-1.0×107个/mL，用流式细胞仪进行检测；
6）将检测为单倍体的植株转到配方为MS+0.3-0.5mg/L 6-BA+0.8-1.2mg/L NAA+3%Suc的生根培养基上诱导生根；
7）当植株根系发育适宜时，开始炼苗，先将三角瓶封口打开，置于常温下生长2-3d，然后取出植株，洗净根部培养基，放入三角瓶中，倒入清水生长3-4d，再将植株移栽到装有基质的育苗钵，遮阴2-3天后，转为正常管理。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的甜瓜品种为白富康M288，所述的基质包括:草炭：珍珠岩=1:1，体积比。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3）中所述的酒精为75%体积比的酒精，浸泡时间为30-60s；所述的升汞溶液的浓度为0.1%，浸泡时间为8-10 min；无菌水冲洗3-5次。
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