CN101011028B - 一种菊花单倍体育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种菊花单倍体育种的方法，本发明方法确定了单核靠边期的菊花花粉发育的外在形态学标记，取该时期的花粉经诱导愈伤组织再分化为单倍体植株。本发明采用液体培养基将花粉和花药壁共培养，提高了愈伤率和愈伤组织的分化能力。本发明为菊花品种改良和新品种选育提供有力的手段。同时，对于自交不育的菊花，花粉培养能获得单倍体和纯合二倍体，应用于杂交制种能够快速的获得优质的F1代，从而解决我国菊花种子生产的问题，具有巨大的潜在商业价值。

Description

一种菊花单倍体育种方法

技术领域

本发明涉及一种育种方法，具体涉及一种菊花的单倍体育种方法。

背景技术

随着植物组织培养技术的发展，植物细胞具有“全能性”得到了广泛证实，因此，在离体的条件下用离体的方法培养花药，人为的改变小孢子的发育途径，使其配子体发育途径终止，转向孢子体发育，通过器官发生或胚发生的途径，形成完整的单倍体植株，为人工大量生产单倍体提供了有效的手段。通过这一途径再生的单倍体植株，经自发加倍或人工诱发加倍，获得纯合二倍体植株，从而为进一步的育种和遗传研究提供有用材料。利用花药花粉培养获得单倍体进行育种是植物育种技术上的一项重大改革，它可以与目前所采用的杂交育种，人工诱变育种，远缘杂交等方法结合，用以克服这些方法中一些不足，也可直接用此法创造新的类型。利用花药培养产生单倍体植株的方法已经在许多具有经济价值和观赏价值的植物上取得了成功，这不但为植物育种家应用单倍体植物作为一种育种手段增添了一项新内容，同时也使园艺植物的有效性进一步在遗传上得到加强。因为单倍体只含有一套染色体，这套染色体存在着所有基因，所以即使隐性基因也能在表现型中得到表达。加倍的单倍体容易获得纯合的和能育的二倍体，这就有可能使人们选择满意的基因组合。

在菊花中的研究目的：菊花是自交不育的植物，因此用常规的自花授粉的方法很难获得纯合体。用菊花花粉培养单倍体植株，再加倍成纯合的二倍体植株，就可以获得十分难得的育种材料。更重要的是用菊花单倍体作为原始的育种材料，结合常规育种和转基因技术对目前正在进行的各种遗传规律的分析研究如构建遗传图谱，进行重要性状遗传基础研究，重要性状相关基因定位和分子克隆等，将对栽培菊花品种改良及优良新品种选育具有深远意义。同时，花粉培养获得单倍体和纯合二倍体，应用于杂交制种能够快速的获得优质的F1代，从而解决我国菊花种子生产的问题，具有巨大的潜在商业价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种菊花单倍体育种的方法，为菊花品种改良和新品种选育提供有力的手段。

本发明单倍体育种方法是利用花粉经过诱导愈伤后再分化为植株，从而获得菊花单倍体植株。

本发明采用菊花小孢子发育期为单核期至单核晚期的花药进行培养。菊花小孢子发育时期与花蕾的直径和小花的颜色有一定的相关性。由于不同品种之间花蕾外部形态有很大的差异，因此可以通过观察小花的颜色判断小孢子的发育时期。小花为黄色，对应的小孢子发育时期是已经形成成熟的花粉粒，小花呈白色，对应的小孢子发育时期是四分体时期。小花呈淡黄色，对应的小孢子发育时期是单核期至单核晚期，此时正是花药培养的最佳时期。

培养前在常温下接种花粉后放于低温4℃处理45-50小时，再进行常规培养，优选处理48小时。花药的愈伤组织的诱导效果显著高于其他的处理，愈伤诱导率达到22.22％。

诱导培养基为MS+BA 2.0mg/L+2，4-D 1.0mg/L+2％蔗糖(重量的百分比)。

本发明更优选地是采用液体培养基进行培养，其配方与上述培养基相同，但不含琼脂。

花药培养过程中，由于菊花的花药比较特殊，是聚药雄蕊，剥离的时候有很大的难度，很容易损伤花药壁，从而导致大量的体细胞药壁愈伤的产生，造成混倍现象。进行花粉培养试验的时候，将花药接种于不加琼脂的液体培养基中，放置于摇床上进行液体培养，使其在摇动的过程中花粉自然地散落于培养基中，这样就有效地克服了剥离花药的困难。同时，在培养过程中，不断地将散落后的花药壁挑出，也会避免花药壁组织诱导多倍体产生。在花药培养中发现，单独的接种花粉进行培养，培养一段时间以后，仍不会产生愈伤组织，只产生了一些花粉团，没有分化能力。花粉培养的初期用花药壁作为陪伴物，后期再取出，则会产生愈伤组织，且具有分化能力。因此，花粉液体培养对于菊花的花药培养是一个有效的途径。

本发明采用的分化培养基是：MS+1.0mg/L BA+0.1mg/LNAA+9％蔗糖(重量的百分比)。

上述培养在人工气候室中进行，白天26±0.5℃，晚23±0.5℃，光照时间14h/d光照强度1500lx。

通过本发明的方法培育单倍体植株，其愈伤诱导率达到21.4％，成苗率达到100％，为菊花品种改良和新品种选育提供有力的手段。同时，花粉培养获得单倍体和纯合二倍体，应用于杂交制种能够快速的获得优质的F1代，从而解决我国菊花种子生产的问题，具有巨大的潜在商业价值。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

供试材料：菊花‘东林瑞雪’(北京林大林业科技股份有限公司)

每天上午采不同大小的花蕾后，分别测量各花蕾的花蕾长、花蕾直径等形态学特征。后用镊子剥去萼片、花瓣、取出小花，放在载玻片上，剥出花药，观察花药颜色，卡宝品红染色，显微镜镜检，以确定花粉发育时期与花蕾直径和花药外观形态的相关性。由于不同品种之间花蕾外部形态有很大的差异，因此可以通过观察小花的颜色判断小孢子的发育时期。结果发现：小花为黄色，对应的小孢子发育时期是已经形成成熟的花粉粒，小花呈白色，对应的小孢子发育时期是四分体时期。小花呈淡黄色，对应的小孢子发育时期是单核靠边期，此时正是花药培养的最佳时期。

取单核靠边期的花蕾，用70％的酒精浸泡30S，然后用20％的次氯酸钠溶液消毒10分钟，用无菌水冲洗。取出小花，在解剖镜下剥出花药，去除花丝，尽量防止花药受到伤害，接种于培养皿中，用保鲜膜封口。每个培养皿接种30个花药，每个处理接种5个培养皿。重复3次。培养条件：白天26±0.5℃，晚23±0.5℃，光照时间14h/d光照强度1500lx。

基本培养基的筛选

单核靠边期的花药分别接种于(1)N6，(2)MS，(3)B5三种培养基上。每种培养基均添加0.5mg/L NAA和2mg/L BA，6％蔗糖，0.5％琼脂，pH 5.8。每个125ml三角瓶加约30ml培养基，每瓶接30-50花药，每个处理5瓶，后置于白天26±0.5℃，晚23±0.5℃，光照时间14h/d光照强度1500lx的人工气候室中进行培养，20天后开始统计各处理所形成的愈伤组织数，60天后计算出愈伤组织诱导率。

表1不同基本培养基对愈伤组织的诱导效果

Table2-4 Effect of different basic media on callus induction

基本培养基Basic medium	接种花药数(个)Numbers ofinoculated anthers	产生愈伤组织的花药数(个)Numbers of anthers inducedcallus	愈伤诱导率(％)Ratio of callusinduction
				MSN6	180150	2617	14.411.3
B5	200	19	9.5

由上表可以看出，采用MS培养基，其愈伤诱导率最高。

激素种类的筛选

根据筛选出来的基本培养基，筛选不同的激素种类。

表2含有不同激素的培养基

培养基编号Number of medium	激素种类Kind of hormone
		12345	BA2.0NAA0.22，4-D0.2BA2.0+NAA0.2BA2.0+2，4-D 0.2

表3不同激素种类对愈伤组织诱导的影响

Effect of different hormone kinds on callus induction

激素种类Kind ofhormone

接种花药数(个)Numbers ofinoculated anthers

产生愈伤组织的花药数(个)Numbers ofanthers inducedcallus

愈伤诱导率(％)Ratio of callus induction

BA2.0NAA0.22，4-D 0.2BA2.0+NAA0.2BA2.0+2，4-D 0.2

9090909090

2001012

2.2200111113.33

结果：激素种类BA与2，4-D组合花药愈伤组织诱导率最高为13.33％，其次是BA与NAA组合，诱导率是11.11％，不加生长素的诱导率最低，仅为2.22％，不加细胞分裂素，则花药培养没有。生长素及细胞分裂素都是菊花花药培养所需要的激素，从实验中可以看出，单独附加生长素或细胞分裂素，花药的诱导率都很低。结合本实验，采用BA与2，4-D组合两种激素组合来确定菊花花药启动培养的激素浓度。

激素浓度的最佳配比的筛选

表4不同激素组合对愈伤组织诱导的影响

Effect of different hormone combinations on callus induction

培养基编号Numberofmedium

2，4-D和BA浓度Concentration of 2，4-Dand BABA    2，4-D

接种花药数(个)Numbers ofinoculatedanthers

产生愈伤组织的花药数(个)Numbers ofanthersinduced callus

愈伤诱导率(％)Ratio of callusinduction

ABCDEFGH

1.01.01.01.02.02.02.02.0

0.51.01.52.00.51.01.52..0

101106558778909054

9745917156

8.916.607.275.7511.5418.8814.1511.11

细胞分裂度/生长素的比例为组织培养中摸索不同种类植物最佳培养基的首要因素。试验结果表明，诱导花药愈伤组织的激素最佳浓度组合为MS+BA 2.0mg/L+2，4-D 1.0mg/L。

低温预处理对花药愈伤组织诱导的影响

采集‘东林瑞雪’花药经消毒后，进行下面的处理，然后常规培养(诱导培养基采用MS+6-BA 2mg/l+2，4-D 1.0mg/l+2％蔗糖，培养方法同上)，每个培养皿接种30个花药。

表5低温预处理对花药愈伤组织诱导率的影响

The effect of lower temperature pretreatment on the frequency of callus induction

处理编号Treatmentnumbers	接种花药数(个)Numbers of inoculatedanthers	产生愈伤组织的花药数(个)Numbers of anthers inducedcallus	愈伤诱导率(％)Ratio of callusinduction
				123456789	894193352451112371205590	12552510590120	13.4813.127.464.084.503.7901.8222.22
10	140	0	0

1.直接进行接种，作为对照。2.接种前4℃处理12h后接种后进行常规培养。3.接种前4℃处理18h后接种后进行常规培养。4.接种前4℃处理24h后接种后进行常规培养5.4℃下低温处理5d，接种于培养基中进行常规培养。6.4℃下低温处理8d后接种，进行常规培养。7.4℃下低温处理12d后接种，进行常规培养。8.4℃下低温处理5d，接种于培养基中，然后再放于低温4℃处理48小时后取出进行常规培养9.常温下接种后放于低温4℃处理48小时后取出进行常规培养。10.4℃下低温处理12d后接种，放于低温4℃处理48小时后取出进行常规培养

由上面可以看出9)号处理，即常温下接种后放于低温4℃处理48小时后取出进行常规培养的花药的愈伤组织的诱导效果显著高于其他的处理，达到22.22％，其次为1)号直接进行接种和2)号处理接种前4℃处理12h后接种后进行常规培养，差别不大，分别为13.48％和13.12％。其余的处理诱导率均没有达到10％。 从而可以看出，低温预培养48h对菊花花药愈伤组织的诱导效果最好。

对花药进行4℃低温预培养48h，能够促进愈伤组织的形成，提高愈伤组织的诱导率。

活性碳对菊花花药愈伤组织诱导率的影响：

按上述方法取材消毒后接种在MS+6-BA 2mg/l+2，4-D1.0mg/l+2％蔗糖培养基上，设置5个处理，(1)CK，不加活性碳，(2)加0.2g/l的活性碳，(3)活性碳浓度为0.4g/l，(4)活性C浓度为0.6g/l。(5)活性碳浓度为0.8g/l。每一个培养皿里接种50个花药，每个处理重复4次，接种后培养30天按上述方法统计各处理愈伤组织诱导率。

表6不同浓度活性炭对愈伤组织诱导率的影响

Effect of different concentration of activated charcoal(AC)on the frequency of callus induction

活性碳浓度ConcentrationofAC(g/L)	处理号number		接种花药个数No.of antherinoculated		愈伤组织形成数No.of callus		愈伤组织诱导塞Ratio of callusinduction(％)
									0.00.20.40.60.8	(1)(1)(1)(1)(1)	(2)(2)(2)(2)(2)	258140150100150	23814613681163	7627000	2913000	29.4619.29	12.188.90

(1)指采集花药当天接种，(2)指采集花药进行4℃下低温处理8d后接种。

从上表可以看见活性炭比较显著的影响了菊花花药愈伤组织的产生，不加活性炭时候，均能产生愈伤组织，且诱导率比较高，采集花药当天接种的达到29.46％，采集花药进行4℃下低温处理8d后接种的为12.18％。当加入0.2g/l活性炭使花药的诱导率显著下降，采集花药当天接种的为19.29％，采集花药进行4℃下低温处理8d后接种的为8.90％，当活性炭浓度增加到0.4、0.6、0.8g/l时，则愈伤组织的诱导率为0。

在培养基中添加活性炭比较显著的影响了菊花花药愈伤组织的产生，降低了愈伤组织的诱导率。

蔗糖浓度的筛选

以MS+6-BA 2mg/l+2，4-D 1.0mg/l为基本培养基添加不同浓度的糖，1)5％，2)9％，3)12％，4)15％，5)20％，30天观察愈伤分化数。

表7不同糖浓度对愈伤组织分化的影响

Table 2-6 Effect of different concentration of sugar on callus induction

蔗糖浓度(％)concentrationofsugar	接种愈伤组织数(个)Numbers ofinoculated anthers	分化数(个)Numbers ofanthersinduced callus	愈伤分化率(％)Ratio of callusinduction
				59121520	7466788636	2261000	2.7039.3912.800

从表中可以看出：各种糖浓度以9％最好，达到39.39％。12％次之，高于15％则基本不会产生愈伤组织。

愈伤组织的分化培养

分化培养基选用MS作为基本的培养基，将花药诱导产生的愈伤组织转移到含激素不同的分化培养基上进行培养。从表可以看出，5种分化培养基都对菊花花药的愈伤组织具有一定的分化能力，但结合分化率，芽的数量和质量，确定MS+BA 1.0+NAA 0.1+9％糖为菊花‘东林瑞雪’的最佳分化培养基。

表8不同激素组合对愈伤组织分化效果的影响

Effect of different hormone combinations on callus differentiation

激素组合Combination ofhormone		接种愈伤数(个)Numbers ofinoculatedanthers	分化的愈伤组织数(个)Numbers ofcallusdifferentiation	愈伤分化率(％)Ratio of callusinduction	备注memo
						BA	NAA

11222

0.10.20.10.20.5

2545452525

2542432522

10093.3395.5610088

无玻璃化，芽多稍有玻璃化，芽较多稍有玻璃化，芽较多稍有玻璃化，芽少严重玻璃化，芽较多

实施例2

取单核靠边期的花蕾，用70％的酒精浸泡30S，然后用20％的次氯酸钠溶液消毒10分钟，用无菌水冲洗。取出小花，在解剖镜下剥出花药，去除花丝，尽量防止花药受到伤害，常温下将花药接种于不加琼脂的液体培养基中，放于低温4℃处理48小时后，放置于摇床上进行培养，使其在摇动的过程中花粉自然地散落于培养基中，培养15天，挑出花药壁，继续培养。培养条件：白天26±0.5℃，晚23±0.5℃，光照时间14h/d光照强度1500lx。培养40天，统计愈伤率21.4％。

液体培养基的配方为MS+BA 2.0mg/L+2，4-D 1.0mg/L，其不含琼脂。

将培养得到的愈伤组织接种分化培养基MS+BA 1.0mg/L+NAA0.1mg/L+9％蔗糖培养30天，得到小苗，接种MS培养基或者1/2MS培养基，生根培养20天左右，选取生根较好的试管苗，放置在温室中的遮阳棚架上，练苗3-5天，然后起苗处瓶，洗净根部培养基，移栽到培养土中，培养土为园土∶草炭∶沙＝1∶1∶1的混合土。移栽后浇透水，10天后统计成活率。成活率为100％

实施例3花粉培养植株的倍性鉴定

取花粉植株的根尖，采用染色体常规制片技术压片，用8羟基奎磷或者对二氯苯饱和溶液预处理3.5h，卡诺固定液固定2-24h，50％乙醇清洗，蒸馏水冲洗，1M的盐酸600C解离7-8min，洗去盐酸，卡宝品红染色3-5min，制片，显微镜镜检，通过染色体计数来鉴别单倍体。

取分化后的单株通过上述方法镜检，染色体计数后检测出单倍的植株，然后经天然加倍，或人工用秋水仙激素处理茎尖生长点，成为纯和二倍体。

Claims (2)

1.一种菊花单倍体育种的方法，该方法包括如下步骤：

1)取菊花‘东林瑞雪’的单核靠边期花药进行消毒处理；

2)接种愈伤组织诱导培养基，4℃低温处理48小时后，培养获得愈伤组织；

3)接种分化培养基，培养获得试管小苗；

4)筛选获得单倍体植株；

其中，所述愈伤组织诱导培养基为不含琼脂的液体培养基，其配方为MS+BA 2.0mg/L+2，4-D 1.0mg/L+2％蔗糖；

所述分化培养基为MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+9％蔗糖。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，取消毒处理后的花药，接种液体培养基，置于摇床上进行培养，使其在摇动的过程中花粉自然地散落于培养基中，培养15天，挑出花药壁，继续培养，获得愈伤组织。