CN103109736B - 一种非洲菊纯合体植株的选育方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种非洲菊纯合体植株的选育方法，属于生物技术领域。该方法通过花蕾选择、低温处理和消毒，剥取胚珠接入同一种培养基中同步进行愈伤组织诱导、幼芽分化和继代培养，将初步选择的单倍体植株进行染色体加倍，并初步选择已加倍株系进行扩繁和生根培养，田间株系内杂交，再次选择得到优良纯合体植株。本发明只用一种培养基进行胚珠的愈伤组织诱导、幼芽分化和继代增殖培养，简化了组培流程；采用室内间接鉴定和田间直接鉴定相结合的方法，省略了染色体倍性鉴定步骤，避免了单倍体植株在获取和加倍过程中由于存在嵌合体问题，造成基因型不纯合的难题，能简便快速选育和繁殖出非洲菊纯合体植株，为新品种选育提供了性状优良、稳定的自交系。

Description

一种非洲菊纯合体植株的选育方法

技术领域

本发明涉及一种非洲菊纯合体植株的选育方法，属于生物技术领域。

背景技术

非洲菊(Gerbera jamesonil Bolus)又名扶郎花，菊科大丁草属多年生草本花卉,为世界五大鲜切花之一，可用作切花生产或盆栽观赏，全世界广泛分布。因其花色绚丽,花朵硕大,花姿优美以及其特有的文化内涵深受广大消费者青睐。

目前，生产中迫切需要耐低温、耐弱光、抗病虫害的优质、高产非洲菊新品种。自交系间杂种的优势比品种间杂种优势大，而非洲菊为典型的异花授粉作物，由于长期无性繁殖，保存着基因型的高度杂合性，其性状遗传极为复杂。为了克服非洲菊品种的杂合状态，充分利用杂种优势，排除显隐性的干扰，提高选择的准确性，必须通过人工控制授粉，强迫自交，提高亲本的纯合性。通常情况下，要获得纯合的自交系，需进行多代（4～6代），甚至10代以上的自交，花费6～7年甚至8～9年的时间。

现有技术中通过花粉(花药)或未授粉子房（或胚珠）培养可得单倍体植株，经染色体加倍成为纯系，可缩短纯合体的选育时间。在许多植物中,花药或花粉培养往往是获得单倍体植株的主要途径。但由于非洲菊花器构造上的特殊性(异花授粉且在花发育过程中出现雄蕊败育)，导致花粉或花药取材困难，灭菌难度较大。因而，采用胚珠来培养非洲菊的单倍体植株，然后通过秋水仙碱加倍，获得纯合体植株。

但现有技术通过花粉(花药)或未授粉子房（或胚珠）培养获得单倍体植株，除单倍体外，还有二倍体植株和混倍体，需要进行染色体鉴定选出单倍体植株，然后通过秋水仙碱加倍，加倍后的植株中，除育种家需要的单倍体、双单倍体植株外，还包含四倍体及非整倍体等。现有的纯合体株系的选择必须在染色体加倍前进行一次单倍体植株的鉴定，加倍后再进行加倍体植株的鉴定，通常采用细胞形态鉴定法、流式细胞鉴定法、分子标记鉴定法，这些方法都存在费用高、费时长、操作程序复杂、技术性操作要求高等特点；而单纯的植株形态学鉴定法又存在鉴定不正确的问题。即使育种家按常规步骤花费大量的时间和精力来鉴别它们的基因纯合性,但是获得的纯合体植株育性和性状表现未必就符合育种家的选择目标，即使符合育种家的要求，要在短时间内也难快速获得大量植株。

因此，需有寻找一种新的成本低、实用性强、简单易行、基因型绝对纯合、能在短时间内获得具有优良性状纯合体植株的选育方法，来获得大量在遗传上具有纯合基因组的植株，为杂种优势的有效利用和构建遗传连锁图提供理想材料。

发明内容

本发明的目的是为解决现有采用组培技术进行胚珠诱导获得单倍体植株存在胚珠诱导愈伤及幼芽的诱导率低，加倍过程中由于存在嵌合体，造成基因型不纯合，染色体倍性鉴定费工、费时，单倍体加倍率低、纯合体植株鉴定与快速繁殖效果差等技术难题，提供一种简便、快速获取非洲菊优良纯合体植株的方法。

本发明提供的一种非洲菊纯合体植株的选育方法，包括以下步骤：

A、外植体的选择与预处理

①选择花序直径为3～4cm，舌状花长于萼片1～1.5cm的F1代杂交种花蕾；

②低温处理，剪切所述的花蕾的花梗，留花梗长为4～5cm，插入装有自来水的瓶中，放入3～6℃的冰箱中低温处理3～7天；

③低温处理后的花蕾进行灭菌处理，将经灭菌处理的花蕾在解剖镜下剥取外轮舌状花的胚珠作为外植体；

B、愈伤组织诱导及幼芽分化

将步骤A剥取的胚珠接入下述培养基中：

MS基本培养液

先在温度为25℃±2℃，黑暗培养15天，再转换在光照强度为1500lx～2000lx，光照时间为10h/d～12h/d，温度为25℃±2℃的条件下，同步进行愈伤组织诱导和幼芽分化培养至外植体萌发分化出1cm以上的幼芽，每个胚珠萌发的幼芽保留2个，切成苗高为0.8cm～1.2cm的单株；

C、继代培养

将步骤B的单株分株系转接在与步骤B相同的培养基中继代培养3次，光照强度为1500lx～2000lx，温度为25℃±2℃，光照时间为10h/d～12h/d，继代周期为30d；

D、单倍体株系初步选择、染色体加倍和纯合体株系的初选

与步骤A①所述的花蕾直接作为外植体，用常规植物组织培养方法获得的组培增殖苗相比，选择步骤C中植株矮小、瘦弱，叶片窄的株系为初步选择的单倍体株系，并淘汰不符合株系；每个初步选择的单倍体株系留25个芽，其中留5个芽在与步骤C相同的培养基和培养条件下继代培养作为对照株系CK，其余20个芽，切成苗高为0.8cm～1.2cm的单株接种到下述培养基中进行染色体加倍培养：

1/2MS基本培养液

在光照强度为1500lx～2000lx，温度为25℃±2℃，光照时间为10h/d～12h/d的条件下，培养5d～10d后，再次分株系转接在与步骤C相同的培养基和培养条件下继代培养3次；在每个株系中选择与加倍前的对照株系CK相比，叶片宽，叶色深的植株为初步选择的加倍体植株，同时淘汰其它植株，每个株系中初步选择的加倍体植株只保留5株进行编号，作为初选纯合体株系；

E、初选纯合体株系的保种与生根培养

每个初选纯合体株系在与步骤C相同的培养基和培养条件下增殖至20个芽时，取其中5个芽在与步骤C相同的条件下保种，其余15个芽接种到下述培养基中：

MS基本培养液

在光照强度为1500lx～2000lx，温度为25℃±2℃，光照时间为10h/d～12h/d的条件下，生根培养至基部长出4～8条根；

F、纯合体株系的田间确定

①将步骤E的生根植株移至大棚内进行常规炼苗、移栽管理至开花，用常规杂交技术进行株系内杂交；

②淘汰不能产生可散粉花药或接受花粉后不能够正常结实的株系；

③淘汰结实正常但杂交F1代出现性状分离的株系；

④保留结实正常且杂交F1代未出现性状分离的株系即为确定的纯合体株系；用与步骤C相同的培养基和培养条件下扩繁E步骤保种的与F步骤确定的纯合体株系有相同编号的株系，即获得非洲菊纯合体植株。

步骤A③所述的低温处理后的花蕾进行灭菌处理可以是将低温处理后的花蕾先用洗衣粉水清洗，后用清水冲洗，在超净环境下，用质量分数为0.1%的氯化汞溶液中消毒15min，再放入下述混合液中消毒10min，之后用无菌水冲洗5次，每次1min，即获得经灭菌处理的花蕾；所述的混合液为：每100ml质量分数为2%的次氯酸钠溶液中滴加2滴吐温20。

所述的非洲菊纯合体植株的选育方法，还包括在步骤F得到的纯合体株系中根据育种目标，从中选择所需株系，取在步骤E保种的与所需株系相同编号的株系，在与C步骤相同的培养基和培养条件下扩繁至达到所需基数时，再用与步骤E相同的培养基和培养条件下进行生根培养，即获得所需数量且目标性状符合育种目标的纯合体植株。

上述非洲菊纯合体植株的选育方法，如下步骤可以是：

步骤A②低温处理中冰箱温度为4℃，低温处理5天；

步骤B中所述的培养基为：

MS基本培养液

先在温度为25℃，黑暗培养15天，再转换在光照强度为1800lx，光照时间为11h/d，温度为25℃的条件下，同步进行愈伤组织诱导和幼芽分化培养；

步骤C继代培养中将步骤B的单株分株系转接在与步骤B相同的培养基中继代培养3次，光照强度为1800lx，温度为25℃，光照时间为11h/d，继代周期为30d；

步骤D单倍体株系初步选择及染色体加倍和纯合体株系的初选中进行染色体加倍培养所述的培养基为：

1/2MS基本培养液

在光照强度为1800lx，温度为25℃，光照时间为11h/d的条件下进行染色体加倍，培养8d后，再次分株系转接在与步骤C相同培养基和培养条件下继代培养3次；

步骤E中进行生根培养所述的培养基为：

MS基本培养液

在光照强度为1800lx，温度为25℃，光照时间为11h/d的条件下生根培养。

与现有技术相比，本发明方法在经过大量实验、探索和深入研究的基础上，对现有技术的整个工艺流程进行了如下大量改进，只用一种培养基进行胚珠的愈伤组织诱导、幼芽分化和继代增殖培养，简化了组培流程；选择最佳的花蕾大小，通过低温处理和暗培养处理，采用最佳条件，加上适宜的培养基，大大提高了胚珠幼芽的诱导率，采用室内间接鉴定和田间直接鉴定相结合的方法选育纯合体株系，提高了纯合体植株选择的准确性，省略了染色体倍性鉴定的复杂工序，避免了现有单倍体植株在获取和加倍过程中由于存在嵌合体问题，造成基因型不纯合的难题，节约了成本，克服了目前非洲菊品种的杂合状态复杂，难于充分利用杂种优势的缺陷和不足，各步骤为获得既不浪费而又能确保选育纯合体植株的基本数量环环相扣地控制各步工艺参数，提高了纯合体植株的选择效率，同时也节省了成本，行之有效、使整个工序操作简便、快速、易于掌握和实施，2～3年内即可获得纯合的自交系，在短时间内即能简便快速选育和繁殖大量具有优良性状纯合体植株，为新品种选育提供大量可育的、性状优良、稳定的自交系植株。本发明提供了一种简便、快速、有效、操作实用性强的系统、完整的非洲菊纯合体植株的选育方法。本发明还有利于育种家安排育种计划，提高了纯合体植株的利用价值。

1、本发明对整个工艺中的关键环节进行改进，只用一种培养基行之有效地同步进行胚珠的愈伤组织诱导、幼芽分化和继代增殖培养，减少了培养基种类，简化了组培流程。

2、本发明通过大量实验，选择F1代杂交种花蕾，可以获得广泛变异的单倍体株系；选用最佳的花蕾大小，通过低温处理和暗培养处理，采用最佳条件，加上适宜的培养基，60天内，胚珠诱导成芽的比例率达28～40%（100个胚珠中有28～40个胚珠诱导成芽，其中有部分胚珠未经过愈伤诱导步骤而直接诱导出幼芽，诱导成芽的最短时间为28天）；同时本发明采用在培养基中进行染色体加倍方法，使用较小体积的处理材料、通过独特的染色体加倍培养基配方及较长的诱导时间，使植株变异率达60～80%，提高了纯合体植株的选择效率。

3、本发明通过步骤D的单倍体株系和纯合体株系的两次室内植株间接鉴定初选和步骤F的一次田间直接鉴定复选相结合，既省略了常规染色体倍性鉴定费用高、费时长、操作程序复杂、技术性操作要求高的缺陷和步骤，同时又易于操作和掌握、节约了土地资源；2～3年内获得纯合的自交系，缩短了纯合体植株的选择时间和育种年限；提高了纯合体植株选择的准确性；节约了大量人力、物力。

4、本发明采用株系选择前均分株系继代，且连续继代3次（步骤C、步骤D），使植株性状较为一致和稳定，避免了单倍体植株在获取和加倍过程中由于存在嵌合体问题，造成基因型不纯合的难度，提高了目标纯合体植株选择的准确性和有效性。

5、本发明在步骤F纯合体植株一经鉴定后，即可回到步骤C和步骤E，在与步骤C相同的培养基和相同的培养条件下，进行继代和大量繁殖步骤E中保种的与所选株系相同编号的株系，30天为一个周期，繁殖倍数可达3～5，缩短了非洲菊优良自交系的快速扩繁周期，选育的自交系材料的繁殖不受季节限制，短时内可大量繁殖纯合体植株，为新品种选育提供大量可育的自交系植株，有利于育种家安排育种计划，提高了纯合体植株的利用价值。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1

A、外植体的选择与预处理：

①选择花序直径为3～4cm，舌状花长于萼片1～1.5cm的F1代杂交种花蕾；

②低温处理，剪切所述的花蕾的花梗，留花梗长为4～5cm，插入装有自来水的瓶中，放入3℃的冰箱中低温处理7天；

③将冰箱内取出的花蕾先用洗衣粉水清洗，后用清水冲洗干净，在超净环境下，用质量分数为0.1%的氯化汞溶液中消毒15min，再放入下列混合液中消毒10min，之后用无菌水冲洗5次，每次1min，即获得经灭菌处理的花蕾；所述的混合液为：每100ml质量浓度为2%的次氯酸钠溶液中滴加2滴吐温20。将获得经灭菌处理的花蕾在解剖镜下剥取花蕾中外轮舌状花的胚珠作为外植体。

B、愈伤组织诱导及幼芽分化：

将A步骤剥取的胚珠接入下述培养基中：

MS基本培养液

先在温度为23℃，黑暗培养15天，再转换在光照强度为1500lx，光照时间为12h/d，温度为23℃的条件下，同步进行愈伤组织诱导和幼芽分化培养至外植体萌发分化出1cm以上的幼芽，60天内，胚珠诱导成芽的比例率达40%（100个胚珠中有40个胚珠诱导成芽），每个胚珠萌发的幼芽保留2个，切成苗高为0.8cm～1.2cm的单株；

C、继代培养

将步骤B的单株分株系转接在与步骤B相同的培养基中继代培养3次，光照强度为1500lx，温度为23℃，光照时间为12h/d。继代周期为30d，增殖倍数可达3倍；

D、单倍体株系初步选择、染色体加倍和纯合体株系的初选

与步骤A①所述的花蕾直接作为外植体，用常规植物组织培养方法获得的组培增殖苗相比，选择步骤C中植株矮小、瘦弱，叶片窄的株系为初步选择的单倍体株系，并淘汰不符合株系；每个初步选择的单倍体株系留25个芽，其中留5个芽在与步骤C相同的培养基和相同的培养条件下继代培养作为对照株系CK，其余20个芽，切成苗高为0.8cm～1.2cm的单株接种到下述培养基中进行染色体加倍培养：

1/2MS基本培养液

在光照强度为1500lx，温度为23℃，光照时间为12h/d的条件下进行染色体加倍，培养10d后，再次分株系转接在与步骤C相同的培养基和相同的培养条件下继代培养3次，在每个株系中选择与加倍前的对照株系CK相比，叶片宽，叶色深的植株为初步选择的加倍体植株，植株变异率达60%；同时淘汰其它植株，每个株系中初步选择的加倍体植株只保留5株进行编号，作为初选纯合体株系；

E、初选纯合体株系保种与生根培养：

每个初选纯合体株系在与步骤C相同的培养基和相同的培养条件下增殖至20个芽时，取其中5个芽在与步骤C相同的培养条件下保种（保种采用与步骤C相同的培养基和相同的培养条件，40天为一个周期），其余15个芽接种到下述培养基中：

MS基本培养液

在光照强度为1500lx，温度为23℃，光照时间为12h/d的条件下，生根培养至基部长出4～8条根；

F、纯合体株系的田间确定：

①将步骤E的生根植株移至大棚内进行常规炼苗、移栽管理至开花，用常规杂交技术进行株系内杂交（同一株系的不同单株作为父、母本进行杂交）。

②淘汰不能产生可散粉花药或接受花粉后不能够正常结实的株系，由此可淘汰步骤D加倍不成功未能及时淘汰的单倍体株系或育性不良的株系；

③淘汰结实正常但杂交F1代出现不同性状，出现了与父、母本的性状不相同的性状表现，即F1代出现性状分离的株系，由此可淘汰因步骤D单倍体选择错误未能淘汰的杂合体（基因型杂合）株系；

④保留结实正常且杂交F1代的各性状与父、母本的性状表现完全一致，即F1代未出现性状分离的株系即为确定的纯合体株系。这些株系即为育性正常、基因型纯合的自交系。用与C步骤相同的培养基和相同的培养条件下扩繁E步骤保种的与F步骤④确定的纯合体株系有相同编号的株系，即获得非洲菊纯合体植株。

根据育种需要（目标），从中选择所需株系，取在步骤E保种的与所需株系相同编号的株系，在与步骤C相同的培养基和相同的培养条件下，快速扩繁达到所需基数时，再用与步骤E相同的培养基和相同的培养条件下进行生根培养，即获得大量（或育种所需数量）且目标性状符合育种需要（目标）的非洲菊纯合体植株。

实施例2

实施例2除以下操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

A、外植体的选择与预处理

②低温处理中冰箱的温度为6℃，低温处理3天；

B、愈伤组织诱导及幼芽分化的培养基为：

MS基本培养液

先在温度为27℃，黑暗培养15天，再转换在光照强度为2000lx，光照时间为10h/d，温度为27℃的条件下，同步进行愈伤组织诱导和幼芽分化培养至外植体萌发分化出1cm以上的幼芽，60天内，胚珠诱导成芽的比例率达28%（100个胚珠中有28个胚珠诱导成芽）。

C、继代培养

继代培养的光照强度为2000lx，温度为27℃，光照时间为10h/d，继代周期为30d，增殖倍数可达到5倍。

D、单倍体株系初步选择、染色体加倍和纯合体株系的初选

进行染色体加倍培养所述的培养基为：

1/2MS基本培养液

在光照强度为2000lx，温度为27℃，光照时间为10h/d的条件下进行染色体加倍，培养5d后，再次分株系转接在与步骤C相同培养基和相同的条件下继代培养3次，植株变异率达80%。

E、初选纯合体株系保种与生根培养：

进行生根培养的培养基为：

MS基本培养液

在光照强度为2000lx，温度为27℃，光照时间为10h/d的条件下生根培养。

实施例3

实施例3除以下操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

A、外植体的选择与预处理：

②低温处理中冰箱的温度为4℃，低温处理5天。

B、愈伤组织诱导及幼芽分化的培养基为：

MS基本培养液

先在温度为25℃，黑暗培养15天，再转换在光照强度为1800lx，光照时间为11h/d，温度为25℃的条件下，同步进行愈伤组织诱导和幼芽分化培养至外植体萌发分化出1cm以上的幼芽，60天内，胚珠诱导成芽的比例率达36%（100个胚珠中有36个胚珠诱导成芽）。

C、继代培养：

继代培养的光照强度为1800lx，温度为25℃，光照时间为11h/d，继代周期为30d。增殖倍数可达4倍。

D、单倍体株系初步选择、染色体加倍和纯合体株系的初选

进行染色体加倍培养所述的培养基为：

1/2MS基本培养液

在光照强度为1800lx，温度为25℃，光照时间为11h/d的条件下进行染色体加倍，培养8d后，再次分株系转接在与步骤C相同培养基和相同的条件下继代培养3次，植株变异率达72%。

E、初选纯合体株系保种与生根培养

进行生根培养所述的培养基为：

MS基本培养液

在光照强度为1800lx，温度为25℃，光照时间为11h/d的条件下生根培养。

Claims (3)

1.一种非洲菊纯合体植株的选育方法，包括以下步骤：

   A、外植体的选择与预处理

①选择花序直径为3～4cm，舌状花长于萼片1～1.5cm的F1代杂交种花蕾；

②低温处理，剪切所述的花蕾的花梗，留花梗长为4～5cm，插入装有自来水的瓶中，放入3～6℃的冰箱中低温处理3～7天；

③低温处理后的花蕾进行灭菌处理，将经灭菌处理的花蕾在解剖镜下剥取外轮舌状花的胚珠作为外植体；

B、愈伤组织诱导及幼芽分化

将步骤A剥取的胚珠接入下述培养基中：

MS基本培养液

6-苄胺基嘌呤       0.3～1.0 mg/L

萘乙酸             0.05～0.1 mg/L

蔗糖               30000mg/L

琼脂               6500mg/L

pH                5.8～6.0；

先在温度为25℃±2℃，黑暗培养15天，再转换在光照强度为1500lx～2000lx，光照时间为10h/d～12h/d，温度为25℃±2℃的条件下，同步进行愈伤组织诱导和幼芽分化培养至外植体萌发分化出1cm以上的幼芽，每个胚珠萌发的幼芽保留2个，切成苗高为0.8cm～1.2cm的单株；

C、继代培养

将步骤B的单株分株系转接在与步骤B相同的培养基中继代培养3次，光照强度为1500lx～2000lx，温度为25℃±2℃，光照时间为10 h/d～12h/d，继代周期为30d；

D、单倍体株系初步选择、染色体加倍和纯合体株系的初选

与步骤A①所述的花蕾直接作为外植体，用常规植物组织培养方法获得的组培增殖苗相比，选择步骤C中植株矮小、瘦弱，叶片窄的株系为初步选择的单倍体株系，并淘汰不符合株系；每个初步选择的单倍体株系留25个芽，其中留5个芽在与步骤C相同的培养基和培养条件下继代培养作为对照株系CK，其余20个芽，切成苗高为0.8cm～1.2cm的单株接种到下述培养基中进行染色体加倍培养：

1/2 MS基本培养液             

6-苄胺基嘌呤        0.3mg/L

秋水仙碱            0.2～0.5mg/L

蔗糖                30000mg/L

琼脂                6500 mg/L

 pH                 5.8～6.0；

在光照强度为1500lx～2000lx，温度为25℃±2℃，光照时间为10h/d～12h/d的条件下，培养5d～10d后，再次分株系转接在与步骤C相同的培养基和培养条件下继代培养3次；在每个株系中选择与加倍前的对照株系CK相比，叶片宽，叶色深的植株为初步选择的加倍体植株，同时淘汰其它植株，每个株系中初步选择的加倍体植株只保留5株进行编号，作为初选纯合体株系；

E、初选纯合体株系的保种与生根培养

每个初选纯合体株系在与步骤C相同的培养基和培养条件下增殖至20个芽时，取其中5个芽在与步骤C相同的条件下保种，其余15个芽接种到下述培养基中：

MS基本培养液

萘乙酸              0.05～0.2 mg/L

吲哚丁酸            0.1～0.3mg/L

蔗糖                30000mg/L

琼脂                6500mg/L

pH                  5.8～6.0；

在光照强度为1500lx～2000lx，温度为25℃±2℃，光照时间为10h/d～12h/d的条件下，生根培养至基部长出4～8条根；

F、纯合体株系的田间确定

①将步骤E的生根植株移至大棚内进行常规炼苗、移栽管理至开花，用常规杂交技术进行株系内杂交；

 ②淘汰不能产生可散粉花药或接受花粉后不能够正常结实的株系；

③淘汰结实正常但杂交F1代出现性状分离的株系；

④保留结实正常且杂交F1代未出现性状分离的株系即为确定的纯合体株系；用与步骤C相同的培养基和培养条件下扩繁E步骤保种的与F步骤确定的纯合体株系有相同编号的株系，扩繁至达到所需基数时，再用与步骤E相同的培养基和培养条件下进行生根培养，即获得非洲菊纯合体植株。

2.根据权利要求1所述的非洲菊纯合体植株的选育方法，步骤A③所述的低温处理后的花蕾进行灭菌处理是将低温处理后的花蕾先用洗衣粉水清洗，后用清水冲洗，在超净环境下，用质量分数为0.1%的氯化汞溶液中消毒15min，再放入混合液中消毒10min，之后用无菌水冲洗5次，每次1min，即获得经灭菌处理的花蕾；所述的混合液为：每100ml质量分数为2%的次氯酸钠溶液中滴加2滴吐温20。

3.根据权利要求1或2所述的非洲菊纯合体植株的选育方法，其特征在于：

步骤A②低温处理中冰箱温度为4℃，低温处理5天；

步骤B中所述的培养基为：

MS基本培养液

6-苄胺基嘌呤       0.6mg/L

萘乙酸             0.08mg/L

蔗糖               30000mg/L

琼脂               6500mg/L

pH                5.9；

先在温度为25℃，黑暗培养15天，再转换在光照强度为1800lx，光照时间为11h/d，温度为25℃的条件下，同步进行愈伤组织诱导和幼芽分化培养；

步骤C继代培养中将步骤B的单株分株系转接在与步骤B相同的培养基中继代培养3次时光照强度为1800lx，温度为25℃，光照时间为11h/d，继代周期为30d；

步骤D单倍体株系初步选择及染色体加倍和纯合体株系的初选中进行染色体加倍培养所述的培养基为：

1/2 MS基本培养液             

6-苄胺基嘌呤        0.3mg/L

秋水仙碱            0.3mg/L

蔗糖                30000mg/L

琼脂                6500 mg/L

 pH                 5.9；

在光照强度为1800lx，温度为25℃，光照时间为11h/d的条件下进行染色体加倍，培养8d后，再次分株系转接在与步骤C相同培养基和培养条件下继代培养3次；

步骤E中进行生根培养所述的培养基为：

 MS基本培养液

萘乙酸              0.1mg/L

吲哚丁酸            0.2mg/L

蔗糖               30000mg/L

琼脂               6500mg/L

pH                 5.9；

在光照强度为1800lx，温度为25℃，光照时间为11h/d的条件下生根培养。