CN104026017B - 玉米单倍体植株的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植株单倍体的培育方法，尤其涉及一种玉米单倍体幼胚培养成单倍体植株的方法，其以玉米单倍体幼胚为受体材料，将其诱导为愈伤组织，并将该愈伤组织接种于继代培养基，采用光暗培养的方法进行光照鉴定，筛选出未变色的愈伤组织作为拟单倍体愈伤组织，进行分化和生根培养得到玉米单倍体植株。本发明利用玉米单倍体幼胚获得玉米单倍体植株，通过光照培养进行单倍体愈伤组织的鉴定，该鉴定方法简单易行，降低了鉴定成本；该培育方法建立了单倍体植株的稳定高效的组织培养体系，可广泛用于玉米的遗传再生、组织培养、材料选育等方面。

Description

玉米单倍体植株的培育方法

技术领域

本发明涉及植株单倍体的培育方法，尤其涉及一种玉米单倍体幼胚培养成单倍体植株的方法。

背景技术

玉米是世界上主要的粮食、饲料和经济作物，1998年以来，玉米的总产量超过水稻和小麦，居世界首位，但是全球玉米需求持续增长，尤其是亚洲地区；我国玉米长期以来存在需求量大、供求不足的问题，因此，当务之急应开发高产、优质、多抗的玉米新品种。

玉米是雌雄同株异花、进行有性生殖的作物，是研究遗传学、基因组学和分子生物学的理想的单子叶模式植物。通过常规的杂交育种获得纯合的株系需要漫长的育种周期。为了获得纯合的玉米株系，研究者以往采用选育玉米自交系的方法，但是玉米自交系的培育，必须经过多代的自交和选择，选育一个品种的年限很长。因此，研究者一直致力于如何缩短选育玉米自交系的时间，提高育种效率。

随着生物技术的迅速发展和不断完善,越来越多的研究和新品种的产生采用基因工程手段来进行作物遗传改良和新物种的创造。目前，植物基因转化多以成熟胚、幼胚或其诱导的愈伤组织、丛生芽及原生质体等二倍体材料作为受体。这些材料来源相对较广泛，转化效率较高，生活力较强，但由于外源基因在转化所得的阳性植株中易发生丢失和沉默或多以杂合状态存在，导致遗传稳定性下降或形成嵌合体，由此要得到纯合株系，至少需要培育5-7代，即4-6年的时间，导致需要消耗大量的人力和时间。而单倍体材料只有一套染色体，以单倍体为转基因受体，避免了等位基因分离,单倍体植株或组织器官经加倍即可得到纯合的二倍体植株，可使外源基因在后代中迅速纯合并稳定遗传，即培育2个世代就可以获得纯合株系，明显缩短育种年限。因此，以单倍体为受体的转基因育种技术越来越受到关注，且以单倍体植株或组织器官作为转基因受体已经成功的应用于烟草、水稻等多种植物中。

转基因育种需要建立优良的再生体系作为遗传转化的基础，因此，对于研究以单倍体为受体的转基因育种技术，首先需要建立一套成熟的遗传再生体系。目前，国内外许多研究中虽已获得了大量以单倍体为受体的玉米转基因植株，但大部分都是经大量且多次重复实验后仅得到几个转基因植株后代，尤其是以小孢子、花药等组织为转化受体的材料，其存在愈伤组织诱导率低、愈伤组织器官分化率低等问题，导致其转化效率不到1％，远不能达到生产应用的标准。由此可知，现阶段迫切需要一种能提高材料转化效率、缩短转化时间的转化受体，该转化受体为玉米单倍体植株培养的关键。

玉米单倍体植株培养的另一关键是单倍体的鉴定效率。目前，玉米单倍体的鉴定方法主要有形态鉴别法及遗传标记法等，但在实践中，以上鉴定方法由于不同材料的表达差别以及不同的环境条件对表达的影响，对鉴定结果有较大差别。因此迫切需要开发出一种新的高效、准确的单倍体鉴定方法。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种采用玉米单倍体幼胚为受体材料，培养成愈伤组织后进行单倍体鉴定，最后培养为玉米单倍体植株的方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种玉米单倍体植株的培育方法，包括以下步骤：

(1)首先获取玉米单倍体幼胚，取授粉后10-14d的玉米幼穗，从玉米幼穗的籽粒中挑取玉米幼胚；随后将玉米幼胚接种于诱导培养基，(26±2)℃暗培养20d，后得到愈伤组织；

(2)其次进行第一次继代培养和第一次倍性鉴定，将得到的所述愈伤组织进行光暗周期培养，光照强度2000-2500lx，光照时间14h+暗培养10h，筛选未变色的愈伤组织作为拟单倍体Ⅰ愈伤组织；随后将所述的拟单倍体Ⅰ愈伤组织继代培养数次，筛选出准单倍体愈伤组织，并对其继续继代培养数次；

(3)再次进行分化培养和生根培养，将得到的所述准单倍体愈伤组织接种于分化培养基中培养，得到玉米单倍体幼苗，随后将玉米单倍体幼苗转移到生根培养基中，培养得到完整的植株。

较佳地，所述单倍体Ⅱ型愈伤组织的分化及再生方法具体为：将Ⅱ型愈伤组织转到分化培养基中，28℃暗培养7d后，转到相同温度下每天12～16h的光照培养，待愈伤组织上长出绿色芽后，将愈伤组织转入分化培养瓶中光照强度为1500～2000lx，日光灯照明，培养成苗。当幼苗长大到3～5cm时，从幼苗基部将小苗分成单株，不要损伤生长点，转移到生根培养基上，在28℃光照培养，2～3周后小植株长出大量的根，形成完整的植株。植株长到约10cm时，打开培养瓶瓶盖，加入无菌水没过培养基，光照培养2d后再取出，洗净粘在根系上的培养基，炼苗(炼苗用的土∶蛭石的比例为3∶1)，炼苗时用蒸馏水保湿。待植株适应外界环境、健康生长后，将其转移到育种基地，育成完整的植株个体。

较佳地，所述“将所述的拟单倍体Ⅰ愈伤组织继代培养数次，筛选出准单倍体愈伤组织”包括第二次继代培养和第二次倍性鉴定，具体为将所述拟单倍体Ⅰ愈伤组织接种于继代培养基上培养，培养完成后进行第二次倍性鉴定，筛选出拟单倍体Ⅱ愈伤组织后继续进行继代培养，得到准单倍体愈伤组织；其中所述第二次倍性鉴定为染色体压片观察鉴定。

具体地，所述染色体压片观察鉴定方法为：取1mm左右的拟单倍体Ⅰ愈伤组织继代培养后的愈伤组织材料浸泡在α-溴奈中进行预处理，以药液浸没该愈伤组织为度，处理3～4h。愈伤组织经预处理后，用流水冲洗，然后投入卡诺液(3份甲醇∶1份冰乙酸，现配现用)中固定3d，用95％的乙醇洗两次，转入70％乙醇中保存备用。从70％乙醇中取出固定好的愈伤组织，流水冲洗7min，吸水纸吸干；放入盛有适量1mol/L HCl，60℃的离心管中水浴保温，解离10min。解离后材料水洗5min并吸干，取0.2mm左右的愈伤组织于载玻片上压碎打散，滴加1～2滴卡宝品红染液，染色10～15min，压片。在经染色的材料上加一滴染液，盖上盖玻片，覆一层吸水纸，用带橡皮头的铅笔垂直敲打，或以拇指垂直紧压盖片(注意勿使盖片搓动)，使材料分散压平。使用OLYMPUS相差显微镜进行观察和记录，筛选出拟单倍体Ⅱ材料。

较佳地，所述“将所述的拟单倍体Ⅰ愈伤组织继代培养数次，筛选出准单倍体愈伤组织”还包括第三次继代培养和第三次倍性鉴定，具体为将所述拟单倍体Ⅱ愈伤组织接种于继代培养基上培养，培养完成后进行第三次倍性鉴定，筛选出准单倍体愈伤组织；其中所述第三次倍性鉴定具体为流式细胞仪检测鉴定。

具体地，所述流式细胞仪检测鉴定方法为：取拟单倍体Ⅱ愈伤组织材料继代培养后的愈伤组织1g，分别在1m L中Otto I buffer(pH2.3的0.1mol/L柠檬酸+0.5％(v/v)Tween20)用锋利的刀片切碎、过滤、收集滤液，经5000r/min离心5min后，弃上清至100m L,再加入100m L Otto I buffer于4℃保存。加入OttoⅡbuffer(pH＝8.9的0.4mol/LNa₂HPO₄·12H₂O)和RNase后，用PI(Propidium iodide碘化丙啶，50mg/mL)染液对细胞核DNA进行荧光标记，置于暗处30min后，用流式细胞仪进行植株倍性鉴定。采用美国BD公司的FACSCalibur流式细胞仪(flow cytometry)进行倍性检测，并用cellQuest(BD公司)软件获取数据，ModFit软件(Yeritv Software House公司)分析结果，得到准单倍体愈伤组织。

较佳地，所述分化培养的培养基是在N6基本培养液中添加酸水解酪蛋白、L-脯氨酸、2,4－二氯苯氧乙酸、激动素、6-苄氨基腺嘌呤、脱落酸、萘乙酸、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；其中所述碳源为蔗糖、葡萄糖、麦芽糖中的一种或几种，所述凝胶剂为琼脂、卡拉胶中的一种；其他组分的浓度为：激动素为0.2～1mg/L，6-苄氨基腺嘌呤为0.5～2mg/L，脱落酸为0.2～1mg/L，2,4－二氯苯氧乙酸为0.2～1mg/L，萘乙酸为0.1～1mg/L。更优地，所述激动素的浓度为0.5mg/L，所述6-苄氨基腺嘌呤的浓度为0.5mg/L，所述脱落酸的浓度为0.5mg/L，所述2,4－二氯苯氧乙酸的浓度为1mg/L，所述萘乙酸的浓度为0.1mg/L。

较佳地，所述诱导培养基在N6基本培养液的基础上添加2，4－二氯苯氧乙酸、酸水解酪蛋白、L－脯氨酸、碳源和凝胶剂得到的固体培养基，pH为6.0。更优地，所述诱导培养基中2，4－二氯苯氧乙酸的浓度为2.0mg/L，酸水解酪蛋白的浓度为500mg/L，L－脯氨酸的浓度为1.38g/L。

较佳地，所述继代培养基为在N6基本培养液的基础上添加2,4－二氯苯氧乙酸、酸水解酪蛋白、L－脯氨酸、甘露醇、碳源和凝胶剂得到的固体培养基，pH为6.0；更优地，所述继代培养基中2,4－D的浓度为1.5mg/L，酸水解酪蛋白的浓度为500mg/L，L－脯氨酸的浓度为690mg/L，甘露醇的浓度为20g/L。

较佳地，所述生根培养的培养基为在1/2MS培养液的基础上添加生根粉、烯效矬、碳源和凝胶剂得到的固体培养基，pH为6.0；较优地，所述生根培养基中生根粉的浓度为1mg/L，烯效矬的浓度为0.5mg/L。

以上培养基中的所述碳源为蔗糖，其浓度为30g/L，所述凝胶剂为琼脂粉，浓度为5g/L，以上培养液均在121℃高压灭菌15min。

较佳地，所述玉米单倍体幼胚的来源为以玉米孤雌生殖诱导系EDI为父本，优良自交系18-599R为母本，杂交授粉10-14d后玉米幼穗中的籽粒。

玉米遗传再生及再生的受体材料主要有幼胚和非幼胚类型，其中前者包括幼胚或幼胚诱导的胚性愈伤组织，后者包括茎尖组织直接分化再生和成熟胚、叶片、茎段、胚芽鞘等诱导的胚性愈伤组织。幼胚和幼胚诱导的胚性愈伤组织是玉米再生及转化中最常用的受体材料，其遗传转化程序简单、成熟，植株再生能力较强，培养过程比较容易。胚芽鞘和成熟胚的优点在于不受季节限制，但其诱导和再生效率明显较低，且转化效率低。相较于胚芽鞘和成熟胚，玉米幼胚在授粉后10～15d即可进行取材培养，且再生能力最强,能够形成较好的适合遗传转化的II型愈伤组织，可以在时间上缩短育种周期。而胚芽鞘和成熟胚的取材时间明显晚于幼胚，再生能力也不如幼胚，因此幼胚优于其他组织。

本发明具有以下积极的效果：

(1)为实现发明目的，本发明使用单倍体玉米幼胚作为实验材料，结合光照筛选、染色体压片技术、流式细胞仪检测技术，遗传再生成单倍体植株，来达到建立玉米单倍体遗传再生体系的目的，该方法从形态、组织和细胞水平上实现玉米单倍体的鉴定，为单倍体遗传转化打下基础，实现缩短育种周期的效果。

(2)本发明的方法操作简单可行，与二倍体幼胚、单倍体花药、小孢子培养和其他玉米组织培养的方法相比，玉米单倍体幼胚的组织培养具有明显时间优势和突破性特点，可实现缩短育种周期，另外玉米幼胚的再生能力明显高于其他部位，具有提高转化效率的优势，对于玉米基因工程方面的理论研究以及遗传育种实践均具有重要意义。

附图说明

图1为EDI与18-599R杂交果穗幼胚诱导培养及产生的胚性愈伤组织；

图2为愈伤组织的光照观察结果；

图3为单倍体和二倍体愈伤组织染色体压片观察结果；

图4为单倍体和二倍体愈伤组织流式细胞仪检测结果；

图5为三次倍性鉴定的筛选结果；

图6为幼胚中的单倍体检测结果；

图7为准单倍体Ⅱ型愈伤组织的分化与成苗结果；

图8为准单倍体Ⅱ型愈伤组织的分化与成苗率；

图9为炼苗并获得的单倍体植株。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步的详细说明。

一、材料

母本：玉米优良自交系18-599R

父本：玉米孤雌生殖诱导系EDI

以上父本和母本均由四川农业大学玉米研究所提供，材料于2012年10月种植于云南省西双版纳。

二、培养基组成及浓度

诱导培养基：N6基本培养液+2,4－二氯苯氧乙酸(2,4－D)(2.0mg/L)+酸水解酪蛋白500mg/L+L－脯氨酸1.38g/L；

继代培养基：N6基本培养液+2,4－二氯苯氧乙酸(2,4－D)(1.5mg/L)+酸水解酪蛋白500mg/L+L－脯氨酸690mg/L+甘露醇20g/L；

分化培养基：N6基本培养液+激动素(KT)(0.5mg/L)+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)(0.5mg/L)+脱落酸(ABA)(0.5mg/L)+2,4－二氯苯氧乙酸(2,4-D)(1mg/L)+萘乙酸(NAA)(0.1mg/L)++酸水解酪蛋白100mg/L+L－脯氨酸690mg/L；

生根培养基：1/2MS基本培养液+生根粉(ABT)(1mg/L)+烯效唑(0.5mg/L)；

以上培养基均含30g/L蔗糖和5g/L琼脂粉，以水为溶剂，pH6.0，且均在121℃高压灭菌15min。

其中，N6基本培养液的组成如表1所示：

表1

1/2MS基本培养液的组成如表2所示：

表2

三、具体步骤

1.孤雌生殖单倍体的获得

以玉米孤雌生殖诱导系EDI为父本，优良自交系18-599R为母本，父本与母本杂交，该父本与母本杂交产生的当代籽粒中含有一定比例的单倍体籽粒，取授粉后10-14d的玉米幼穗，备用。

2.单倍体幼胚的挑取与诱导

取步骤(1)中得到的玉米幼穗，去掉苞叶和花丝，在超净工作台上用体积百分比浓度为75％的酒精喷洒于玉米幼穗，晾干后，继续用酒精喷洒第2遍，晾干玉米幼穗。手拿穗尖部，用手术刀削去籽粒顶部约1/3，从籽粒中挑出0.5～2.0mm的幼胚，挑取大小一致的幼胚盾片接种于幼胚诱导培养基中，(26±2)℃暗培养。该诱导培养设置3次重复，每个重复挑取100颗幼胚。

每个培养皿接种20个幼胚盾片，3d后幼胚盾片开始膨大，同时胚根和胚芽有不同程度的生长，这时应及时把胚根和胚芽切掉，20d后得到诱导培养基培养的玉米愈伤组织，观察诱导的玉米愈伤组织状况，如表3所示。

重复次数	重复Ⅰ	重复Ⅱ	重复Ⅲ
				幼胚数	100	100	100
紫色愈伤组织数	56	51	50
				白色愈伤组织数	44	49	50
单倍体诱导率	44％	49％	50％

表3

3.玉米单倍体愈伤组织的继代与鉴定

3.1第一次继代培养和第一次倍性鉴定初步确定拟单倍体Ⅰ愈伤组织

3.1.1第一次倍性鉴定中光照条件的筛选

将诱导出玉米愈伤组织的单倍体材料及正常的二倍体材料分别接种于继代培养基上，分别在三种光照、六种不同时间段下观察培养：

三种光照分别为：①暗培养；②全光照培养，2000～2500lx；③光暗周期培养，14h光照培养+10h暗培养，均在28℃下培养。

六种不同时间段分别为：时间分别为0、1、5、10、20、40h。

在光暗周期培养20小时后，观察愈伤组织颜色变化情况，单倍体材料和二倍体材料的愈伤组织有明显变化，正常的二倍体材料继代培养得到的愈伤组织颜色为紫色或蓝色，而单倍体材料的愈伤组织在继代培养中不变色。

3.1.2拟单倍体Ⅰ愈伤组织的筛选

取诱导的玉米愈伤组织，在光暗周期培养条件下培养24小时，光照强度2000～2500lx，光照时间14h+暗培养10h，筛选出未变色材料作为拟单倍体Ⅰ愈伤组织。

3.2第二次继代培养和第二次倍性鉴定筛选出拟单倍体Ⅱ愈伤组织

对上述拟单倍体Ⅰ愈伤组织接种于继代培养基上进行常规培养，培养完成后进行第二次倍性鉴定，即进行染色体压片观察鉴定。

第二次倍性鉴定具体步骤为(1)材料预处理：取拟单倍体Ⅰ愈伤组织继代培养后的材料其上1mm左右的愈伤组织浸泡在α-溴奈中进行预处理，以药液浸没该愈伤组织为度，浸泡处理3～4h；

(2)愈伤组织固定：将预处理后的愈伤组织，用流水冲洗，然后投入卡诺液(按体积比：3份甲醇∶1份冰乙酸，现配现用)中固定3d，用95％的乙醇(体积浓度，下同)洗两次，转入70％乙醇中保存备用。

(3)解离和染色：从上述70％乙醇中取出固定好的愈伤组织，流水冲洗7min，吸水纸吸干后进行解离；将取出吸干后的愈伤组织放入盛有适量1mol/LHCl于60℃的离心管中水浴保温，解离10min；解离后将愈伤组织水洗5min并吸干，取0.2mm左右的愈伤组织于载玻片上压碎打散，滴加1～2滴卡宝品红染液，染色10～15min，压片，压片具体为：在经染色的材料上加一滴染液，盖上盖玻片，覆一层吸水纸，用带橡皮头的铅笔垂直敲打，或以拇指垂直紧压盖片(注意勿使盖片搓动)，使材料分散压平；镜检，使用OLYMPUS相差显微镜进行观察和记录，实验结果如图3所示，确定获得染色体n＝x＝10的玉米单倍体(对照玉米二倍体染色体数目为2n＝2x＝20)，筛选出拟单倍体Ⅱ愈伤组织。

3.3第三次继代培养和第三次倍性鉴定确定准单倍体愈伤组织

将上述拟单倍体Ⅱ愈伤组织接种于继代培养基上常规培养，培养完成后进行第三次倍性鉴定，具体为流式细胞仪检测鉴定。

其中流式细胞仪检测鉴定具体为取拟单倍体Ⅱ愈伤组织材料继代培养后的材料1g，分别在1mL Otto I buffer(pH2.3的0.1mol/L柠檬酸+0.5％(体积浓度)Tween20)中用锋利的刀片切碎、过滤、收集滤液，经5000r/min离心5min后，弃上清液至100mL,再加入100mL Otto I buffer于4℃保存。加入Otto Ⅱ buffer(pH＝8.9的0.4mol/L Na₂HPO₄·12H₂O)和RNase后，用PI(Propidium iodide碘化丙啶，50mg/mL)染液对细胞核DNA进行荧光标记，置于暗处30min后，用流式细胞仪进行倍性鉴定，确定准单倍体愈伤组织。

采用美国BD公司的FACSCalibur流式细胞仪(flow cytometry)进行倍性检测，并用cellQuest(BD公司)软件获取数据，ModFit软件(Yeritv Software House公司)分析结果。实验结果如图4所示。

以上倍性鉴定采用三种方法依次进行鉴定，首先采用光照观察检测，但光照观察检测的结果与玉米单倍体幼胚的基因型、成熟程度以及紫色基因的表达程度都有关系，其无法排除部分未变色的愈伤组织依然是杂合体的可能，因此，经过光照观察检测起到初筛的目的，该检测方法操作简单易行，减少了倍性鉴定的工作量；其次采用染色体压片检测，该方法较流式细胞仪检测而言，成本较低，快捷简单，但是其存在操作成功率不高，需要多次重复试验摸索，而且对检测材料所处的生长时期有特殊要求，因此，不能完全检测出所有材料的准确倍性，只作为减少流式细胞成本，二次筛选的目的；最后采用流式细胞仪检测，具有准确、快速的特点，所以作为最终确定准单倍体材料的重要步骤。以上三种倍性检测方法结合使用，既可以减少工作量，又降低检测的成本，同时节约了时间，提高了检测准确性，如图5和6所示。

3.4准单倍体的继续连续继代

根据以上检测结果，将确定为准单倍体的愈伤组织按照每一颗分别夹碎成2.5～3mm大小的小块，置于继代培养基中，其中同一愈伤组织转移到同一皿继代培养基中，采取世代记录法。

每20d继代一次，连续继代3次，(26±2)℃暗培养。挑选生活力强、生长旺盛、颜色鲜艳、颗粒状特征明显的Ⅱ型愈伤组织材料，淘汰发褐、变软的愈伤组织材料。

4.Ⅱ型愈伤组织的分化及再生

4.1分化培养基的选择

将准单倍体的Ⅱ型愈伤组织转到正交设计的不同分化培养基中，28℃暗培养7d后，转到相同温度下每天12～16h的光照培养，光照强度为1500～2000lx，日光灯照明，分化4周后统计和观察分化情况。正交优化分化条件如表4所示：

表4

由图8所示，则分化培养基最优化组成及浓度为：N6基本培养液+KT(0.5mg/L)+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)(0.5mg/L)+ABA(植物激素脱落酸)(0.5mg/L)+2,4-D(1mg/L)+NAA(萘乙酸)(0.1mg/L)+酸水解酪蛋白100mg/L+L－脯氨酸690mg/L

4.2分化培养及再生

将准单倍体的Ⅱ型愈伤组织(以二倍体胚性Ⅱ型愈伤组织为对照)转到最优分化培养基中，28℃暗培养7d后，转到相同温度下每天12～16h的光照培养，光照强度为1500～2000lx，日光灯照明，待Ⅱ型愈伤组织上长出绿色芽后，将长芽的Ⅱ型愈伤组织转入最优分化培养瓶中培养成苗。

当幼苗长大到3～5cm时，从幼苗基部将小苗分成单株，不要损伤生长点，转移到生根培养基上，在28℃光照培养，2～3周后小植株长出大量的根，形成完整的植株。

5.单倍体植株炼苗与移栽

在生根培养基上的植株长到约10cm高时，打开培养瓶瓶盖光照培养，加入无菌水没过培养基，2d后再取出，洗净粘在根系上的培养基，炼苗(炼苗用的土∶蛭石的比例为3∶1)，炼苗时用蒸馏水保湿。待植株适应外界环境健康生长后，将其移栽于四川省成都市温江区玉米育种基地，培育成完整的植株个体，如图9所示。

本实施方式，一方面，提供了一种玉米单倍体幼胚培养成愈伤组织并进行检测，最终分化出单倍体植株的方法，从形态、组织和细胞水平上准确的鉴定出单倍体愈伤组织，最大程度地减少了继代、分化培养工作量，提高了玉米单倍体遗传再生系统建立的效率和可能性，为玉米单倍体遗传转化体系的建立打下基础，实现缩短育种周期的效果。

另一方面，本实施方式的方法操作简单可行，与二倍体幼胚、单倍体花药、小孢子培养和其他玉米组织培养的方法相比，玉米单倍体幼胚的组织培养具有明显时间优势和突破性特点，可实现缩短育种周期，另外玉米幼胚的再生能力明显高于其他部位，提高转基因效率的优势，对于玉米基因工程方面的理论研究以及遗传育种实践均具有重要意义。随着单倍体组织培养技术的不断完善和转基因技术的不断发展，终将实现两种技术的结合互补，为种植资源创新以及作物的定向改良提供一种更为有效的方法和手段。

上述实施例，只是本发明的较佳实施例，并非用来限制本发明实施范围，故凡以本发明权利要求所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括在本发明权利要求范围之内。

Claims (6)

1.一种玉米单倍体植株的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)首先获取玉米单倍体幼胚，取授粉后10-14d的玉米幼穗，从玉米幼穗的籽粒中挑取玉米幼胚；随后将玉米幼胚接种于诱导培养基，(26±2)℃暗培养20d，后得到愈伤组织；

(2)其次进行第一次继代培养和第一次倍性鉴定，具体为将所述愈伤组织接种于继代培养基上进行光暗周期培养，光照强度2000-2500lx，光照时间14h+暗培养10h，筛选未变色的愈伤组织作为拟单倍体Ⅰ愈伤组织；

(3)接着步骤(2)进行第二次继代培养和第二次倍性鉴定，具体为将所述拟单倍体Ⅰ愈伤组织接种于继代培养基上培养，培养完成后进行第二次倍性鉴定，筛选出拟单倍体Ⅱ愈伤组织后继续进行继代培养，得到准单倍体愈伤组织；其中所述第二次倍性鉴定为染色体压片观察鉴定；

(4)接着步骤(3)进行第三次继代培养和第三次倍性鉴定，具体为将所述拟单倍体Ⅱ愈伤组织接种于继代培养基上培养，培养完成后进行第三次倍性鉴定，筛选出准单倍体愈伤组织；其中所述第三次倍性鉴定具体为流式细胞仪检测鉴定；

(5)再次进行分化培养和生根培养，得到完整的玉米单倍体植株。

2.根据权利要求1所述的玉米单倍体植株的培育方法，其特征在于：所述分化培养的培养基是在N6基本培养液中添加酸水解酪蛋白、L-脯氨酸、2,4－二氯苯氧乙酸、激动素、6-苄氨基腺嘌呤、脱落酸、萘乙酸、碳源和凝胶剂得到的固体培养基；

其中所述碳源为蔗糖、葡萄糖、麦芽糖中的一种或几种，所述凝胶剂为琼脂、卡拉胶中的一种；其他组分的浓度分别如下：

酸水解酪蛋白为100mg/L，L-脯氨酸为600～800mg/L，激动素为0.2～1mg/L，6-苄氨基腺嘌呤为0.5～2mg/L，脱落酸为0.2～1mg/L，2,4－二氯苯氧乙酸为0.2～1mg/L，萘乙酸为0.1～1mg/L。

3.根据权利要求2所述的玉米单倍体植株的培育方法，其特征在于：所述分化培养基的其他组分的浓度分别为：所述酸水解酪蛋白的浓度为100mg/L，所述L-脯氨酸的浓度为690mg/L，所述激动素的浓度为0.5mg/L，所述6-苄氨基腺嘌呤的浓度为0.5mg/L，所述脱落酸的浓度为0.5mg/L，所述2,4－二氯苯氧乙酸的浓度为1mg/L，所述萘乙酸的浓度为0.1mg/L。

4.根据权利要求1所述的玉米单倍体植株的培育方法，其特征在于：所述诱导培养基在N6基本培养液的基础上添加2，4－二氯苯氧乙酸、酸水解酪蛋白、L－脯氨酸、碳源和凝胶剂得到的固体培养基，pH为6.0，所述2，4－二氯苯氧乙酸的浓度为2.0mg/L，所述酸水解酪蛋白的浓度为500mg/L，所述L－脯氨酸的浓度为1.38g/L。

5.根据权利要求1所述的玉米单倍体植株的培育方法，其特征在于：所述继代培养基为在N6基本培养液的基础上添加2,4－二氯苯氧乙酸、酸水解酪蛋白、L－脯氨酸、甘露醇、碳源和凝胶剂得到的固体培养基，pH为6.0，所述2,4－二氯苯氧乙酸的浓度为1.5mg/L，所述酸水解酪蛋白的浓度为500mg/L所述L－脯氨酸的浓度为690mg/L，所述甘露醇的浓度为20g/L。

6.根据权利要求1所述的玉米单倍体植株的培育方法，其特征在于：所述生根培养的培养基为在1/2MS培养液的基础上添加生根粉、烯效唑、碳源和凝胶剂得到的固体培养基，pH为6.0，所述生根粉的浓度为1mg/L，所述烯效唑的浓度为0.5mg/L。