CN104620983B - 一种稗草组织培养成苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种稗草组织培养成苗的方法，所述方法是用成熟稗草种子作为外殖体，通过去除部分胚乳、吸水、消毒等处理，在28℃黑暗条件下置于愈伤组织诱导培养基上，7天后长出愈伤组织。然后将愈伤置于继代培养基上培养7天。接着将继代后的愈伤转入分化培养基上培养14天，接着在相同的温光条件下，将分化苗转入生根培养基上培养7天，空气中用自来水浇灌3天后，移栽入土壤可得稗草的组织培养苗。本发明选用稗草成熟种子作为外殖体，因为稗草种子易获得，稗草产种量大，易保存，易诱导再生，脱分化和再分化的过程易掌握，实验的重复性好，且生根率高。

Description

一种稗草组织培养成苗的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种稗草组织培养成苗的方法。

(二)背景技术

稗草(Echinochloacrus-galli)是世界性的农田恶性杂草，主要通过化学农药防治。由于连续多年使用单一除草剂，稗草已经对10类不同作用机理的除草剂产生了抗药性(Heap,2015)。抗性稗草引起农药的用量增加、残留和污染等问题，严重制约农业可持续发展，成为是农业生产的难题。研究稗草的抗药性机理是解决抗药性问题的重要途径，其中稗草转基因是验证抗药基因功能的主要技术，但是目前缺少获得高效稗草受体系统的方法。建立稗草基因转化受体系统是实现外源基因转化的先决条件，而高效受体系统的获得依赖稗草组织培养技术。

目前有关稗草组织培养的文献还比较少。检索Springer，ScienceDirect，Wileyonlinelibrary，ProQuest等主要外文数据库。其中1984年Wangdayuan等首次通过稗草花序作为外殖体在含有2,4-D和6-BA的MS培养基上获得白色、紧密的胚状体，并通过调节2,4-D的含量继续培养获得了稗草的再生苗。这种方法不经过组织培养阶段，而是直接由外殖体得到胚状体进而发育成苗，至少需要半年时间，具有试验难度高，不易大规模培养，时间长，重复性差等特点。

(三)发明内容

为解决现有技术中以稗草花序作为外殖体得到胚状体进而发育成苗试验难度高、时间长、重复性差，不宜大规模培养的不足，本发明以稗草成熟胚作为外殖体通过种子处理，愈伤诱导，芽分化、生根培养和激素的选择等研究，探索通过组织培养获得稗草再生苗的方法，建立稗草基因转化过程中的植物受体系统，为稗草组织培养和转基因研究提供基础信息。

本发明采用的技术方案是：

一种稗草组织培养成苗的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)种子处理：选取常规对二氯喹啉酸敏感的稗草种子(如Echinochloacrusgalli、Echinochloacrusgallivar.zelayensis、Echinochloacrusgallivar.mitis等)，去除种皮与一半胚乳，将带胚乳的半粒种子在室温下用灭菌水浸泡3～4小时后，着用60～70％乙醇浸泡30～60秒，再用无菌水冲洗2～3次，接着用0.05～0.1％(m/v，1％表示100mL溶液含有1g溶质)的升汞边振荡边消毒10～15分钟，接着再用无菌水冲洗4～5次，最后一次浸泡20～30分钟，再用无菌水边振荡边清洗1次，然后在超净台上将种子置于无菌滤纸上10～15min；

(2)愈伤诱导培养：将处理后的种子放在愈伤组织诱导培养基上，在28～30℃黑暗培养6～8天；所述愈伤组织诱导培养基组成如下：0.5～0.6g/L水解酪蛋白，3～5％蔗糖，8～10g/L琼脂，1.0～2.0mg/L2,4-D，0.2～0.3mg/L6-BA，0.1～0.2mg/LNAA，溶剂为MS培养基；

(3)继代培养：挑选白色、紧实、未污染的愈伤转移到继代培养基上，在28～30℃、3000～4000lx光照16小时、黑暗8小时条件下，培养5～8天；所述继代培养基组成如下：0.2～0.3mmol/L甘露醇，3～5％蔗糖，8～10g/L琼脂，0.5～0.8mg/L2,4-D，0.5～0.8mg/L6-BA，溶剂为MS培养基；

(4)愈伤分化培养：挑选紧实、未污染的愈伤转移到分化培养基上，在28～30℃、3000～4000lx光照16小时、黑暗8小时条件下，培养10～14天；所述分化培养基组成如下：0.5～0.6g/L水解酪蛋白，3～5％蔗糖，8～10g/L琼脂，0.2～0.4mg/LZT，1.0～2.0mg/LNAA，溶剂为MS培养基；

(5)生根培养及移栽：挑选已经生芽、未污染的愈伤转移到生根培养基上，在28～30℃16小时光照、黑暗8小时、3000～4000lx光强条件下，培养7～8天，待根长出后，用自来水浇灌3天，然后移栽土壤；所述生根培养基组成如下：0.5～0.6g/L水解酪蛋白，3～5％蔗糖，8～10g/L琼脂，溶剂为1/2MS培养基。

植物组织培养的原理是利用细胞的全能性，将离体的体细胞或单倍体细胞诱导成体细胞胚或胚状体进而发育成完整的植株的过程，其中胚状体具有很强的接受外源DNA的能力，是理想的基因转化感受态细胞，本发明方法通过愈伤诱导等组织培养方法成功得到再生苗，为稗草的转基因研究创造了很好的工具。

本发明的有益效果主要体现在：本发明选用稗草成熟种子作为外殖体，因为稗草种子易获得，稗草产种量大，易保存，易诱导再生，脱分化和再分化的过程易掌握，实验的重复性好，且生根率高。

(四)附图说明

图1为稗草愈伤在愈伤诱导培养基MDBN3上的生长状态；

图2为稗草愈伤在继代培养基GDB4上的生长状态；

图3为稗草愈伤在分化培养基SZN5上的生长状态；

图4为稗草愈伤在生根培养基R上的生长状态。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料

对二氯喹啉酸敏感的稗草(Echinochloacrusgalli)种子(采自浙江绍兴陶堰镇稻田)。

1.1.2试剂

试验中除了MS培养基成分外，还包括2,4-D、6-BA、ABA、NAA、ZT、蔗糖、琼脂、水解酪蛋白、甘露醇等。

1.2方法

1.2.1成熟胚愈伤的诱导

(1)种子处理：取适量对二氯喹啉酸敏感稗草种子，去除种皮与一半胚乳，将带胚的半粒种子在室温下用灭菌水浸泡4小时，接着用70％(v/v)乙醇浸泡30～60秒，再用无菌水冲洗3次，接着用0.1％(m/v)的升汞消毒10-15分钟，并拌有振荡。接着再用无菌水冲洗5次，最后一遍浸泡20分钟，再用无菌水清洗一次，期间均拌有振荡。然后在超净台上将种子置于无菌滤纸上10min。最后把消毒后种子放在愈伤组织诱导培养基上，每培养皿10粒，每种培养基重复5次，在28℃暗培养7天。

(2)愈伤诱导培养基

在MS培养基的基础上，添加0.6g/L水解酪蛋白、3％蔗糖和8g/L琼脂改造为培养基M，向M中添加不同浓度的2,4-D，6-BA，ABA和NAA进行稗草愈伤诱导，见表1。

表1：稗草愈伤诱导培养基

D＝2,4-D；B＝6-BA；A＝ABA；N＝NAA。

1.2.2继代培养

(1)挑选愈伤组织：

挑选白色、紧实、未污染的愈伤转移到继代培养基上。在28℃、3000～4000lx光照16小时、黑暗8小时条件下，培养7天。

(2)愈伤继代培养基

在MS培养基的基础上，添加0.2mol/L甘露醇+3％(w/w)蔗糖+8g/L琼脂改造为培养基G，向G中添加不同浓度的2,4-D和6-BA进行稗草愈伤诱导，见表2。

表2：稗草愈伤继代培养基

G＝growth,D＝2,4-D,B＝6-BA

1.2.3愈伤分化培养

(1)愈伤组织：

挑选紧实、未污染的愈伤转移到分化培养基上，在28℃、3000-4000lx光照16小时、黑暗8小时条件下，培养14天。

(2)愈伤分化培养基

在M培养基中，添加不同浓度的ZT和NAA进行稗草愈伤分化诱导(表3)。

表3：稗草愈伤分化诱导培养基

S＝shooting；Z＝ZT；N＝NAA。

1.2.4生根培养及移栽土壤

(一)挑选已经生芽、未污染的愈伤转移到生根培养基上。在28℃16小时光照、黑暗8小时，3000-4000lx光强条件下，培养7天。待根长出后，用自来水浇灌3天，然后移栽土壤。

(二)生根培养基

在M培养基的基础上，将大量元素的用量减半得R培养基，再添加不同浓度的NAA进行稗草愈伤根诱导，见表4。

表4：稗草愈伤根诱导培养基

培养基名称	培养基成分
		R	1/2MS+0.6g/L水解酪蛋白+3％蔗糖+8g/L琼脂
RN1	R+0.1mg/L NAA
		RN2	R+0.2mg/L NAA
RN3	R+0.3mg/L NAA
		RN4	R+0.4mg/L NAA4 -->
RN5	R+0.5mg/L NAA

1/2MS＝MS的大量元素成分用量减半，其余成分用量不变；R＝Rooting；N＝NAA。

2结果

2.1稗草愈伤诱导

28℃暗培养7天，在培养基M上不能诱导产生愈伤，而往M中只添加2,4-D便可诱导产生愈伤，但是诱导频率不超过50％(见表5)。再添加6-BA可提高诱导频率最高至70％，这时愈伤呈水渍状，松散。而进一步添加ABA或NAA，均可改善愈伤的状态，使之紧实，干燥(见图1)。但是NAA的诱导率高于ABA。

综合比较，稗草的愈伤诱导培养基优选组成如下：0.5～0.6g/L水解酪蛋白，3～5％蔗糖，8～10g/L琼脂，1.0～2.0mg/L2,4-D，0.2～0.3mg/L6-BA，0.1～0.2mg/LNAA，溶剂为MS培养基；最佳培养基为MDBN3，即MS培养基+0.6g/L水解酪蛋白+3％蔗糖+8g/L琼脂+2mg/L2,4-D+0.2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA。

表5：稗草愈伤诱导培养基的诱导结果

培养基	接种外殖体数(个)	愈伤数(个)	愈伤诱导率(％)
				M	201	0	0
MD1	193	41	21
				MD2	189	64	34
MD3	213	85	40

MD4	192	88	46
				MD5	206	78	38
MD6	213	75	35
				MDB1	188	90	48
MDB2	197	116	59
				MDB3	201	143	71
MDB4	200	124	62
				MDB5	194	107	55
MDB6	207	95	46
				MDBA1	203	104	51
MDBA2	192	96	50
				MDBA3	197	138	70
MDBA4	189	108	57
				MDBA5	203	97	48
MDBA6	204	88	43
				MDBN1	196	120	61
MDBN2	193	137	71
				MDBN3	202	164	81
MDBN4	163	106	655 -->
				MDBN5	199	123	62
MDBN6	201	107	53

2.2成熟胚愈伤继代培养

在28℃、3000-4000lx光照16小时，黑暗8小时条件下，培养7天，稗草愈伤在G培养基上的成活率不超过30％，添加2.4-D后可提高成活率至70％左右，进一步添加6-BA可提高至80％左右(见表6)。而且7天后在愈伤的局部开始出现绿色(图2)。

综合比较，稗草的愈伤继代培养基优选组成如下：0.2～0.3mmol/L甘露醇，3～5％蔗糖，8～10g/L琼脂，0.5～0.8mg/L2,4-D，0.5～0.8mg/L6-BA，溶剂为MS培养基；最佳培养基为GDB4，即MS+3％蔗糖+8g/L琼脂+甘露醇(0.2mol/L)+0.5mg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA。

表6：稗草愈伤在继代培养基上的成活情况

培养基	接种愈伤数(个)	成活数(个)	继代成活率(％)
				G	163	47	29
GD1	158	66	42
				GD2	171	92	54
GD3	163	99	61

GD4	148	105	71
				GD5	153	101	66
GD6	155	90	58
				GDB1	146	96	66
GDB2	162	109	67
				GDB3	158	112	71
GDB4	153	127	83
				GDB5	157	119	76
GDB6	166	120	72

2.3成熟胚愈伤分化培养

在28℃，3000-4000lx光照16小时、黑暗8小时条件下，培养14天。稗草愈伤在SZ培养基上的分化率不超过35％，添加NAA后可提高分化率至60％左右(见表7)。而且7天后在愈伤的局部开始出现绿芽(图3)。

综合比较，稗草的愈伤分化培养基优选组成如下：0.5～0.6g/L水解酪蛋白，3～5％蔗糖，8～10g/L琼脂，0.2～0.4mg/LZT，1.0～2.0mg/LNAA，溶剂为MS培养基；最佳培养基为SZN5，即MS+0.6g/L水解酪蛋白+3％蔗糖+8g/L琼脂+0.2mg/LZT+2mg/LNAA。

表7：稗草愈伤在分化培养基上的分化情况

2.4成熟胚愈伤生根培养

在28℃，3000-4000lx光照16小时，黑暗8小时条件下，培养7天。稗草愈伤在R培养基上的生根率超过90％，添加NAA后生根率也维持在90％以上(见表8)。而且根长都在2cm以上(图4)。

综合比较，稗草的愈伤生根培养基优选组成如下：0.5～0.6g/L水解酪蛋白，3～5％蔗糖，8～10g/L琼脂，溶剂为1/2MS培养基；最佳培养基为R培养基，即1/2MS+0.6g/L水解酪蛋白+3％蔗糖+8g/L琼脂。

表8：稗草愈伤苗在生根培养基及土壤中上的生长情况

2.5成熟胚愈伤苗的培养

打开已经生根的愈伤苗容器盖子，加入自来水20ml，进行练苗3天，然后清洗根部培养基，移栽入土壤中，其成活率可达100％(表8及图4)。3结论

(1)外殖体的选择与处理方法：选用成熟稗草种子作为外殖体，去除种皮与一半胚乳后，在室温下用灭菌水浸泡4小时，接着用70％乙醇浸泡40秒，再用无菌水冲洗3次，然后用0.1％(m/v)的升汞浸泡10～15分钟并拌有振荡，接着用无菌水冲洗5次，再浸泡20分钟，然后用无菌水振荡清洗一次，最后在超净台上将种子放无菌滤纸上静置10min。

(2)愈伤诱导方法：把处理后的种子放置在愈伤诱导培养基上，28℃黑暗培养14天。愈伤诱导培养基配方为：MS培养基+0.6g/L水解酪蛋白+3％蔗糖+8g/L琼脂+2mg/L2,4-D+0.2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA。

(3)愈伤继代培养方法：把愈伤放置在愈伤继代培养基上，在28℃，光照强度为3000-5000lx培养，光暗比为16：8条件下，培养7天。愈伤继代培养基配方为：MS+3％蔗糖+8g/L琼脂+甘露醇(0.2mol/L)+0.5mg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA。

(4)愈伤分化培养方法：把继代愈伤放置在分化培养基上，在28℃，光照强度为3000-5000lx培养，光暗比为16：8条件下，培养14天。愈伤分化培养基配方为：MS+0.6g/L水解酪蛋白+3％蔗糖+8g/L琼脂+0.2mg/LZT+2mg/LNAA。

(5)生根培养方法：把分化愈伤放置在生根培养基上，在在28℃，光照强度为3000-5000lx培养，光暗比为16：8条件下，培养7天，加入自来水培养2天，然后移入土壤培养。生根培养基配方为：1/2MS+0.6g/L水解酪蛋白+3％蔗糖+8g/L琼脂。

(6)土壤培养方法：用自来水浇灌2～3天后，然后清洗根部培养基后，移栽土壤中。

4讨论

本发明方法中以经典的MS培养基为基础，通过添加水解酪蛋白、蔗糖、琼脂、甘露醇等进行改良。水解酪蛋白含有18种游离氨基酸，提供更多外源氨基酸和氮素，0.6g/L水解酪蛋白最有利于稗草愈伤的诱导、芽分化和生根等发育。3％蔗糖除了提供碳源，还在维持细胞渗透压，减缓微生物污染、诱导木质部和韧皮部的分化等方面有促进的作用。琼脂使培养基凝固，起支撑和通气作用。甘露醇是渗透压的调节剂，在继代培养基中有利于维持愈伤的形态、颜色、水分含量，有利于愈伤成活。

植物激素在愈伤的诱导和器官的分化中起关键作用，决定细胞的分化方向。本实验中添加了两类植物激素，一类是生长素包括2,4-D(2.4-二氯苯氧乙酸)和NAA(萘乙酸)，单独添加2,4-D便可诱导出稗草愈伤组织，而且浓度为2mg/L时效果较好，在继代培养阶段加0.2mg/LNAA可改善愈伤的状态，使之更加紧实，降低褐化速度。而加入6-BA则降低出愈率，但愈伤的色泽、形状要好于添加NAA，NAA诱导的愈伤可在继代时改善，所以在愈伤诱导阶段选择加入NAA便于获得高比例的愈伤，但是其最佳浓度在0.1～0.2mg/L。另一类是细胞分裂素包括ZT(玉米素，Zeatin)和6-BA(6-苄基嘌呤)，在愈伤分化阶段加入ZT可有效诱导愈伤的分化，而6-BA可改善继代愈伤的状态。在分化阶段要得到较高的分化率，必须控制ZT和NAA的浓度比例，试验中发现，NAA的浓度随着ZT的浓度变化而变化，只有当ZT的浓度确定后，才能确定NAA的浓度。当ZT浓度确定为0.2mg/L时，NAA的浓度在0.5～0.8mg/L为宜。在生根阶段不加入NAA，只需MS的大量元素成分减半，生根率就可在90％以上。

愈伤在四种培养基上的最佳生长时间对愈伤成活有很大的影响。本发明发现成熟胚放在愈伤诱导培养基上3天后就有愈伤长出，培养6～8天最好，超过10天活力下降。在愈伤继代培养其上培养5～7天最好，超过14天易于变褐色而死亡。在分化培养基上一般培养1周便有绿点出现，2周便可分化长芽。绿点有时在继代时也能出现。在生根培养基上一般要培养7-14天便有大量须根长出，长度一般为1-3厘米。这时打开容器盖加入自来水，练苗2-3天便可，洗去培养基后便可移栽入土壤。稗草愈伤成苗的最佳培养环境条件与它的大田最佳生长条件基本一致。在愈伤诱导阶段不需光照，除此其它阶段均需要光照，整个阶段包括愈伤诱导、愈伤继代、愈伤分化和生根，光强度均为3000-5000lx，光照与黑暗为16:8较好，温度28～30℃为最佳。

Claims (1)

1.一种稗草组织培养成苗的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)种子处理：选取对二氯喹啉酸敏感稗草种子，去除种皮与一半胚乳，将带胚乳的半粒种子在室温下用灭菌水浸泡3～4小时后，接着用60～70％乙醇浸泡30～60秒，再用无菌水冲洗2～3次，接着用0.05～0.1％的升汞边振荡边消毒10～15分钟，接着再用无菌水冲洗4～5次，最后一次浸泡20～30分钟，再用无菌水边振荡边清洗1次，然后在超净台上将种子置于无菌滤纸上10～15min；

(2)愈伤诱导培养：将处理后的种子放在愈伤组织诱导培养基上，在28～30℃黑暗培养6～8天；所述愈伤组织诱导培养基组成如下：0.5～0.6g/L水解酪蛋白，3～5％蔗糖，8～10g/L琼脂，1.0～2.0mg/L2,4-D，0.2～0.3mg/L6-BA，0.1～0.2mg/LNAA，溶剂为MS培养基；

(3)继代培养：挑选白色、紧实、未污染的愈伤转移到继代培养基上，在28～30℃、3000～4000lx光照16小时、黑暗8小时条件下，培养5～8天；所述继代培养基组成如下：0.2～0.3mmol/L甘露醇，3～5％蔗糖，8～10g/L琼脂，0.5～0.8mg/L2,4-D，0.5～0.8mg/L6-BA，溶剂为MS培养基；

(4)愈伤分化培养：挑选紧实、未污染的愈伤转移到分化培养基上，在28～30℃、3000～4000lx光照16小时、黑暗8小时条件下，培养10～14天；所述分化培养基组成如下：0.5～0.6g/L水解酪蛋白，3～5％蔗糖，8～10g/L琼脂，0.2～0.4mg/LZT，1.0～2.0mg/LNAA，溶剂为MS培养基；

(5)生根培养及移栽：挑选已经生芽、未污染的愈伤转移到生根培养基上，在28～30℃16小时光照、黑暗8小时、3000～4000lx光强条件下，培养7～8天，待根长出后，用自来水浇灌3天，然后移栽土壤；所述生根培养基组成如下：0.5～0.6g/L水解酪蛋白，3～5％蔗糖，8～10g/L琼脂，溶剂为1/2MS培养基。