CN104542299B - 一种提高普通野生稻杂交后代花药培养效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高普通野生稻杂交后代花药培养效率的方法，属植物组织培养技术领域。该普通野生稻杂交后代花药培养方法包括：外植体的选择，外植体灭菌，花药愈伤的液体悬浮诱导，花药愈伤的增殖培养，花药愈伤组织分化培养，分化苗即花培苗的生根培养，及花培苗炼苗、移栽步骤。本发明将花药接种到液体培养基中进行悬浮培养，提高愈伤诱导率，再将愈伤组织转移到增殖培养基上进行增殖培养，提高愈伤质量和数量。本发明的优点在于：能够大幅度提高普通野生稻杂交后代花药培养中愈伤诱导率和成苗率，加快水稻育种进程，提高水稻优良品种的选育效率；为加速利用野生稻优良基因选育水稻品种提供有力的技术支持。
Description
技术领域：
本发明涉及一种普通野生稻杂交后代花药培养方法，属植物组织培养技术领域。
背景技术：
野生稻是稻属中除了栽培稻(O.sativaL.)和非洲栽培稻(O.glaberrimaSteud.)以外的野生种类的总称。普通野生稻属于A’A’基因组，与栽培AA基因组遗传距离相对较近，因此，普通野生稻是进行水稻远缘杂交育种的优良资源。
普通野生稻与栽培远缘杂交育种后代性状疯狂分离，要稳定性状，需要多代的反复回交、自交和选择，即使在一年种植三季的海南地区育种也需要至少4-5年时间。采用水稻花粉培养能够加快目标性状的纯合，缩短育种年限。
水稻花药培养是把发育到一定阶段的花药，通过无菌操作技术接种到人工配置的培养基上，诱导其花粉(小孢子)形成愈伤组织，进而分化成完整的植株。在培养过程中染色体经过自然或人工加倍后，成为纯合的二倍体，这种染色体加倍产生的纯和二倍体，在遗传上非常稳定，不发生性状分离。
水稻花药培养在育种上的利用体现在极早稳定分离的后代，快速获得纯系，缩短育种年限，提高选择效率。常规杂交后代需要到F5代以上，复交组合需要更多的代数性状才能稳定，而杂交F1代通过花药培养在H2代即可筛选稳定的品系，比常规杂交育种年限缩短3-5年，甚至更多。水稻花药培养在水稻种间的杂交育种中广泛应用于恢复系的选育，而在杂种优势固定方面可以获得超亲的纯系，另外还可以创制原始材料、选育新品种、新不育系等。
目前，水稻花药培养的主要问题是花药愈伤组织诱导率低(仅为30％左右)，绿苗分化率低(仅为20％左右)，这严重阻碍着花药培养技术在普通野生稻和栽培稻杂交育种实践中的应用。
本发明提供了一种提高普通野生稻交后代花药培养效率的方法，加快杂交后代性状的纯和稳定，提高利用野生稻优异基因进行育种的效率。
发明内容：
本发明目的在于克服现有技术中花药培养效率低的问题，提供一种提高普通野生稻杂交后代花药培养效率的方法，具体步骤如下：
a.外植体的选择：外植体的选择为田间取材，在晴天早晨露水未干时取幼穗，选取剑叶环和下一叶环之间距离为5-10cm的稻穗，穗子不破口，保留两片叶和叶鞘；田间取穗后立即放入盛有清水的桶中，以避免穗子失水；在实验室中用70％酒精棉球擦拭叶片和叶鞘，再按照不同株系用保鲜膜包裹幼穗，置于4-6℃冰箱中低温预处理7-10天；
b.外植体灭菌：取出预处理后的幼穗，挑选小穗花药处于单核靠边期的枝梗，即：花药淡黄色，在颖壳内雄蕊长度接近颖片长度的1/2，长粒型的接近2/5的稻穗；将幼穗叶片剥离后用体积百分比为70％的酒精棉球擦拭叶鞘，将枝梗剪为5-7厘米的段，用体积百分比为70％的酒精浸泡30秒进行表面消毒，无菌蒸馏水冲洗4-5次，再用质量体积百分比为0.1％的升汞表面消毒8分钟，其间不时上下摇动灭菌瓶，最后用无菌蒸馏水冲洗4-5次；
c.花药愈伤的液体悬浮诱导：灭菌后将穗子从苞叶中剥离，放在无菌滤纸上吸干多余的水分，用剪刀剪去颖壳的上部，注意不要剪到花药，用镊子的尖部挑出花药到诱导液体培养基中，每瓶30枚花药；将接种花药的三角瓶放到摇床中28℃、100-130转/分钟黑暗下悬浮培养，悬浮培养15-25天直至愈伤组织长出；花药诱导液体培养基为：N6基本培养基+2.4-D2.0mg/L+天门冬氨酸1.0g/L+谷氨酰胺1.0g/L+酵母1g/L+蔗糖50g/L，PH为5.8；
d.花药愈伤的增殖培养：待三角瓶中悬浮培养的花药愈伤生长至1-2mm时，用80目已灭菌的筛网过滤，将筛网上的愈伤抖落到增殖培养基上，28℃、继续黑暗培养10-15天，直至花药愈伤长至3-5mm进行分化培养；增殖培养基为：MS基本培养基+2.4-D2.0mg/L+植物凝胶3.8g/L，PH5.8。
e.花药愈伤组织分化培养：将生长至3-5mm的愈伤组织转入分化培养基进行光照分化，光照条件为5000-6000Lux，光照周期为16小时/天，培养温度为28℃，经过20-30天分化苗长出；分化培养基为：MS基本培养基+6-BA3.0mg/L+KT1.5mg/L+NAA0.5mg/L+植物凝胶3.8g/L，PH为5.8
f.分化苗即花培苗的生根培养：将长至3-5cm的分化苗转移到装有生根培养基直径2.5cm、长25cm的玻璃管中，光照条件为5000-6000Lux，光照周期为16小时/天，培养温度为28℃，经过10-15天分化苗根长出并长长；生根培养基为：1/2MS基本培养基+0.2mg/LNAA+植物凝胶2.0g/L，PH为5.8；
g.花培苗炼苗、移栽：将根系生长较好的花培苗从生根培养基中轻轻拔出，用±28℃的温水洗去根上的培养基，将苗放入市场购买的育苗基质中，28℃-30℃光照培养7-15天，待花培苗长势良好时移栽到大田。
本发明的优点在于：能够大幅度提高普通野生稻杂交后代花药培养中愈伤诱导率和成苗率，加快水稻育种进程，提高水稻优良品种的选育效率；为加速利用野生稻优良基因选育水稻品种提供有力的技术支持。
附图说明：
图1为本发明实施例液体悬浮培养法和固体培养法诱导花药愈伤效率比较。
图2为本发明实施例液体悬浮培养法和固体培养法绿苗分化率比较。
具体实施方式：
实施例一：云南元江普通野生稻粳型杂交后代花药悬浮培养
本实施例以云南元江普通野生稻粳型杂交后代F1-24作为试验材料，采用本发明方法获得了单倍体植株。实施过程如下：
1)外植体的选择：在晴天早晨露水未干田间取幼穗，选取剑叶环和下一叶环之间距离为5cm的稻穗，穗子不破口，保留两片叶和叶鞘，用体积百分比为70％酒精棉球擦拭叶片和叶鞘，再按照不同株系用保鲜膜包裹幼穗，置于6℃冰箱中低温预处理7天。挑选小穗花药处于单核靠边期的枝梗，即：花药淡黄色，在颖壳内雄蕊长度接近颖片长度的1/2的稻穗进行花药愈伤诱导。
2)外植体灭菌：将幼穗叶片剥离后用体积百分比为70％的酒精棉球擦拭叶鞘，将枝梗剪为5厘米或7厘米的段，用体积百分比为70％的酒精浸泡30秒进行表面消毒，无菌蒸馏水冲洗4次或5次，再用质量体积百分比为0.1％的升汞表面消毒8分钟，其间不时上下摇动灭菌瓶，最后用无菌蒸馏水冲洗4次或5次。
3)花药愈伤液体悬浮诱导：灭菌后将穗子从苞叶中剥离，放在无菌滤纸上吸干多余的水分，用剪刀剪去颖壳的上部，注意不要剪到花药，用镊子的尖部挑出花药到盛有10ml液体诱导培养基的50ml三角瓶中，培养基为：N6基本培养基+2.4-D2.0mg/L+天门冬氨酸1.0g/L+谷氨酰胺1.0g/L+酵母1g/L+蔗糖50g/L，PH5.8。每瓶30枚花药。将接种花药的三角瓶放到摇床中28℃、100转/分钟黑暗下悬浮培养，每星期向三角瓶中加入一定的液体培养基，使瓶中的培养基体积维持在10ml，悬浮培养25天，直至愈伤组织长出。
4)花药愈伤的增殖培养：待三角瓶中悬浮培养的花药愈伤生长至直径1mm或2mm时，用80目已灭菌的筛网过滤，将筛网上的愈伤抖落到增殖培养基上，增殖培养基为MS+2.4-D2.0mg/L+植物凝胶3.8g/L，PH5.8，28℃黑暗培养10天，直至花药愈伤长至3-5mm进行分化培养。
5)花药愈伤组织分化培养：将生长至3mm或5mm的愈伤组织转入分化培养基MS+6-BA3.0mg/L+KT1.5mg/L+NAA0.5mg/L+植物凝胶3.8g/L，PH5.8进行分化培养，温度28℃、光照5000Lux或6000Lux、光照周期为16小时/天，培养20天分化苗长出。
6)分化苗即花培苗的生根培养：将长至3cm或5cm的分化苗转移生根培养基1/2MS基本培养基+0.2mg/LNAA+植物凝胶2.0g/L，PH为5.8上进行生根。分化苗将在直径2.5cm、长25cm的玻璃管中，温度28℃、光照5000-6000Lux、光照周期为16小时/天，经过10天分化苗根长出并成长。
7)花培苗炼苗、移栽：将花培苗从生根培养基中轻轻拔出，用±28℃的温水洗去根上的培养基，将苗放入市场购买的育苗基质中，28℃光照培养10天，待花培苗长势良好时移栽到大田。
在该实施例中花药愈伤诱导率达到110％以上(图1)，花培苗出苗率达到35％以上(图2)。
实施例二：云南元江普通野生稻籼型杂交后代花药悬浮培养
本实施例以云南元江普通野生稻籼型杂交后代SP13和SP15作为试验材料，采用本发明方法获得了单倍体植株。实施过程基本同实施例一，不同之处在于：
1)外植体的选择时选取剑叶环和下一叶环之间距离为7cm稻穗，挑选小穗花药处于单核靠边期的枝梗，即：花药淡黄色，在颖壳内雄蕊长度接近颖片长度接近2/5的稻穗进行花药愈伤诱导。
2)花药愈伤液体悬浮诱导时间为20天。
3)花药愈伤组织分化苗长出所需时间为30天。
Claims (1)
1.一种提高普通野生稻杂交后代花药培养效率的方法，其特征在于该培养方法的具体步骤如下：
a.外植体的选择：外植体的选择为田间取材，在晴天早晨露水未干时取幼穗，选取剑叶环和下一叶环之间距离为5-10cm的稻穗，穗子不破口，保留两片叶和叶鞘；田间取穗后立即放入盛有清水的桶中，以避免穗子失水；在实验室中用浸有体积百分比70％酒精的棉球擦拭叶片和叶鞘，再按照不同株系用保鲜膜包裹幼穗，置于4-6℃冰箱中低温预处理7-10天；
b.外植体灭菌：取出预处理后的幼穗，挑选小穗花药处于单核靠边期的枝梗，即：花药淡黄色，在颖壳内雄蕊长度接近颖片长度的1/2，长粒型野生稻雄蕊长度接近颖片长度2/5的稻穗；将幼穗叶片剥离后用浸有体积百分比70％酒精的棉球擦拭叶鞘，将枝梗剪为5-7厘米的段，用体积百分比为70％的酒精浸泡30秒进行表面消毒，无菌蒸馏水冲洗4-5次，再用质量体积百分比为0.1％的升汞表面消毒8分钟，其间不时上下摇动灭菌瓶，最后用无菌蒸馏水冲洗4-5次；
c.花药愈伤的液体悬浮诱导：灭菌后将穗子从苞叶中剥离，放在无菌滤纸上吸干多余的水分，用剪刀剪去颖壳的上部，注意不要剪到花药，用镊子的尖部挑出花药到诱导液体培养基中，每瓶30枚花药；将接种花药的三角瓶放到摇床中28℃、100-130转/分钟黑暗下悬浮培养，悬浮培养15-25天直至愈伤组织长出；花药诱导液体培养基为：N6基本培养基+2.4-D2.0mg/L+天门冬氨酸1.0g/L+谷氨酰胺1.0g/L+酵母1g/L+蔗糖50g/L，PH为5.8；
d.花药愈伤的增殖培养：待三角瓶中悬浮培养的花药愈伤生长至1-2mm时，用80目已灭菌的筛网过滤，将筛网上的愈伤抖落到增殖培养基上，28℃、继续黑暗培养10-15天，直至花药愈伤长至3-5mm进行分化培养；增殖培养基为：MS基本培养基+2.4-D2.0mg/L+植物凝胶3.8g/L，PH5.8；
e.花药愈伤组织分化培养：将生长至3-5mm的愈伤组织转入分化培养基进行光照分化，光照条件为5000-6000Lux，光照周期为16小时/天，培养温度为28℃，经过20-30天分化苗长出；分化培养基为：MS基本培养基+6-BA3.0mg/L+KT1.5mg/L+NAA0.5mg/L+植物凝胶3.8g/L，PH为5.8；
f.分化苗即花培苗的生根培养：将长至3-5cm的分化苗转移到装有生根培养基，直径2.5cm、长25cm的玻璃管中，光照条件为5000-6000Lux，光照周期为16小时/天，培养温度为28℃，经过10-15天分化苗根长出并长长；生根培养基为：1/2MS基本培养基+0.2mg/LNAA+植物凝胶2.0g/L，PH为5.8；
g.花培苗炼苗、移栽：将根系生长较好的花培苗从生根培养基中轻轻拔出，用28℃的温水洗去根上的培养基，将苗放入市场购买的育苗基质中，28℃-30℃光照培养7-15天，待花培苗长势良好时移栽到大田。
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