CN101142894A - 野生稻远缘杂交高效培养优良后代的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是野生稻远缘杂交高效培养优良后代的方法。经过栽培稻的杂交、胚挽救和壮苗培养、栽野杂交后代的花粉培养和分子标记辅助选育等过程培养得到野生稻远缘杂交高效优良后代。本发明的远缘杂交的成活率高，杂种后代早期先回交然后再自交，有利于克服野生稻与栽培稻杂种内基因组差异引起的生殖障碍，把更多的野生稻遗传性状稳定在栽培稻中，花粉培养可以加快杂交后代的纯合稳定，建立的分子标记辅助选育，使选育能在不受环境条件和生长发育时期的限制而准确地进行。
Description
技术领域
本发明涉及植物栽培技术，具体地说是野生稻远缘杂交高效培养优良后代的方法。
背景技术
水稻远缘杂交是在植物学形态分类上具有不同基因组类型的稻族间进行的杂交称水稻远缘杂交。远缘杂交在一定程度上打破了物种间的界限。稻属于禾本科稻属植物，现发现的有23个种。在中国分布有3种野生稻，而在云南拥有中国的3种野生稻即普通野生稻、药用野生稻及疣粒野生稻。
水稻远缘杂交是利用野生稻与栽培稻通过人为方式进行基因的交流，从而把不同具有优异的、独特性状不同程度地整合到一个杂种个体中，创造新的品系，这种方法是水稻育种的重要途径之一。在野生稻中由于基因型与栽培稻基因型存在一定的差异。普通野生稻染色体组型分为A＇A＇；药用野生稻染色体型为CC；疣粒野生稻染色体组型为GG，而栽培稻染色体组型为AA，染色体组有较大差异，导致栽培稻与野生稻杂交很困难，很难收到杂交种子，杂交以后的性状稳定也很困难。针对以上问题，本发明从各个环节上进行技术革新和优化。
发明内容
本发明的目的是提供一种成活率高、能大大缩短育种年限的野生稻远缘杂交高效培养优良后代的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一、栽培稻的杂交、胚挽救和壮苗培养
1)分批对栽培稻进行播种，以调节栽培稻的花期与野生稻的花期相遇。在栽野杂交中以栽培稻作为母本，野生稻作为父本进行杂交。在栽培稻开花前，一般在早晨，用剪刀剪去颖壳1/3，再用镊子挑去花药后进行套袋，以防止串粉。在对母本进行授粉前先收集一定量的母本花粉使其自然死亡(水稻花粉从花药中散发出来后在很短时间内即会死亡)。再用已经死亡的栽培稻花粉与野生稻花粉混合对母本进行授粉套袋处理。该种方法是使栽培稻花粉上的识别蛋白仍然能够诱导柱头接受野生稻的花粉，使母本成功授精。受精后由于父本与母本的遗传差异较大，亲缘关系较远，生理发育上也不协调，使幼胚停止，甚至死亡。针对这种情况在受粉的第2天开始，连续3-5天对受粉穗进行喷施浓度为50mg/L-100mg/L的GA3溶液，每天喷施3次。当幼胚长到10天左右时，取下幼胚进行胚挽救。此种方法获得幼胚的比例比不用GA3处理的高3-4倍。
2)水稻胚挽救：水稻胚挽救是水稻在进行远缘杂交时，由于杂交后胚乳败育或胚和胚乳生长不协调等原因，杂种幼胚得不到营养而发育受阻，针对这种情况，采用人工方式将幼胚剥离，进行胚挽救培养。
在水稻上采用受精后10-15天的杂种胚，用无菌水漂洗幼胚1-2次后，用75％酒精消毒30秒，再用0.1％的升汞灭菌5-10分钟，后用无菌水冲洗4-5次，用无菌滤纸吸干，剥离幼胚，接种在培养基上，胚挽救培养基WJ1的配方为：MSO+30g/L蔗糖+9g/L琼脂，PH5.8。
胚挽救过程都是在无菌条件下进行。幼胚接种在培养基上28-30℃下暗培养4-7天，待幼胚出芽后再进行光照培养，光照培养阶段的培养基WJ2成分为：MS+NAA0.1-0.5mg/L+KT1-3mg/L+30g/L蔗糖+9g/L琼脂，PH5.8。
3)壮苗培养：当幼苗长到3-5cm时，把幼苗转到壮苗培养基上，壮苗培养基ZM：MSO+30g/L蔗糖+10g/L哆效唑+9g/L琼脂，PH5.8；培养4周后，使苗长粗壮即可练苗处理；在原培养基中继续放置2天后洗去根部培养基再练苗3天，再移植到温室盆栽，1个月后基本成活，成活率可达85％以上。
二、栽野杂交后代的花粉培养
水稻花粉培养是指离体培养水稻花粉粒，诱导小孢子(单倍体)形成愈伤组织进而分化成完整的水稻植株，在培养过程中染色体加倍或人工加倍后，成为纯合的二倍体，该植株的后代就不会再发生基因分离，成为稳定的基因型。作为生物技术育种的主要措施之一，水稻花培在育种中的应用为我国的水稻生产作出了应有的贡献：在水稻的种之间的杂交育种中，花培广泛应用于恢复系的选育。而在杂种优势固定方面，用F1(杂交1代)进行花药培养可以获得超亲的纯系。
为了克服远缘杂交后代由于基因组的相溶性差，导致后代疯狂分离，要稳定性状，也需要多代的反复回交、自交和选择，而对杂交后代进行花粉培养，可加快目标性状的纯合，大大缩短育种年限。本发明利用栽野杂交后代的F2、F3(杂交2代、杂交3代)群体的花药(花粉)培养，利用IN、SUB、RE培养基配方，使花药培养成功率提高，在培养过程中，再生植株前，用0.1％～0.5％的秋水仙碱浸泡48-72小时，使培养植株成为双单倍体(DH)植株，该植株为纯合的二倍体植株，已固定为某种基因型，后代基因型和性状都不再发生分离。该技术通过杂交后代的花药培养，获得了具有不同基因型的双单倍体植株，通过加代扩繁，可以从中选择优良新品系或获得某些性状特别优良的株系。从杂交后代的F2、F3代就以人工方式加快性状纯合稳定，选育周期从常规的7-8年大大缩短到3-4年。
栽野杂交后代花药培养和双单倍体植株获得的方法：
1)材料的选取
取杂交后代的F2、F3植株的幼穗，出穗约0.5-1.5cm，穗子外包一层保鲜膜后，及时放入取样箱中，取样完后送回实验室；
2)培养前样品处理：
将穗子基部剪去2-4cm，放入加有蒸馏水的试管或培养瓶中，再置于5℃冰箱中，在5℃条件下放置5-10天，一方面可以减低材料的污染概率，另一方面可提高愈伤组织诱导率；
3)材料的灭菌方法
在超净台上剥开穗子，穗子用75％乙醇浸泡10秒钟，再用5％的次氯酸钠灭菌8-10min，无菌水清洗5-6次，无菌滤纸吸干水分，用剪刀剪开颖壳，用尖细镊子挑取花药接种于愈伤组织诱导培养基上；
4)愈伤组织的诱导培养
花粉培养愈伤组织诱导培养基IN配方为：N6+2，4-D1.5～4.0mg/L+KT0.2～1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂9g/L，pH5.8，培养条件为26℃～28℃黑暗诱导培养，8周后观察并统计诱导率；
5)愈伤组织继代培养
将生长旺盛的米黄色愈伤，接至继代培养基上，继代培养基SUB成分为：N6+2，4-D1.0-2.5mg/L+KT0.2-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂9g/L，pH5.8；根据愈伤生长状况和类型调整激素范围；培养条件为26℃黑暗培养，每4周继代一次，继代时注意挑选胚性愈伤组织，继代次数为1-3次为宜；
6)秋水仙碱处理愈伤组织
继代培养2周后的愈伤组织，在无菌条件下用0.1％～0.5％秋水仙碱(经过滤灭菌)处理，再放回26℃培养箱培养48～72小时，完毕后吸去多余的秋水仙碱，接种在分化培养基上再生植株；
7)双单倍体(DH)植株的分化培养
经秋水仙碱处理后的愈伤组织培养4-8周后，在分化培养时有部分愈伤褐化死亡，部分愈伤可恢复生长，分化培养基RE配方为N6+KT1.5-3.5mg/L+BA0.5-1.0mg/L+NAA0.2-0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂9g/L，pH5.8；每周观察记载愈伤组织生长分化情况，2个月左右可统计其植株再生率，每4周更换一次培养基直至分化出苗，培养条件为：温度25℃-26℃，每天光照10-12小时，光照强度为40-50umol/m2.s，分化时严格控制温度及光强，否则出苗率降低；
8)壮苗、练苗及移栽
当分化苗长到约5cm时，转入不加任何激素的MSO培养基中，约4周后苗可长到10-15cm，可以进行练苗，加10-20mL水入培养瓶中，加透气封口膜，练苗2-5天，可移植温室盆栽，在最初5-10天用薄膜覆盖以保湿，定时通风透气，20-30天成活后可移栽到大田，进行观察、鉴定，能正常结实的为加倍的DH植株，在收获后的下一代可进行分子标记辅助选育。
三、分子标记辅助选育
近二十年来迅速发展的基于DNA的分子生物学技术，如分子标记和作图技术，不仅使鉴定数量性状基因位点成为可能，同时能够借助分子标记对目标性状的基因进行选择，这就是所谓的“分子标记辅助选择”(marker assisted selection，MAS)。其中RAPD具有多态性高、无需活材料、不要求预先知道检测样品基因组序列信息，对比其它的DNA分子标记技术，减少了多态性分析的预备工作，在实验繁琐程度和费用上占有优势。本发明利用RAPD分子标记对普通野生稻和栽培稻杂交后，经过花粉培养和染色体加倍的DH后代材料进行遗传多样性分析，为进一步发掘优良的野生稻种质资源，培育高产、优质和多抗的优良品种提供一定的试验依据。
1)实验材料
(元江)普通野生稻：具有A′A′染色体组型，多年生，宿根，具有匍匐茎。株高可达179cm，结实率低，有高节位分蘖，分蘖能力非常强，长势旺，具有高产QTL(数量性状位点)；匍匐茎质硬而壁厚中空，节间微紫，着粒稀，长芒，花药长、柱头紫色外露，谷粒黄、黑、褐色，有边成熟边落粒的特点；
栽培稻：生长整齐、清秀，较耐肥、稳产，分蘖力比(元江)普通野生稻差，分蘖成穗率高，属多穗型品种，穗均匀，结实率高，空秕率29％，全生育期191d，较早熟，抽穗较同类地区种植品种早6-8d；株高78.3-94.8cm；
采用2个亲本杂交的DH群体材料(如前所述，所有材料均采自云南省元江县农科所大水坪乡试验基地)，植株的高低，结实率高低和分蘖率高低均与普通栽培稻作为对照进行划分。
所用56个随机引物均购自Operon公司，从中筛选出16个引物，引物长度均为10bp，16个引物分别是：Opc15、Oph20、Opn01、Opn03、Opn05、Opn08、Opn10、Opn13、Opn17、Opn18、Opn19、Opt02、Opt04、Opt12、Opt13、Opy13。
2)水稻总基因组DNA的提取
参照Clark的《植物分子生物学实验手册》进行。
3)反应体系
DNA模板约20ng，10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mmol/L MgCl22.5μL，2.5mmol/LdNTP2.0μL，12.5μmol/L随机引物(以上随机引物的任一种)1.0μL，Taq DNA聚合酶1.0U，加ddH2O至25μl，PCR反应相关试剂均购自华美生物工程公司。
扩增程序为：92℃预变性2min后，92℃变性45sec，40℃退火75sec，72℃延伸90sec，共45个循环，最后72℃再延伸5min；PCR反应在美国MJ RESEARCH公司生产的PTC-200上进行；扩增产物用浓度为2.0％的琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统拍照后读取DNA条带进行数据分析。
4)RAPD(随机引物扩增片断多态性)数据整理及分析
将RAPD扩增产物的每一条带视为一个形态性状，有带出现时赋值为“1”，无此带时赋值为“0”，将数据输入Popgen软件包中，根据所得遗传距离，UPGMA(unweightedpairgroup method with arithmetic average)法进行聚类，并绘制树状图。
5)建立分子标记
5).1遗传多样性分析
a.株高
该样品采用的是混合样品，即实际上为基因池，就同一种性状的2个差异基因池，它们之间除了该性状的基因差异外，其余的遗传差异被混合降低了，利用5个引物Opt04、Opt16、Opy13、Opn19、Oph20对2个亲本及其F3代(DH群体)2种性状(高株和矮株)的混合样品进行了扩增，结果表明：5个引物共扩增出47条重复性高、清晰的条带，分子量从300bp到2500bp之间，平均每个引物可扩增出9.4条带，其中有35条为多态条带，多态条带比率(PPB)达74.47％，平均每个RAPD引物获得7.0个多态条带，Nei’s平均多样性指数为0.3085。
b.结实率
利用5个引物(Opc15、Opt02、Opt04、Opt13、Opy13)对元江普通野生稻、栽培稻及其F2代的2种性状(高结实率和低结实率)的8份(高2份、低6份)材料进行了扩增，结果表明：5个引物共扩增出58条重复性高、清晰的条带，分子量从400bp到2500bp之间。
平均每个引物可扩增出11.6条带，其中有50条为多态条带，多态条带比率(PPB)达86.21％，平均每个RAPD引物获得10.0个多态条带，Nei’s平均多样性指数为0.2921。其中，结实率高的样品的遗传多样性偏低，共有19条多态条带，PPB仅为32.76％，Nei’s平均多样性指数为0.1638；而结实率低的样品有41条多态条带，PPB达70.69％，Nei’s平均多样性指数为0.2749。
c.分蘖率
利用10个引物Opn01、Opn03、Opn05、Opn08、Opn10、Opn13、Opn17、Opn18、Opn19、Oph20对(元江)普通野生稻、栽培稻及其F3代的2种性状(高分蘖能力和低分蘖能力)的18份(高9份、低9份)材料进行了扩增，结果表明：10个引物共扩增出129条重复性高、清晰的条带，分子量从400bp到2500bp。
平均每个引物可扩增出12.9条带，其中有124条为多态条带，多态条带比率(PPB)达96.12％，平均每个RAPD引物获得12.4个多态条带，Nei’s平均多样性指数为0.2464。其中，分蘖能力高的样品有103条多态条带，PPB达79.84％，Nei’s平均多样性指为0.2500；而分蘖能力低的样品有71条多态条带，PPB仅为55.04％，Nei’s平均多样性指数为0.1880。
5).2分子标记辅助选育
在F3代的DH群体的后代，苗期选取许多株系的植株叶片，取叶片提取的总DNA样品，然后用该样品为摸板，上述确定的株高、分蘖率、结实率的紧密连锁的RAPD分子标记，进行PCR扩增，然后进行电泳观察，如果出现相应的PCR条带，说明该植株苗可能具有需要的株高，分蘖率、结实率遗传特性，留下这些苗继续培养，淘汰没有对应PCR条带的植株苗，减少了工作量。
通过以上措施，可以提高选育的准确性，提早选育，减少工作量，提高了选择效率。
本发明与现有技术比较具有以下积极效果：
本发明的方法大幅度提高了普通野生稻与栽培稻杂交成功率，经胚挽救后获得杂种植株。远缘杂交成功率可以从0-3％提高到60％-70％，完全能满足远缘杂交的需要，并对今后其它植物的远缘杂交具有很好的借鉴和指导作用。实践证明，用该种特殊的杂交方法和胚挽救技术是克服远缘杂交不亲和的有效方法。通过胚挽救、花粉培养和染色体加倍、分子标记辅助选育的革新和综合配套使用，可在3-4年的时间内成功地把(云南)普通野生稻的优良遗传特性转移到栽培稻中，获得3个新品系，20份综合性状优良株系。
本发明克服了远缘杂交后代由于基因组的相溶性差，导致后代疯狂分离，需要多代反复回交、自交和选择才能稳定性状的缺陷，而对杂交后代进行花粉培养，可加快目标性状的纯合，大大缩短育种年限。
本发明利用RAPD分子标记对普通野生稻和栽培稻杂交后，经过花粉培养和染色体加倍的DH后代材料进行遗传多样性分析，为进一步发掘优良的野生稻种质资源，培育高产、优质和多抗的优良品种提供一定的试验依据。
本发明的方法具有远缘杂交的成活率高，杂种后代早期先回交然后再自交，有利于克服野生稻与栽培稻杂种内基因组差异引起的生殖障碍，把更多的野生稻遗传性状稳定在栽培稻中，花粉培养可以加快杂交后代的纯合稳定，建立的分子标记辅助选育，使选育能在不受环境条件和生长发育时期的限制而准确地进行等优点。
附图说明
图1是植物远缘杂交高效培养优良后代总体技术路线图；
图2是植物远缘杂交高效培养优良后代的具体方案图。
具体实施方式
实施例1：
一、栽培稻的杂交、胚挽救和壮苗培养
1)分批对栽培稻进行播种，以调节栽培稻的花期与野生稻的花期相遇。在栽野杂交中以栽培稻作为母本，以元江普通野生稻作为父本进行杂交。在栽培稻开花前，一般在早晨，用剪刀剪去颖壳1/3，再用镊子挑去花药后进行套袋，以防止串粉。在对母本进行授粉前先收集一定量的母本花粉使其自然死亡(水稻花粉从花药中散发出来后在很短时间内即会死亡)。再用已经死亡的栽培稻花粉与野生稻花粉混合对母本进行授粉套袋处理。该种方法是使栽培稻花粉上的识别蛋白仍然能够诱导柱头接受野生稻的花粉，使母本成功授精。受精后由于父本与母本的遗传差异较大，亲缘关系较远，生理发育上也不协调，使幼胚停止，甚至死亡。针对这种情况在受粉的第2天开始，连续3-5天对受粉穗进行喷施浓度为50mg/L的GA3溶液，每天喷施3次。当幼胚长到10天左右时，取下幼胚进行胚挽救。此种方法获得幼胚的比例比不用GA3处理的高3-4倍。
2)水稻胚挽救：水稻胚挽救是水稻在进行远缘杂交时，由于杂交后胚乳败育或胚和胚乳生长不协调等原因，杂种幼胚得不到营养而发育受阻，针对这种情况，采用人工方式将幼胚剥离，进行胚挽救培养。
在水稻上采用受精后10-15天的杂种胚，用无菌水漂洗幼胚1-2次后，用75％酒精消毒30秒，再用0.1％的升汞灭菌5-10分钟，后用无菌水冲洗4-5次，用无菌滤纸吸干，用解剖镜在超净工作台上剥离幼胚，接种在培养基上，胚挽救培养基WJ1的配方为：MSO+30g/L蔗糖+9g/L琼脂，PH5.8。
胚挽救过程都是在无菌条件下进行。幼胚接种在培养基上28-30℃下暗培养4-7天，幼胚出芽后再进行光照培养，光照培养阶段的培养基WJ2成分为：MS+NAA0.1mg/L+KT3mg/L+30g/L蔗糖+9g/L琼脂，PH5.8。
3)壮苗培养：当幼苗长到3-5cm时，把幼苗转到壮苗培养基上。壮苗培养基ZM：MSO+30g/L蔗糖+10g/L哆效唑+9g/L琼脂，PH5.8；培养4周后，使苗长粗壮即可练苗处理；先打开瓶盖，放入20mL左右自来水，再用一个瓶子反扣在上面以保湿，在原培养基中继续放置2天后洗去根部培养基再练苗3天，再移植到温室盆栽，1个月后基本成活，成活率可达85％以上。
二、栽野杂交后代的花粉培养
栽野杂交后代花药培养和双单倍体植株获得的方法：
1)材料的选取
取杂交后代的F2、F3植株的幼穗，出穗约0.5-1.5cm，穗子外包一层保鲜膜后，及时放入取样箱中，取样完后应尽快将样品从基地送回实验室；
2)培养前样品处理：
用剪刀将穗子基部剪去2-4cm，放入加有蒸馏水的试管或培养瓶中，再置于5℃冰箱中，注意不要折断或挤压穗子，在5℃条件下放置5-10天，一方面可以减低材料的污染概率，另一方面可提高愈伤组织诱导率；
3)材料的灭菌方法
在超净台上剥开穗子，穗子用75％乙醇浸泡10秒钟，再用5％的次氯酸钠灭菌8-10min，无菌水清洗5-6次，无菌滤纸吸干水分，用剪刀剪开颖壳，用尖细镊子挑取花药接种于愈伤组织诱导培养基上，培养器皿为三角瓶或罐头瓶，封口膜为透气型。
4)愈伤组织的诱导培养
花粉培养愈伤组织诱导培养基IN配方为：N6+2，4-D2.0 mg/L+KT 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂9g/L，pH5.8，培养条件为26℃-28℃黑暗诱导培养，8周后观察并统计诱导率。
5)愈伤组织继代培养
将生长旺盛的米黄色愈伤，接至继代培养基上，继代培养基SUB成分为：N6+2，4-D1.5mg/L+KT0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂9g/L，pH5.8；根据愈伤生长状况和类型调整激素范围。培养条件为26℃黑暗培养，每4周继代一次，继代时注意挑选胚性愈伤组织，继代次数为1-3次为宜。
6)秋水仙碱处理愈伤组织
继代培养2周后的愈伤组织，在无菌条件下用0.1％秋水仙碱(经过滤灭菌)处理，再放回26℃培养箱培养48-72小时，完毕后吸去多余的秋水仙碱，接种在分化培养基上再生植株。
7)双单倍体(DH)植株的分化培养
经秋水仙碱处理后的愈伤组织培养4-8周后，在分化培养时有部分愈伤褐化死亡，部分愈伤可恢复生长，分化培养基RE配方为N6+KT2.5mg/L+BA1.0 mg/L+NAA0.25mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH5.8；每周观察记载愈伤组织生长分化情况，2个月左右可统计其植株再生率，每4周更换一次培养基直至分化出苗，培养条件为：温度25℃-26℃，每天光照10-12小时，光照强度为40-50umol/m2.s，分化时严格控制温度及光强，否则出苗率降低。
8)壮苗、练苗及移栽
当分化苗长到约5cm时，转入不加任何激素的MSO培养基中，约4周后苗可长到10-15cm，可以进行练苗，打开培养瓶口，加10-20mL水，加透气封口膜，练苗2-5天，可移植温室盆栽，在最初5-10天用薄膜覆盖以保湿，定时通风透气，20-30天成活后可移栽到大田，进行观察、鉴定，能正常结实的为加倍的DH植株，在收获后的下一代可进行分子标记辅助选育。
三、分子标记辅助选育
1)实验材料
元江普通野生稻：具有A＇A＇染色体组型，多年生，宿根，具有匍匐茎，株高可达179cm，结实率低，有高节位分蘖，分蘖能力非常强，长势旺，具有高产QTL(数量性状位点)，匍匐茎质硬而壁厚中空，节间微紫，着粒稀，长芒，花药长、柱头紫色外露，谷粒黄、黑、褐色，有边成熟边落粒的特点；
栽培稻：生长整齐、清秀，较耐肥、稳产，分蘖力比元江普通野生稻差，分蘖成穗率高，属多穗型品种，穗均匀，结实率高，空秕率29％；全生育期191d，较早熟，抽穗较同类地区种植品种早6-8d；株高78.3-94.8cm；
采用2个亲本杂交的DH群体材料(如前所述，所有材料均采自云南省元江县农科所大水坪乡试验基地)，植株的高低，结实率高低和分蘖率高低均与普通栽培稻作为对照进行划分；
所用56个随机引物均购自Operon公司，从中筛选出16个引物，引物长度均为10bp，16个引物分别是：Opc15、Oph20、Opn01、Opn03、Opn05、Opn08、Opn10、Opn13、Opn17、Opn18、Opn19、Opt02、Opt04、Opt12、Opt13、Opy13。
2)水稻总基因组DNA的提取
参照Clark的《植物分子生物学实验手册》进行。
3)反应体系
DNA模板约20ng，10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mmol/L MgCl22.5μL，2.5mmol/LdNTP 2.0μL，12.5μmol/L随机引物1.0μL，Taq DNA聚合酶1.0U，加ddH2O至25μl，PCR反应相关试剂均购自华美生物工程公司。
扩增程序为：92℃预变性2min后，92℃变性45sec，40℃退火75sec，72℃延伸90sec，共45个循环，最后72℃再延伸5min；PCR反应在美国MJ RESEARCH公司生产的PTC-200上进行；扩增产物用浓度为2.0％的琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统拍照后读取DNA条带进行数据分析。
4)RAPD数据整理及分析
将RAPD扩增产物的每一条带视为一个形态性状，有带出现时赋值为“1”，无此带时赋值为“0”，将数据输入Popgen软件包中，根据所得遗传距离，UPGMA(unweightedpairgroup method with arithmetic average)法进行聚类，并绘制树状图。
5)建立分子标记
5).1遗传多样性分析
a.株高
该样品采用的是混合样品，即实际上为基因池，就同一种性状的2个差异基因池，它们之间除了该性状的基因差异外，其余的遗传差异被混合降低了，利用5个引物Opt04、Opt16、Opy13、Opn19、Oph20对2个亲本及其F3代(DH群体)2种性状(高株和矮株)的混合样品进行了扩增，结果表明：5个引物共扩增出47条重复性高、清晰的条带，分子量从300bp到2500bp之间，平均每个引物可扩增出9.4条带，其中有35条为多态条带，多态条带比率(PPB)达74.47％，平均每个RAPD引物获得7.0个多态条带，Nei’s平均多样性指数为0.3085。
b.结实率
利用5个引物(Opc15、Opt02、Opt04、Opt13、Opy13)对元江普通野生稻、栽培稻及其F2代的2种性状(高结实率和低结实率)的8份(高2份、低6份)材料进行了扩增，结果表明：5个引物共扩增出58条重复性高、清晰的条带，分子量从400bp到2500bp之间。平均每个引物可扩增出11.6条带，其中有50条为多态条带，多态条带比率(PPB)达86.21％，平均每个RAPD引物获得10.0个多态条带，Nei’s平均多样性指数为0.2921。其中，结实率高的样品的遗传多样性偏低，共有19条多态条带，PPB仅为32.76％，Nei’s平均多样性指数为0.1638；而结实率低的样品有41条多态条带，PPB达70.69％，Nei’s平均多样性指数为0.2749。
c.分蘖率
利用10个引物Opn01、Opn03、Opn05、Opn08、Opn10、Opn13、Opn17、Opn18、Opn19、Oph20对元江普通野生稻、栽培稻及其F3代的2种性状(高分蘖能力和低分蘖能力)的18份(高9份、低9份)材料进行了扩增，结果表明：10个引物共扩增出129条重复性高、清晰的条带，分子量从400bp到2500bp。平均每个引物可扩增出12.9条带，其中有124条为多态条带，多态条带比率(PPB)达96.12％，平均每个RAPD引物获得12.4个多态条带，Nei’s平均多样性指数为0.2464。其中，分蘖能力高的样品有103条多态条带，PPB达79.84％，Nei’s平均多样性指为0.2500；而分蘖能力低的样品有71条多态条带，PPB仅为55.04％，Nei’s平均多样性指数为0.1880。
5).2分子标记辅助选育
在F3代的DH群体的后代，苗期选取许多株系的植株叶片，取叶片提取的总DNA样品，然后用该样品为摸板，上述确定的株高、分蘖率、结实率的紧密连锁的RAPD分子标记，进行PCR扩增，然后进行电泳观察，如果出现相应的PCR条带，说明该植株苗可能具有需要的株高，分蘖率、结实率遗传特性，留下这些苗继续培养，淘汰没有对应PCR条带的植株苗，减少了工作量。
实施例2：
方法与上述实施例1基本相同，不同的是：
一、野生稻亲本材料为云南普通野生稻的另外一种重要类型，即景洪普通野生稻。
一、1)中：从受粉的第2天开始，连续3-5天对受粉穗进行喷施浓度为100mg/L的GA3(赤霉素)溶液，每天喷施3次。
一、2)水稻胚挽救中：培养基WJ2成分为：MS+NAA0.5mg/L+KT1mg/L+30g/L蔗糖+9g/L琼脂，PH5.8。
二、栽野杂交后代的花粉培养：
4)中：花粉愈伤组织诱导培养基IN配方调整为：N6+2，4-D3.0mg/L+KT1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂9g/L，pH5.8。
5)中：继代培养基SUB成分为：N6+2，4-D2.5mg/L+KT1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂9g/L，pH5.8；
6)中：继代培养2周后的愈伤组织，在无菌条件下用0.5％秋水仙碱(经过滤灭菌)处理，再放回26℃培养箱培养72小时，完毕后吸去多余的秋水仙碱，接种在分化培养基上再生植株。
7)中：DH植株分化培养基RE配方调整为：N6+KT3.5mg/L+BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂9g/L，pH5.8。
三、分子标记辅助选育：分子标记建立方法与实施例1相同，确定的株高、分蘖率、结实率对应分子标记个别有差异。
其它与实施例1相同。整体实施效果一致。
实施例3：
方法与上述实施例1基本相同，不同的是：
一、2)水稻胚挽救中：培养基WJ2成分为：MS+NAA0.25mg/L+KT2mg/L+30g/L蔗糖+9g/L琼脂，PH5.8。
二、栽野杂交后代的花粉培养：
4)中：花粉愈伤组织诱导培养基IN配方调整为：N6+2，4-D2.5mg/L+KT0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂9g/L，pH5.8。
5)中：继代培养基SUB成分为：N6+2，4-D2.0mg/L+KT0.6mg/L+蔗糖30g/L+琼脂9g/L，pH5.8；
6)中：继代培养2周后的愈伤组织，在无菌条件下用0.3％秋水仙碱(经过滤灭菌)处理，再放回26℃培养箱培养72小时，完毕后吸去多余的秋水仙碱，接种在分化培养基上再生植株。
7)中：DH植株分化培养基RE配方调整为：N6+KT2.0mg/L+BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂9g/L，pH5.8。
三、分子标记辅助选育与实施例1相同。
Claims (5)
1.一种野生稻远缘杂交高效培养优良后代的方法，其特征在于按以下进行：
(1)、栽培稻的杂交、胚挽救和壮苗培养
1)分批对栽培稻进行播种，以调节栽培稻的花期与野生稻的花期相遇，在栽野杂交中以栽培稻作为母本，野生稻作为父本进行杂交；在栽培稻开花前，剪去颖壳1/3，挑去花药后进行套袋；在对母本进行授粉前先收集一定量的母本花粉使其自然死亡，再用已经死亡的栽培稻花粉与野生稻花粉混合对母本进行授粉套袋，使母本成功授精；在受粉的第2天开始，连续3-5天对受粉穗进行喷施浓度为50mg/L-100mg/L的GA3溶液，每天喷施3次，当幼胚长到10天左右时，取下幼胚进行胚挽救；
2)水稻胚挽救：在水稻上采用受精后10-15天的杂种胚，用无菌水漂洗幼胚1-2次后，用75％酒精消毒30秒，再用0.1％的升汞灭菌5-10分钟，后用无菌水冲洗4-5次，用无菌滤纸吸干，剥离幼胚，接种在培养基上；胚挽救过程在无菌条件下进行，幼胚接种在培养基上28-30℃下暗培养4-7天，待幼胚出芽后再进行光照培养；
3)壮苗培养：当幼苗长到3-5cm时，把幼苗转到壮苗培养基上，培养4周后，使苗长粗壮即可练苗处理，在原培养基中继续放置2天后洗去根部培养基再练苗3天，再移植到温室盆栽，1个月后基本成活；
(2)、栽野杂交后代的花粉培养
1)材料的选取：
取杂交后代的F2、F3植株的幼穗，出穗约0.5-1.5cm，穗子外包一层保鲜膜后，及时放入取样箱中；
2)培养前样品处理：
将穗子基部剪去2-4cm，放入加有蒸馏水的试管或培养瓶中，再置于5℃冰箱中，在5℃条件下放置5-10天，提高愈伤组织诱导率；
3)材料的灭菌：
在超净台上剥开穗子，穗子用75％乙醇浸泡10秒钟，再用5％的次氯酸钠灭菌8-10min，无菌水清洗5-6次，无菌滤纸吸干水分，剪开颖壳，挑取花药接种于愈伤组织诱导培养基上；
4)愈伤组织的诱导培养：
花粉培养愈伤组织诱导培养基培养，培养条件为26℃-28℃黑暗诱导培养，8周后观察并统计诱导率；
5)愈伤组织继代培养：
将生长旺盛的米黄色愈伤，接至继代培养基上，培养条件为26℃黑暗培养，每4周继代一次，继代次数为1-3次为宜；
6)秋水仙碱处理愈伤组织：
继代培养2周后的愈伤组织，在无菌条件下用0.1％-0.5％秋水仙碱浸泡，再放回26℃培养箱培养48-72小时，完毕后吸去多余的秋水仙碱，接种在分化培养基上再生植株；
7)双单倍体植株的分化培养：
经秋水仙碱处理后的愈伤组织分化培养4-8周后，在分化培养时有部分愈伤褐化死亡，部分愈伤可恢复生长，每周观察记载愈伤组织生长分化情况，2个月左右可统计其植株再生率，每4周更换一次培养基直至分化出苗，培养条件为：温度25℃-26℃，每天光照10-12小时，光照强度为40-50umol/m2.s；
8)壮苗、练苗及移栽：
当分化苗长到约5cm时，转入不加任何激素的MSO培养基中，约4周后苗可长到10-15cm，可以进行练苗，加10-20mL水入培养瓶中，加透气封口膜，练苗2-5天，可移植温室盆栽，在最初5-10天用薄膜覆盖以保湿，定时通风透气，20-30天成活后可移栽到大田，进行观察、鉴定，能正常结实的为加倍的DH植株，在收获后的下一代可进行分子标记辅助选育；
(3)、分子标记辅助选育
1)实验材料
普通野生稻：具有A′A′染色体组型，多年生，宿根，具有匍匐茎，株高可达179cm，结实率低，有高节位分蘖，分蘖能力非常强，长势旺，具有高产QTL；匍匐茎质硬而壁厚中空，节间微紫，着粒稀，长芒，花药长、柱头紫色外露，谷粒黄、黑、褐色，有边成熟边落粒的特点；
栽培稻：生长整齐、清秀，较耐肥、稳产，分蘖力比普通野生稻差，分蘖成穗率高，属多穗型品种，穗均匀，结实率高，空秕率29％，全生育期191d，较早熟，抽穗较同类地区种植品种早6-8d；株高78.3-94.8cm；
采用2个亲本杂交的DH群体材料，植株的高低，结实率高低和分蘖率高低均与普通栽培稻作为对照进行划分；
所用的筛选出的16个引物为：引物长度均为10bp，分别是：Opc15、Oph20、Opn01、Opn03、Opn05、Opn08、Opn10、Opn13、Opn17、Opn18、Opn19、Opt02、Opt04、Opt12、Opt13、Opy13；
2)用现有方法提取水稻总基因组DNA；
3)反应体系
DNA模板约20ng，10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mmol/L MgCl2 2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2.0μL，12.5μmol/L随机引物1.0μL，Taq DNA聚合酶1.0U，加ddH2O至25μl；
扩增程序为：92℃预变性2min后，92℃变性45sec，40℃退火75sec，72℃延伸90sec，共45个循环，最后72℃再延伸5min；PCR反应在美国MJ RESEARCH公司生产的PTC-200上进行；扩增产物用浓度为2.0％的琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统拍照后读取DNA条带进行数据分析；
4)RAPD数据整理及分析
将RAPD扩增产物的每一条带视为一个形态性状，有带出现时赋值为“1”，无此带时赋值为“0”，将数据输入Popgen软件包中，根据所得遗传距离，UPGMA法进行聚类，并绘制树状图；
5)建立分子标记
5).1遗传多样性分析，进行株高、结实率和分蘖率的多样性分析；
5).2分子标记辅助选育：
在F3代的DH群体的后代，苗期选取许多株系的植株叶片，取叶片提取的总DNA样品，然后用该样品为摸板，上述确定的株高、分蘖率、结实率的紧密连锁的RAPD分子标记，进行PCR扩增，然后进行电泳观察，当出现相应的PCR条带，留下具有需要的株高、分蘖率、结实率遗传特性的苗继续培养，淘汰没有对应PCR条带的植株苗。
2.根据权利要求1所述的野生稻远缘杂交高效培养优良后代的方法，其特征在于光照培养阶段的培养基WJ2成分为：MS+NAA 0.1-0.5mg/L+KT 1-3mg/L+30g/L蔗糖+9g/L琼脂，PH5.8。
3.根据权利要求1所述的野生稻远缘杂交高效培养优良后代的方法，其特征在于花粉培养愈伤组织诱导培养基IN配方为：N6+2，4-D 1.5-4.0mg/L+KT 0.2-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂9g/L，pH5.8。
4.根据权利要求1所述的野生稻远缘杂交高效培养优良后代的方法，其特征在于继代培养基SUB成分为：N6+2，4-D 1.0-2.5mg/L+KT 0.2-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂9g/L，pH5.8。
5.根据权利要求1所述的野生稻远缘杂交高效培养优良后代的方法，其特征在于分化培养基RE配方为N6+KT 1.5-3.5mg/L+BA 0.5-1.0mg/L+NAA 0.2-0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8-9g/L，pH5.8。
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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Open date: 20080319 |