CN107603977A

CN107603977A - 水稻落粒性基因qSH1的功能标记及其应用

Info

Publication number: CN107603977A
Application number: CN201710874231.9A
Authority: CN
Inventors: 张泽民; 梁嘉燕; 邹虎成; 谢庆军; 陈雄辉
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2017-09-25
Filing date: 2017-09-25
Publication date: 2018-01-19

Abstract

本发明公开了一种水稻落粒性基因qSH1的功能标记及其应用。本发明中根据引起落粒性基因qSH1表型差异的单核苷酸突变，设计合成了三条引物：SH1‑F1、SH1‑F2和SH1‑R，三条引物在同一PCR体系中对水稻DNA进行扩增，然后对扩增产物通过电泳检测落粒性基因的基因型。利用该功能标记可以快速准确地筛选鉴别大量水稻种质资源的落粒性，提高选育效率，可用于对水稻落粒性进行早期辅助选择，从而加快育种进程。

Description

水稻落粒性基因qSH1的功能标记及其应用

技术领域

本发明属于农业生物领域，特别涉及一种水稻落粒性基因qSH1的功能标记及其应用。

背景技术

耐脱粒性状是选育适合机械化种植的水稻新品种的主要育种目标之一，选育具有合适耐脱粒性的水稻材料，对降低水稻收获期间由于落粒造成的减产具有重要意义。而明确育种亲本材料的脱粒难易程度，能有效提高选育效率。

根据已有的研究，水稻落粒性主效QTL qSH1解析了68.6％的表型变异。qSH1编码一个BEL1型同源异型蛋白，该基因开放阅读框上游12kb的一个SNP引起落粒性的差异。该SNP在易落粒品种Kasalath和Oryza rufipogen Griff.中为G碱基，在不易落粒品种日本晴中为T碱基。该SNP位于RY重复序列，可能影响了与ABI3型转录因子的结合，造成qSH1表达部位的差异，导致日本晴的小穗基部无法形成离层，从而导致不易落粒(耐落粒)。

目前未有针对qSH1开发的功能标记，只能通过收获期的落粒表型判断落粒性，影响育种进程。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种水稻落粒性基因qSH1的功能标记。

本发明的另一目的在于提供所述水稻落粒性基因qSH1的功能标记的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：水稻落粒性基因qSH1的功能标记，所述的水稻落粒性基因qSH1的落粒性基因的显性分子标记SH1通过如下三条引物获得功能标记，序列方向为5’-3’：

SH1-F1引物：GTATTGATGTATACTGGACGTTT；

SH1-F2引物：GATGTATACTGGCCATTG；

SH1-R引物：TTTGAAGTATCCACGGTC。

所述的引物用于扩增水稻基因组DNA时，在易落粒水稻中显示为129bp的片段，而在不易落粒水稻中显示为134bp的片段。

所述的水稻落粒性基因qSH1的功能标记，采用以下步骤进行分子标记：

(1)提取水稻基因组DNA；

(2)PCR扩增：将所述的SH1-F1、SH1-F2和SH1-R引物加入到PCR反应体系中，对步骤(1)中提取得到的水稻基因组DNA进行扩增，得到扩增产物；

(3)将步骤(2)中得到的扩增产物进行凝胶电泳，并进行染色，得到电泳图；

(4)根据步骤(3)中得到的电泳图进行分析，如果显示为129bp的片段，则为易落粒水稻，如果显示为134bp的片段，则为不易落粒水稻。

步骤(1)中所述的水稻基因组DNA的提取方法为常规提取方法；优选为TPS简易法。

步骤(2)中所述的PCR的反应体系为20μl反应体系：2.0μl的10×PCR buffer，0.5μl的10mM dNTPs，10μM的SH1-F1、10μM的SH1-F2和10μM的SH1-R各0.5μl，0.2μl的Taq DNA聚合酶，2.0μl的模板DNA(水稻基因组DNA)，13.8μl的ddH₂O。

步骤(2)中所述的PCR的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，48℃退火30sec，72℃延伸1min，34个循环；最后72℃延伸5min。

步骤(3)中所述的凝胶电泳为在6％(w/w)聚丙烯酰胺变性凝胶中进行电泳。

步骤(3)中所述的染色为硝酸银染色；优选为用1％(w/w)硝酸银进行染色。

所述的水稻落粒性基因qSH1的功能标记在水稻育种中的应用，该水稻落粒性基因qSH1的功能标记可用于对水稻落粒性进行早期辅助选择，加快育种进程。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明基于水稻落粒性基因qSH1在落粒与非落粒水稻的上游存在的单核苷酸突变，根据该位点设计了PCR功能标记，该水稻落粒性基因显性功能标记SH1包括3条引物，可用于对水稻落粒性进行早期辅助选择，从而加快育种进程。

2、通过本发明的方法，利用PCR和电泳技术即可有效地对水稻落粒性基因进行基因型筛选鉴别，可在水稻苗期区分水稻材料的落粒性，大大提高了选育适用于机械化生产的水稻的育种效率。

3、本发明根据引起落粒性基因qSH1表型差异的单核苷酸突变，设计合成了三条引物：SH1-F1、SH1-F2和SH1-R，三条引物在同一PCR体系中对水稻DNA进行扩增，然后对扩增产物通过电泳检测落粒性基因的基因型。利用该功能标记可以快速准确地筛选鉴别大量水稻种质资源的落粒性，提高选育效率。

附图说明

图1是本发明落粒性功能标记的位置示意图(扩增区段的方框内碱基为目标SNP，扩增区段带有下划波浪线的序列为SH1-R结合位置；SH1-F1和SH1-F2中下划线标注为人为引入的错配碱基)。

图2是本发明落粒性功能标记检测4个水稻品种的电泳图；其中，M为DNA分子量marker；1为不易落粒品种日本晴，2～4为易落粒品种东乡野生稻、增城野生稻和高州野生稻。

图3是本发明落粒性功能标记检测“三系”水稻育种亲本的部分电泳结果图；其中，M为DNA分子量marker；1～10分别为恢复系株系D50、恢复系株系D51、恢复系株系D52、恢复系株系K50、恢复系株系K51、恢复系株系K52、保持系株系B50、保持系株系B51、保持系株系B52、恢复系株系D59。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

以下实施方法中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。

本发明基于水稻落粒性基因qSH1在落粒与非落粒水稻的上游存在的单核苷酸突变，根据该位点设计了PCR功能标记。

所述的水稻落粒性基因显性功能标记SH1，所述的SH1包括3条引物，所述的引物方向为5’-3’，引物序列如下：

SH1-F1：GTATTGATGTATACTGGACGTTT；

SH1-F2：GATGTATACTGGCCATTG；

SH1-R：TTTGAAGTATCCACGGTC。

实例1利用功能标记SH1检测4个水稻品种

(1)提取4个水稻品种(不易落粒品种日本晴，易落粒品种东乡野生稻、增城野生稻和高州野生稻)的基因组DNA：分别取水稻叶片，通过TPS简易法获得水稻基因组DNA。

(2)PCR扩增

PCR反应体系为20μl反应体系：2.0μl的10×PCR buffer；0.5μl的10mM dNTPs；10μM的三种引物(SH1-F1、SH1-F2和SH1-R)各0.5μl；0.2μl的Taq DNA聚合酶，2.0μl的模板DNA；13.8μl的ddH2O。

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，48℃退火30sec，72℃延伸1min，34个循环；最后72℃延伸5min后得到扩增产物。

(3)扩增产物的检测

将扩增产物在6％(w/w)聚丙烯酰胺变性凝胶中进行电泳，1％(w/w)硝酸银染色得到电泳图。

(4)结果与分析

电泳结果如图2所示，经SH1功能标记检测，扩增片段大小与图1(落粒性功能标记的位置示意图)中设计目标一致：不易落粒品种日本晴，显示134bp的片段；易落粒品种东乡野生稻、增城野生稻和高州野生稻，显示为129bp的片段。

结果表明SH1功能标记能很好地区分易落粒与不易落粒品种，可用于水稻落粒性基因qSH1的分子标记辅助选择。

实例2利用功能标记SH1检测“三系”水稻育种亲本

(1)分别提取332份恢复系，84份不育系和81份保持系的基因组DNA：分别取水稻叶片，通过TPS简易法获得水稻基因组DNA。

(2)PCR扩增

PCR反应体系为20μl反应体系：2.0μl的10×PCR buffer；0.5μl的10mM dNTPs；10μM的三种引物(SH1-F1、SH1-F2和SH1-R)各0.5μl；0.2μl的Taq DNA聚合酶，2.0μl的模板DNA；13.8μl的ddH₂O。

(3)扩增产物的检测

(4)落粒性检测

水稻植株成熟时，每个株系取三穗进行测定。测定时用手握住成熟的稻穗，以手指与掌心搓揉，连续二次测定，将水稻的落粒性分为2个等级：难(搓揉稻穗不落粒或少落粒，落粒率<5.5％)、易(落粒率≥25.5％)。

(5)结果与分析

部分检测结果如图3所示，经SH1功能标记检测，恢复系株系D50、恢复系株系D51、恢复系株系D52、恢复系株系K50、恢复系株系K51、恢复系株系K52、保持系株系B50、保持系株系B51、保持系株系B52均显示129bp的片段；而恢复系株系D59则显示134bp的片段。而落粒性检测表明，显示129bp片段的水稻株系表型均为易落粒；显示134bp片段的恢复系株系D59表型为难落粒。

结果表明，SH1功能标记能达到筛选育种亲本落粒性的实用要求。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 水稻落粒性基因qSH1的功能标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtattgatgt atactggacg ttt 23

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gatgtatact ggccattg 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttgaagtat ccacggtc 18

Claims

1.水稻落粒性基因qSH1的功能标记，其特征在于，所述的水稻落粒性基因qSH1的落粒性基因的显性分子标记SH1通过如下三条引物获得功能标记：

SH1-F1引物：GTATTGATGTATACTGGACGTTT；

SH1-F2引物：GATGTATACTGGCCATTG；

SH1-R引物：TTTGAAGTATCCACGGTC。

2.根据权利要求1所述的水稻落粒性基因qSH1的功能标记，其特征在于：所述的引物用于扩增水稻基因组DNA时，在易落粒水稻中显示为129bp的片段，而在不易落粒水稻中显示为134bp的片段。

3.根据权利要求1所述的水稻落粒性基因qSH1的功能标记，其特征在于，采用以下步骤进行分子标记：

(1)提取水稻基因组DNA；

(2)PCR扩增：将权利要求1所述的SH1-F1、SH1-F2和SH1-R引物加入到PCR反应体系中，对步骤(1)中提取得到的水稻基因组DNA进行扩增，得到扩增产物；

4.根据权利要求3所述的水稻落粒性基因qSH1的功能标记，其特征在于：

步骤(2)中所述的PCR的反应体系为20μl反应体系：2.0μl的10×PCR buffer，0.5μl的10mM dNTPs，10μM的SH1-F1、10μM的SH1-F2和10μM的SH1-R各0.5μl，0.2μl的Taq DNA聚合酶，2.0μl的模板DNA，13.8μl的ddH2O。

5.根据权利要求3所述的水稻落粒性基因qSH1的功能标记，其特征在于：

6.根据权利要求3所述的水稻落粒性基因qSH1的功能标记，其特征在于：

7.根据权利要求3所述的水稻落粒性基因qSH1的功能标记，其特征在于：

步骤(3)中所述的染色为用1％(w/w)硝酸银进行染色。

8.权利要求1～7任一项所述的水稻落粒性基因qSH1的功能标记在水稻育种中的应用。