CN105483217B - 一种鉴定水稻东野型细胞质雄性不育源的分子标记方法 - Google Patents

一种鉴定水稻东野型细胞质雄性不育源的分子标记方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105483217B
CN105483217B CN201510896879.7A CN201510896879A CN105483217B CN 105483217 B CN105483217 B CN 105483217B CN 201510896879 A CN201510896879 A CN 201510896879A CN 105483217 B CN105483217 B CN 105483217B
Authority
CN
China
Prior art keywords
wild type
cytoplasmic male
male sterility
rice
type cytoplasmic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201510896879.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105483217A (zh
Inventor
严松
黄仁良
沈显华
朱珊
熊宏亮
沈林军
魏永清
陈莉妹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
RICE RESEARCH INSTITUTE OF JIANGXI ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Original Assignee
RICE RESEARCH INSTITUTE OF JIANGXI ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by RICE RESEARCH INSTITUTE OF JIANGXI ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES filed Critical RICE RESEARCH INSTITUTE OF JIANGXI ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority to CN201510896879.7A priority Critical patent/CN105483217B/zh
Publication of CN105483217A publication Critical patent/CN105483217A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105483217B publication Critical patent/CN105483217B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13Plant traits
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种鉴定水稻东野型细胞质雄性不育源的分子标记方法,所述的分子标记引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2,所说的方法为:提取水稻材料的总DNA;以提取的总DNA为模板,用上述述引物进行PCR扩增;电泳检测扩增产物,如果出现92bp的条带,表示该水稻材料含东野型细胞质雄性不育源;如果出现102bp的条带或除92bp以外的其它条带,则表示该水稻材料不含东野型细胞质雄性不育源。本发明引物可简便、快速、准确地鉴别东野型细胞质雄性不育源,实验重复性好,结果可靠。

Description

一种鉴定水稻东野型细胞质雄性不育源的分子标记方法
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种鉴定水稻东野型细胞质雄性不育源的分子标记方法,具体为鉴别水稻东野型细胞质雄性不育系、东野型杂交组合以及后代材料的细胞质来源。
背景技术
水稻是最重要的粮食作物之一,世界上有一半以上人口以稻米为主食。随着世界人口的不断增加和耕地面积的不断减小,如何进一步提高水稻产量,始终是育种家们关注的首要问题。我国杂交水稻四十余年的实践表明,杂交水稻技术是提高水稻产量的有效途径。目前,我国杂交水稻的年种植面积约1533.3万hm2,占水稻种植总面积的50%,产量占稻谷总产的57%。杂交稻的推广与应用为我国创造了巨大的经济和社会效益。
在杂交种制种过程中往往出现机械混杂、生物学混杂,及不法经营者的人为掺杂或“套牌”,导致杂交种的纯度和真实性受到严重影响,因此为了规范种子市场和保障农业生产,对种子的纯度和真伪进行鉴定显得十分重要。自1973年,我国杂交水稻三系成功配套以来,水稻的质核互作型雄性不育在三系(不育系、保持系、恢复系)杂种水稻育种中得到了广泛应用。迄今,不同的细胞质来源已有六十多种。现今我国杂交稻生产中应用的细胞质雄性不育类型包括野败型、冈型、D型、印尼水田谷型、矮败型、红莲型、K型、包台型、滇型和马协型。依据不育系恢保关系的差异,以上细胞质雄性不育系类型主要分为三大类:一、野败型,与此类不育系恢保关系基本相同的有冈型、D型、印尼水田谷型、矮败型、K型、马协型等;二、红莲型(HL);三、包台型(BT),与该类型不育系恢保关系相同的有滇一型、滇三型、里德型不育系以及由BT型转育成的黎明、农圭六、秋光等粳稻不育系。
由此可见,水稻三系杂交稻的不育细胞质来源以及品种繁多,其真实性和纯度鉴定具有一定复杂性。目前种子真实性和纯度鉴定多采用田间种植鉴定,该方法周期长,费工费时,不能满足种子市场销售和品种及时授权的需要,因此需要操作简单、高效方便的鉴定方法。其中,DNA分子标记鉴定技术是最佳手段之一,DNA分子标记是一种遗传标记,它能从DNA水平上反映基因型差异,可以在水稻生长发育的任何阶段进行鉴定,而且能够鉴定表型难于区别的品种,具有简单快速、准确可靠、对样品要求低及成本低等特点。
江西省农业科学院水稻研究所利用东乡野生稻作为细胞质源培育出东野型雄性不育系,并发现该类型不育系具有与传统“野败”、“红莲”及“包台”不育系完全不同的恢保遗传关系。为有效区分同核异质体的水稻东野型细胞质雄性不育系和保持系、以及鉴别东野型杂交种,我们开发了东野型细胞质雄性不育源的线粒体特异DNA分子标记,并提出鉴定方法。
发明内容
本发明的目的是提供水稻东野型细胞质雄性不育源的特异分子标记以及鉴定方法,可以准确鉴别东野型细胞质雄性不育源。
本发明具体通过以下技术方案实现:
水稻东野型细胞质雄性不育源的线粒体序列,跟非东野型细胞质材料的线粒体序列相比存在多处差异,其中东野型细胞质雄性不育源存在一处特异的多态性位点,相比其它材料的序列缺失了10bp,缺失的序列为ACCCGGTGGT,其5′和3′侧翼序列分别是ATAGTAAGGGATTTCTTTCA和ACCCGGAGAAAACGTTGCCC,根据此处序列差异设计了鉴定水稻东野型细胞质雄性不育源的引物。
所述的引物序列如下:
正向引物:AGTCGTACCGAACACTATG;
反向引物:TGAACAGATGGGTTTAGTC。
本发明另一目的在于提供一种鉴定水稻东野型细胞质雄性不育源的方法,包括以下步骤:提取水稻材料的总DNA;以提取的总DNA为模板,用上述引物进行PCR扩增;电泳检测扩增产物,如果出现92bp的条带,表示该水稻材料含东野型细胞质雄性不育源;如果出现102bp的条带或除92bp以外的其它条带,则表示该水稻材料不含东野型细胞质雄性不育源。
所述的PCR反应体系为:模板DNA 1.0μL,10×PCR Buffer 1.0μL,25mM的MgCl21.0μL,2mM的dNTP 1.0μL,0.3μM的引物1.0μL,Taq酶0.2U,加ddH2O补至10μL。
所述的PCR扩增程序为:1)94℃预变性5min;2)94℃变性20s,55℃退火20s,72℃延伸20s,扩增32个循环;3)72℃延伸5min,16℃保温。
上述引物或方法对水稻东野型细胞质雄性不育系、东野型杂交组合以及后代材料的细胞质来源进行DNA分子标记鉴定识别中的应用。
本发明的有益效果为:
1)本发明所获得的分子标记是根据水稻东野型细胞质雄性不育源的线粒体序列跟其它材料线粒体序列的多态性位点设计的,是水稻线粒体基因组特异分子标记,故不需要作表型鉴定,即可简便、快速、准确地鉴别东野型细胞质雄性不育源,实验重复性好,结果可靠。
2)利用本发明的分子标记对水稻东野型细胞质雄性不育源进行检测,可以鉴定东野型不育系种子纯度和东野型杂交种真伪。
附图说明
图1是本发明实施例八分水稻材料总DNA扩增产物的电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明,以下所述,仅是对本发明的较佳实施例而已,并非对本发明做其他形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容,依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化,均落在本发明的保护范围内。
实施例1 检测水稻细胞质雄性不育系和杂交组合细胞质
1)供试材料
表1 八份水稻材料
2)水稻总DNA提取
在苗期取水稻叶片,基因组总DNA的提取参照Scott等(1988)的CTAB法,改进如下:
①取约0.1g叶片,置于2.0mL离心管中,加入1粒钢珠及500μL 2×CTAB DNA提取液(20g CTAB,12.1g Tris-Base,7.44g EDTA-Na,81.9gNaCl,溶解于1L蒸馏水中),使用组织研磨仪打碎叶片,65℃水浴30min,期间振动混匀数次;
②从水浴中取出离心管,加入约500μL氯仿(CHCl3),充分震荡混匀,在10000rpm下离心5min;
③转移上清液至一新的1.5mL的离心管中,加入上清体积0.7~1倍的异丙醇,将离心管轻微混匀后于-20℃冰箱中放置半小时后,10000rpm离心5min;
④弃上清液,管底的乳白色沉淀用70%的酒精洗涤两次。将离心管中的酒精倒出后,倒置于干净的吸水纸上自然晾干;
⑤晾干后的DNA加双蒸水溶解,调节最终浓度为100~1000ng/μL,置于-20℃冰箱内保存备用。
3)水稻东野型细胞质雄性不育源特异DNA分子标记的设计
水稻东野型细胞质雄性不育源的线粒体序列,跟非东野型细胞质材料的线粒体序列相比存在多处差异。其中东野型细胞质雄性不育源有一处特异的多态性位点,跟其它材料序列相比,东野型细胞质雄性不育源的线粒体序列发生了10bp的缺失。
相比其它材料序列,东野型细胞质雄性不育源线粒体基因组缺失的10bp序列为ACCCGGTGGT(5′-3′),其5′和3′侧翼序列分别是ATAGTAAGGGATTTCTTTCA和ACCCGGAGAAAACGTTGCCC(5′-3′),根据此处序列差异采用在线软件Primer3(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)设计了DNA分子标记DW-MT1。
DW-MT1正反引物序列如下:
正向引物(5′-3′)AGTCGTACCGAACACTATG;
反向引物(5′-3′)TGAACAGATGGGTTTAGTC。
4)基因型分析
利用标记DW-MT1对表1中的八份水稻材料进行基因型检测,PCR采用10μL反应体系:模板DNA 1.0μL,10×PCR Buffer 1.0μL,25mM的MgCl21.0μL,2mM的dNTP 1.0μL,0.3μM的引物1.0μL,Taq酶0.2U,加ddH2O补至10μL。
PCR扩增条件为:1)94℃预变性5min;2)94℃变性20s,55℃退火20s,72℃延伸20s,扩增32个循环;3)72℃延伸5min,16℃保温。
PCR反应产物在4%琼脂糖凝胶中电泳,经溴化乙锭染色后在凝胶成像仪上拍照。在检测的八份材料中,东野型不育系DY1A和东野型杂种F1这两份材料扩增出92bp的条带,其余六份材料扩增出102bp的条带(图1),电泳谱带清晰、特异,表明使用标记DW-MT1进行PCR电泳可以准确鉴定出东野型细胞质雄性不育源。

Claims (4)

1.一种鉴定水稻东野型细胞质雄性不育源的分子标记方法,其特征在于:提取水稻材料的总DNA;以提取的总DNA为模板,用SEQ IDNO.1和SEQIDNO.2所示引物进行PCR扩增;电泳检测扩增产物,如果出现92bp的条带,表示该水稻材料含东野型细胞质雄性不育源;如果出现102bp的条带或除92bp以外的其它条带,则表示该水稻材料不含东野型细胞质雄性不育源。
2.根据权利要求1所述的一种鉴定水稻东野型细胞质雄性不育源的分子标记方法,其特征在于:所述的PCR反应体系为:模板DNA 1.0μL,10×PCRBuffer1.0μL,25mM的MgCl21.0μL,2mM的dNTP 1.0μL,0.3μM的引物1.0μL,Taq酶0.2U,加ddH2O补至10μL。
3.根据权利要求1所述的一种鉴定水稻东野型细胞质雄性不育源的分子标记方法,其特征在于:所述的PCR扩增程序为:1)94℃预变性5min;2)94℃变性20s,55℃退火20s,72℃延伸20s,扩增32个循环;3)72℃延伸5min,16℃保温。
4.权利要求1所述的方法在水稻东野型细胞质雄性不育系细胞质来源鉴定识别中的应用。
CN201510896879.7A 2015-12-08 2015-12-08 一种鉴定水稻东野型细胞质雄性不育源的分子标记方法 Expired - Fee Related CN105483217B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510896879.7A CN105483217B (zh) 2015-12-08 2015-12-08 一种鉴定水稻东野型细胞质雄性不育源的分子标记方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510896879.7A CN105483217B (zh) 2015-12-08 2015-12-08 一种鉴定水稻东野型细胞质雄性不育源的分子标记方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105483217A CN105483217A (zh) 2016-04-13
CN105483217B true CN105483217B (zh) 2018-07-06

Family

ID=55670488

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510896879.7A Expired - Fee Related CN105483217B (zh) 2015-12-08 2015-12-08 一种鉴定水稻东野型细胞质雄性不育源的分子标记方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105483217B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108950050B (zh) * 2018-08-15 2021-07-20 江西省农业科学院水稻研究所 东野型水稻胞质雄性不育恢复基因Rf(DW)10的检测引物、试剂盒及应用与检测方法
CN108866231B (zh) * 2018-08-15 2021-06-25 江西省农业科学院水稻研究所 东野型水稻胞质雄性不育恢复基因Rf(DW)8的检测引物、试剂盒及应用与检测方法
CN108866232B (zh) * 2018-08-15 2021-07-20 江西省农业科学院水稻研究所 东野型水稻胞质雄性不育恢复基因Rf(DW)11的检测引物、试剂盒及应用与检测方法
CN110982918A (zh) * 2019-10-14 2020-04-10 常德市农林科学研究院 一种苗期快速鉴别水稻野败型雄性不育系和保持系的方法
CN111304353B (zh) * 2020-03-26 2023-05-16 江西省农业科学院水稻研究所 利用异交亲和基因连锁标记选育水稻东野型三系保持系的方法
CN114672581B (zh) * 2022-03-07 2023-11-17 江西省农业科学院水稻研究所 一种水稻异源胞质育性恢复QTL qRf5.1的分子标记及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cytoplasmic Male Sterility of Rice with Boro II Cytoplasm Is Caused by a Cytotoxic Peptide and Is Restored by Two Related PPR Motif Genes via Distinct Modes of mRNA Silencing;Zhonghua Wang等;《The Plant Cell》;20060331;第18卷;676–687 *
Oryza sativa Indica Group strain WA-CMS mitochondrion, complete genome,GenBank: JF281154.1,401567 bp DNA circular;Bentolila,S.等;《NCBI genbank》;20120210;1-88 *
Oryza sativa Japonica Group genomic DNA, chromosome 9, BAC lone:OSJNBa0018I03,GenBank: AP005746.3,145818 bp DNA linear;Sasaki,T.等;《NCBI genbank》;20080216;1-33 *
Workable male sterility systems for hybrid rice: Genetics, biochemistry, molecular biology, and utilization;Jian-Zhong Huang等;《Rice》;20141231;第7卷;第13篇,1-14 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105483217A (zh) 2016-04-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105483217B (zh) 一种鉴定水稻东野型细胞质雄性不育源的分子标记方法
Singh et al. Evaluation of microsatellite markers for genetic diversity analysis among sugarcane species and commercial hybrids
CN105755140B (zh) 棉花细胞质雄性不育恢复系InDel标记及其进行鉴定的方法
WO2019128461A1 (zh) 与南瓜光周期不敏感性状紧密连锁的Indel分子标记及其应用
CN108165656B (zh) 小麦分子标记及其在鉴定小麦白粉病抗性中的应用
CN104342434B (zh) 棉花细胞质雄性不育恢复系的分子鉴定方法
CN108728571B (zh) 与哈克尼西棉雄性不育恢复基因连锁的InDel分子标记及应用
CN104131012A (zh) 一种鉴定大豆细胞核雄性不育系的分子标记及其鉴定方法
CN101492738A (zh) 一种洋葱细胞质雄性不育scar标记及其应用
CN106967797B (zh) 甜瓜种子纯度检测的特异性序列及检测方法和应用
CN112159858A (zh) 与花椰菜紫色基因紧密连锁的分子标记及应用
Chen et al. The first intraspecific genetic linkage maps of wintersweet [Chimonanthus praecox (L.) Link] based on AFLP and ISSR markers
CN104789562A (zh) 一个与黄瓜单性结实主效QTL紧密连锁的分子标记Indel-T-47
CN104328119A (zh) 团头鲂生长性状相关的微卫星分子标记及应用
CN106591489A (zh) 水稻粒长基因gw7的分子标记及其专用引物序列
CN110184378B (zh) 三裂棉细胞质雄性不育恢复基因的分子鉴定方法
CN103981177A (zh) 大白菜细胞质雄性不育育性恢复基因的分子标记及应用
CN108690883B (zh) 一种辅助鉴定待测大豆的大豆白粉病抗性的分子标记rmd7
CN106755465A (zh) 与小麦旗叶长QTL QFll.sicau‑2D紧密连锁的分子标记及应用
Chen et al. Induction of apomixis by dimethyl sulfoxide (DMSO) and genetic identification of apomictic plants in cassava
CN109517919A (zh) 小麦-中间偃麦草广谱抗条锈T4DL.4DS-3Ai易位系及SCAR标记的开发
CN108588261A (zh) 一种鉴定位于萝卜R02染色体上的晚抽薹QTL的InDel引物及其应用
CN105671039B (zh) 大豆始花期主效QTL的分子标记indel15-1及其应用
CN108165652A (zh) 用于香榧苗期性别鉴定的特异性分子标记tgmi001
CN104762299B (zh) 一种水稻苗期耐盐基因qST2及其分子标记方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20180706

Termination date: 20181208