CN104342434B

CN104342434B - 棉花细胞质雄性不育恢复系的分子鉴定方法

Info

Publication number: CN104342434B
Application number: CN201310322542.6A
Authority: CN
Inventors: 吴建勇; 邢朝柱; 郭立平; 戚廷香
Original assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-07-29
Filing date: 2013-07-29
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2033-07-29
Also published as: CN104342434A

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种棉花细胞质雄性不育恢复系的分子鉴定方法，具体提供了用于鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系的CAPS标记的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2和3所示。本发明采用CAPS标记对棉花细胞质雄性不育恢复系材料进行了分子水平的多态性检测，该方法鉴定速度快、准确率高、操作简单，非常适用于棉花细胞质雄性不育恢复系材料纯度的室内鉴定和新恢复系材料的分子标记辅助选育。

Description

棉花细胞质雄性不育恢复系的分子鉴定方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系的分子标记，扩增其的引物以及分子鉴定方法。

背景技术

杂种优势的研究和利用在提高棉花产量、改进品质、提高抗性等方面已经发挥了显著效果。目前，杂交棉已经在我国长江流域等育苗移栽地区广泛栽种；在黄河流域棉区，甚至新疆等直播棉区也正在大力发展杂交棉。然而，人工去雄辅助授粉杂交制种法是杂交棉种子的主要生产方式（占90%以上）。随着国家城镇化发展的需求，棉花主产区及其周边地区的劳动力成本逐年提高，从而导致种子生产成本越来越高，许多从事杂交棉制种的相关种子企业难以为继，最终大大限制了杂交棉的进一步大规模推广利用。利用“三系法”制种已经在多种作物中得到成功应用和推广，与人工去雄辅助授粉方式相比，该方法具有程序简便，成本仅为人工去雄杂交的30-40%，适合大面积制种等独特优势。因而，三系杂交棉花的大面积推广，对于提高植棉效益，增加棉农收益，稳定杂交棉种植面积等都具有重要意义。虽然，三系杂交种（以哈克尼西棉细胞质雄性不育三系材料为主）的审定已经取得了一定进展，但是受制于具有强恢复力的优良恢复系亲本资源匮乏的限制，目前，仍然没有实现三系杂交棉的大面积推广。因此，在三系杂交棉选育过程中，具有强恢复力的优良恢复系选育和改良是育种工作者长期研究的重点和难点。

采用常规育种技术可以实现恢复系改良的目的，但是利用该方法需要年限长，而且转育后每年都需要进行大量的田间测交和鉴定来确保恢复基因的存在，从而需要耗费大量的棉田、人力和财力。另一方面，三系杂交种制种过程中，恢复系的纯度至关重要，一旦混杂，将直接导致杂交种后代出现不育株的情况，严重影响棉花产量。常规育种过程中棉花细胞质雄性不育恢复系选育田间鉴定检测方法所需时间长、消耗大、准确性差，因此，迫切需要一种稳定可靠又快速的鉴定恢复系纯度和选育改良的方法。

分子标记直接从DNA水平反映出核苷酸序列的差异，不受发育阶段、环境因素以及基因是否表达的影响，具有遗传稳定等特点。目前，随着分子生物学的飞速发展，分子标记检测技术已经发展出几十种技术可用于分子标记的筛选，比较常用的有RFLP、RAPD、ISSR、SSR、SCAR、CAPS、STS、AFLP和SNP等。酶切扩增多态性序列（CAPS,cleaved amplifiedpolymorphic sequence）标记技术是一种具有共显性、位点特异性、操作简单、成本低的简单、经济、可靠的技术。与SSR等需要通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和银染的分子标记技术相比，该技术仅需通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，因此已经在种质鉴定、辅助育种、基因鉴定和图谱构建等领域得到相当广泛的应用。

发明内容

本发明的目的是解决常规育种过程中棉花细胞质雄性不育恢复系选育田间鉴定检测方法所需时间长、消耗大、准确性差等的问题，提供一种棉花细胞质雄性不育恢复系的快速分子鉴定方法，从而可以加快棉花恢复系选育和改良进程，同时保证恢复系种子纯度。

为了实现上述的目的，本发明利用前期筛选到的与恢复基因紧密连锁的SSR标记【曹秀霞，哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复基因SSR标记定位及利用，中国农业科学院，作物遗传育种，2012，硕士论文】，结合雷蒙德氏棉（D基因组）测序的结果【Wang K,Wang Z,Li F,et al(2012)The draft genome of a diploid cotton Gossypium raimondii.NatureGenetics44(10):1098】，得到9个可能与恢复基因相关的PPR（pentatricopeptiderepeats）基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4-12所示。进一步对这9个PPR基因在陆地棉恢复系、保持系和不育系中的测序发现，恢复系中存在一段特异的“TtAATTTCAcattaatta”片段（SEQ ID No.1，其中小写字母为恢复系特有插入碱基，斜体为恢复系中存在的SNP位点），这段序列的存在导致恢复系中缺失了限制性内切酶Dra I的酶切位点。本发明提供了含有上述特异片段的分子标记。以此为基础，本发明设计了涵盖这一特异片段的一对CAPS标记引物对：

正向引物5'-AAACAGCTATACCTCAAAGGCAA-3'（SEQ ID No.2）

反向引物5'-TTTAGTTAAATTATCATTTTCGCCTA-3'（SEQ ID No.3）

本发明提供了上述分子标记在鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系中的应用。

本发明提供的用于鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系的CAPS标记引物，其为核苷酸序列如SEQ ID NO.2和3所示的引物。

该引物在鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系中的应用以及在鉴定棉花恢复系种子纯度中的应用均属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种棉花细胞质雄性不育恢复系的分子鉴定方法，包括以下步骤：

（1）用SEQ ID NO.2和3所示的引物扩增待测棉花样品的基因组DNA，回收扩增产物；

（2）扩增产物经限制性内切酶酶切后，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若电泳条带出现184bp和124bp两个特异性条带，而没有出现317bp的扩增片段的待测样品为不含恢复基因位点的棉花材料；若电泳条带出现317bp的同时，还出现184bp和124bp两个特异性条带，则待测样品为恢复基因位点杂合的棉花材料；若电泳条带仅有317bp条带，没有出现184bp和124bp这两个特异性条带，则待测样品为恢复基因位点纯合的棉花材料。

其中步骤（2）的内切酶为Dra I。

其中，酶切时间为30min。

步骤（1）中，DNA样品1μl与19μl PCR反应液（10×PCR Buffer（含MgCL₂）2.0μl，5mMdNTPs0.2μl，10mM CAPS引物对各1μl，5U/μl TaqDNA聚合酶0.2μl，ddH₂O14.6μl）混合，进行PCR反应：94℃预变性3min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；4℃保存。

步骤（2）中，吸取15μl扩增产物与5μl酶切反应液（10×Buffer2μl，15U/μl Dra I1μl，ddH₂O2μl）混合，37℃酶切30min。酶切产物10μl加样于2～3%的琼脂糖凝胶中，在1×TAE的电泳缓冲液中电泳检测。

本发明的另一个目的在于提供用所述的标记或引物在鉴定棉花恢复系纯度和新恢复系选育中的应用。

在本发明一个优选的实施方案中，用所述的CAPS标记引物扩增待测棉花样本的基因组DNA，经限制性内切酶Dra I酶切后筛选出与恢复系具有相同带型的棉花样本。

本发明采用CAPS标记对棉花细胞质雄性不育恢复系材料进行了分子水平的多态性检测，从本研究的结果中可以看出，该标记鉴定的结果条带清晰、稳定、可靠，因此该方法非常适用于棉花细胞质雄性不育恢复系材料纯度的室内鉴定和新恢复系材料的分子标记辅助选育。

本发明与现有技术相比，有益效果为：

1）速度快：CAPS标记对棉花细胞质雄性不育恢复系材料选育和保证恢复系种子纯度具有重要作用。棉花三系杂交种制种过程中，如果发生恢复系混杂将在杂交后代中产生不育棉株，从而对棉花产量造成重大影响，并严重影响棉农受益。此外，常规育种程序恢复系的选育过程涉及大量的测交等试验，并且需要调查大量的外部性状，需要投入大量的时间、人力和物力，且易受环境因素影响，因此，常规手段并不能完全准确、真实地反映恢复系的遗传情况。该发明只需提供棉花材料的种子或叶片，提取DNA后，用CAPS标记引物扩增后酶切后只需通过简单的琼脂糖凝胶分析即可进行分子标记鉴定，整个标记检测的过程仅需要2.5-3小时。利用相应分子鉴定体系可以很快地鉴定出恢复系种子的真实性，同时利用该发明可以在恢复系分子标记辅助选择过程中有效跟踪恢复基因的存在与否并通过共显性带型能很快鉴定恢复基因位点是否纯合，从而极大加快恢复系选育和改良过程。

2）准确率高：CAPS标记具有简单、稳定可靠、重复性好等优点，很容易通过PCR快速扩增、酶切和琼脂糖凝胶电泳检测。而且分子鉴定不受环境因素的影响，本发明利用一对CAPS引物对恢复系进行鉴定，真正从DNA水平上鉴定恢复系的遗传情况，提高了准确性。

3）简单实用：本发明鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系真实性和分子标记辅助选择育种的整个程序只是几次机械式的加样过程，易于操作，具有很好的商业化应用前景。

附图说明

图1棉花细胞质雄性不育恢复系和其它材料CAPS标记分析。其中，M：marker（TIANGEN公司，MarkerⅢ），1-5分别为恢复系中恢46（CGMCC5166），恢复系中恢80（CGMCC5167），三系杂交棉品种中棉所83、常规棉品种中棉所45和中棉所69。其中两个恢复系材料在以marker为标准的317bp处能检测到CAPS引物对的扩增产物，但在184bp和124bp位置处不能检测到特异性条带；恢复基因位点杂合的三系杂交种中棉所83在以marker为标准的317bp、184bp和124bp位置处均能检测到相关条带；不含恢复基因的两个常规棉品种在以marker为标准的184bp和124bp位置处能检测到特异性条带，而不能在317bp位置处检测到CAPS引物对的扩增条带。

图2为CAPS引物对对48份恢复系种子DNA进行扩增和酶切的结果。其中M：marker（TIANGEN公司，MarkerⅢ），1-48为恢复系中恢46，在以marker为标准的317bp处能检测到CAPS引物对的扩增产物，但在184bp和124bp位置处不能检测到特异性条带。

图3 CAPS引物对对含恢复基因自交群体48粒种子的分析结果。其中M：marker（TIANGEN公司，MarkerⅢ）；泳道A：恢复基因位点纯合单株（在以marker为标准的317bp处能检测到CAPS引物对的扩增产物，但在184bp和124bp位置处不能检测到特异性条带）；泳道B：恢复基因位点杂合单株（在以marker为标准的317bp、184bp和124bp位置处均能检测到相关条带）；泳道C：不含恢复基因单株（在以marker为标准的184bp和124bp位置处能检测到特异性条带，不能在317bp位置处检测到CAPS引物对的扩增条带）。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1棉花细胞质雄性不育恢复系的分子鉴定方法的建立

1、棉花种子DNA提取

恢复系中恢46和中恢80、三系杂交种中棉所83和常规棉品种中棉所45和中棉所69共5个材料的去壳，每粒种子单独粉碎后转入2ml的离心管中；加入1000μlDNA提取液（0.05MTris-Cl，0.01MEDTA，2%SDS，1%PVP，0.5%山梨醇，0.705M NaCl，调整pH值为8.0，高压灭菌；使用前加入1%β-巯基乙醇），漩涡混匀后，65℃水浴30min，间隔10min左右轻摇下；水浴结束后，加入800μl苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），上下颠倒混匀至不分层（动作轻缓时间充分），12000rpm离心10min；吸取上清液（约800μl）转移到另一2ml离心管中，加入2μl RNase酶（10mg/ml），混匀后37℃水浴30min；取出后加入1000μl的苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），上下颠倒混匀至不分层（动作轻缓时间充分），12000rpm离心10min；用剪口枪头吸取上清液转移（约700μl）到另一2ml离心管中，加入0.7倍体积（500L）异丙醇缓慢摇动几次，静置30min，絮状DNA成团析出；用剪口枪头吸取DNA转移至盛有70%乙醇的2ml硅化离心管中，浸泡两次，每次十分钟，无水乙醇浸泡过夜；倒掉乙醇，倒置管壁晾干后（约30min），加入200μl ddH₂O，室温溶解2h，测定浓度后稀释到25ng/μl，-20℃保存备用。

2、CAPS分子标记的确定

利用申请人前期筛选到的与恢复基因紧密连锁的13个SSR标记【曹秀霞，哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复基因SSR标记定位及利用，中国农业科学院，作物遗传育种，2012，硕士论文】对应的EST序列，在雷蒙德氏棉（D基因组）测序结果【Wang K,Wang Z,Li F,et al(2012)The draft genome of a diploid cotton Gossypium raimondii.NatureGenetics44(10):1098】中通过Blast分析，发现这13个标记中有12个标记分布于9个scaffold，进一步利用TPRpred软件【Karpenahalli M,Lupas A,Soding J(2007)TPRpred:atool for prediction of TPR-,PPR-and SEL1-like repeats from proteinsequences.BMC Bioinformatics8(1):2】对这9个scaffold中可能与恢复基因相关的PPR基因进行分析，结果发现在scaffold333上有9个PPR（pentatricopeptide repeats）基因成簇存在于160kb范围内，随后对这9个PPR基因在陆地棉恢复系、保持系和不育系中的测序发现，恢复系中存在一段特异的“TtAATTTCAcattaatta”片段（SEQ ID No.1，其中小写字母为恢复系特有插入碱基，斜体为恢复系中存在的SNP位点），这段序列的存在导致恢复系中缺失了限制性内切酶Dra I的酶切位点。因此本发明确定含有上述特异片段的序列可以作为分子标记用于鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系。

3、CAPS特异引物的设计

以上述分子标记为基础，设计了涵盖上述特异片段（SEQ ID NO.1）的一对CAPS标记引物对：

正向引物5'-AAACAGCTATACCTCAAAGGCAA-3'（SEQ ID No.2）

反向引物5'-TTTAGTTAAATTATCATTTTCGCCTA-3'（SEQ ID No.3）4、棉花细胞质雄性不育恢复系的分子鉴定方法

将上述棉花DNA样品1μl与19μl PCR反应液（10×PCR Buffer（含MgCL₂）2.0μl，5mMdNTPs0.2μl，10mM CAPS引物对各1μl，5U/μl TaqDNA聚合酶0.2μl，ddH₂O14.6μl）混合，进行PCR反应：94℃预变性3min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；4℃保存。扩增结束后，吸取15μl扩增产物与5μl酶切反应液（10×Buffer2μl，15U/μl Dra I1μl，ddH₂O2μl）混合，37℃酶切30min。酶切产物10μl加样于2-3%的琼脂糖凝胶中，在1×TAE的电泳缓冲液中电泳检测。电泳结束后凝胶成像系统中观察。结果如图1所示。因此，本发明棉花细胞质雄性不育恢复系的分子鉴定方法中，判断标准为：酶切结束后，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，若电泳条带出现184bp和124bp两个特异性条带，而没有出现317bp的扩增片段的样品为不含恢复基因位点的棉花材料；若电泳条带出现317bp的同时，还出现184bp和124bp两个特异性条带，则待测样品为恢复基因位点杂合的棉花材料；若电泳条带仅有317bp条带，没有出现184bp和124bp这两个特异性条带，则待测样品为恢复基因位点纯合的棉花材料。

实施例2恢复系种子纯度鉴定

利用实施例1确定的CAPS标记对恢复系中恢46的48粒种子纯度进行鉴定。以CAPS引物对（SEQ ID No.2和3）对48份种子DNA进行扩增，扩增产物用限制性内切酶Dra I酶切半小时，琼脂糖检测发现所有恢复系的种子在以marker为标准的317bp处能检测到CAPS引物对的扩增产物，但在184bp和124bp位置都不能检测到相应特征带（图2），说明待测恢复系中恢46的纯度为100%。

实施例3恢复系分子标记辅助选育

为了达到改良恢复系的目的，以恢复系中恢46为父本与具有优异性状的亲本材料P5（中棉所52母本）杂交，然后以P5作为回交亲本进行目标性状的改良（P5×中恢46）×P5），并最终通过自交获得恢复基因位点纯合的改良恢复系。在这一过程中，为确保恢复基因不会丢失，从回交世代开始都需要与不育系进行测交，从而需要耗费大量的人力和物力。

而在恢复系分子标记辅助选育改良过程中，利用筛选出的CAPS标记对中恢46转育群体材料（（P5×中恢46）×P5）进行分子鉴定。从回交群体中选择经CAPS标记检测存在恢复基因的单株（即在以marker为标准的317bp、184bp和124bp位置处均能检测到相关条带），淘汰CAPS标记检测不存在恢复基因的单株（即在以marker为标准的184bp和124bp位置处能检测到特异性条带，不能在317bp位置处检测到CAPS引物对的扩增条带）。回交4代以上，每一代都参照上述标准进行检测和筛选，然后选择目标单株进行自交，利用CAPS引物对结合限制性内切酶Dra I酶切对自交群体48粒种子进行分析，共得到3种不同带型的单株（见图3）。其中恢复基因位点纯合单株在以marker为标准的317bp处能检测到CAPS引物对的扩增产物，但在184bp和124bp位置处不能检测到特异性条带；恢复基因位点杂合单株在以marker为标准的317bp、184bp和124bp位置处均能检测到相关条带；不含恢复基因的单株在以marker为标准的184bp和124bp位置处能检测到特异性条带，而不能在300bp位置检测到CAPS引物对扩增条带。

为了验证分子标记辅助选择的效果，对自交群体中分子标记检测到的3种单株类型，分别选取了10个恢复基因纯合单株、5个恢复基因杂合单株和5个不含恢复基因的单株与不育系进行了测交，其中恢复基因纯合单株共得到测交后代285株，恢复基因杂合单株共得到测交后代153株，不含恢复基因的单株共得到测交后代137株。测交后代育性调查结果表明，恢复基因纯合单株的285株测交后代中，有1株不育株（其产生的原因可能是棉花为常异花授粉植物，因此，在测交过程中可能发生不含恢复基因的花粉窜粉等现象）；在153株恢复基因杂合单株的测交后代中有81株可育株，72株不育株，符合1:1的分离比例；而不含恢复基因的单株的152株测交后代全部不育。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.用于鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系的分子标记，其特征在于，所述分子标记由核苷酸序列如SEQ ID NO.2和3所示的引物经PCR扩增棉花基因组DNA得到；且

所述分子标记含有一段特异的片段，该特异片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的分子标记在鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系中的应用。

3.权利要求1所述的分子标记在鉴定棉花恢复系种子纯度中的应用。

4.用于通过PCR扩增权利要求1所述分子标记，从而鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系的CAPS标记引物，其特征在于，其为核苷酸序列如SEQ ID NO.2和3所示的引物。

5.权利要求4所述的引物在鉴定棉花细胞质雄性不育恢复系中的应用。

6.权利要求4所述的引物在鉴定棉花恢复系种子纯度中的应用。

7.一种棉花细胞质雄性不育恢复系的分子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)用权利要求4所述的引物扩增待测棉花样品的基因组DNA，回收扩增产物；

(2)扩增产物经限制性内切酶Dra I酶切后，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测，若电泳条带出现184bp和124bp两个特异性条带，而没有出现317bp的扩增片段的待测样品为不含恢复基因位点的棉花材料；若电泳条带出现317bp的同时，还出现184bp和124bp两个特异性条带，则待测样品为恢复基因位点杂合的棉花材料；若电泳条带仅有317bp条带，没有出现184bp和124bp这两个特异性条带，则待测样品为恢复基因位点纯合的棉花材料。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，酶切时间为30min。