CN102154413A

CN102154413A - 两个与陆地棉细胞质雄性不育恢复基因连锁新标记的开发及应用

Info

Publication number: CN102154413A
Application number: CN2009101572632A
Authority: CN
Inventors: 郭三堆; 侯思宇; 张锐
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2009-07-06
Filing date: 2009-07-06
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2029-07-06
Also published as: CN102154413B

Abstract

本发明涉及一种利用SSR和STS技术筛选棉花细胞质雄性不育恢复基因连锁的分子标记的方法和应用。包括步骤：a)构建(P30A×Y18R)×P30B回交群体BC₁F₁代共369个单株。育性分离比符合1∶1，由一对显性基因控制。b)SDS-CTAB法提取(P30A×Y18R)×P30B回交群体BC₁F₁代共369个单株叶片基因组DNA。分别构建可育和不育DNA混合池，每个DNA混合池由5个单株构成。c)SSR分析或STS分析，并同收SSR或STS标记扩增的特异DNA片段测序。d)数据分析。本发明公开了两个与棉花细胞质雄性不育恢复基因连锁的新标记，所述分子标记具有SEQ ID No.5和SEQ ID No.6的核苷酸序列；所述分子标记的引物对具有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2或SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的核苷酸序列。另外，本发明也公开了所述棉花细胞质雄性不育恢复基因连锁分子标记在恢复系分子鉴定中的应用。

Description

两个与陆地棉细胞质雄性不育恢复基因连锁新标记的开发及应用

技术领域本发明属于棉花育种领域，涉及两个与陆地棉细胞质雄性不育恢复基因连锁的新标记引物序列、特异序列和制备技术及应用。利用这些引物序列和特异序列进行棉花三系恢复基因的遗传鉴定、分子遗传连锁图构建和棉花恢复基因分子标记辅助育种，本发明公开了两个标记引物序列及扩增DNA片段序列。

背景技术利用棉花细胞质雄性不育生产杂交种具有省工、省时和成本低等优点，因此“三系”配套生产棉花杂交种已成为一种必然趋势。目前国内外已经选育出了哈克尼西棉、三裂棉、异常棉、亚洲棉和陆地棉等不育系，其中哈克尼西棉、三裂棉和陆地棉的不育系实现了三系配套。已有研究表明哈克尼西棉不育胞质对杂种后代的产量有不利影响，在生产应用上没有取得实质性进展。2005年，本课题组首次研究培育出了第一个国家审定的比常规抗虫棉增产26.4％的三系杂交抗虫棉新品种，在生产上不但解决了棉铃虫的危害，而且促使棉花产量大幅度的提高。目前国内外报道了哈克尼西棉、三裂棉、104-7A和晋A不育系恢复基因的遗传连锁的分子标记。Guo等(1998年)使用RAPD-PCR技术分析(0-613-2R×Simian3)的BC₃回交群体中找到了一个与恢复基因紧密连锁的标记OPV-15300，并计算出与恢复基因的重组率为13.0±2.57％。Lan等(2001年)人同样也使用了RAPD-PCR技术，通过分析一对近等基因系HAF277(恢复系)和DELCOT277(CMS)，发现了1个与Rf连锁的RAPD标记UBC6592，其与Rf遗传距离为2.3cM；这个标记克隆测序后被定位到RFLP高密度图谱上，连锁分析表明这个标记与Rf基因的遗传距离为6.0cM。Liu等(2003年)使用BSA和GRA结合的方法，对陆地棉细胞质不育系和恢复系杂交F1代自交后的F2代群体进行RAPD和SSR筛选，结果找到3个SSR标记和2个RAPD标记与Rf₁紧密连锁，但与恢复基因Rf₁没有共分离，并使用非整倍体将Rf₁基因定位在第4条染色体的长臂上。Zhang(2001年)使用RAPD标记和BSA分析CMS-D8恢复系，找到了与Rf₂紧密连锁的标记UBC111₃₀₀₀和UBC188₅₀₀，遗传连锁分析UBC188₅₀₀与Rf₂的平均遗传距离为2.9cM；并同另外两个标记UBC169₇₀₀和UBC659₁₅₀₀共同转化为STS标记。Feng C D等(2005年)使用RAPD和BSA技术分析(B416R×Ark8518)×Ark8518群体(恢复系B416R携带有D2-2染色体组上恢复基因Rf₁)，发现3个RAPD标记UBC147₁₄₀₀，UBC607₅₀₀和UBC679₇₀₀与Rf₁紧密连锁，其中UBC169₇₀₀和UBC169₈₀₀与Rf₁的遗传距离为4.5cM，UBC659₁₅₀₀距离Rf₁为2.7cM，并将其转化为STS标记。Yin等(2006年)在三个BC₁同交群体(不育系亲本的遗传来源为104-7A)中筛选了2250对SSR引物，找到5个新的与Rf₁基因紧密连锁的SSR标记，并将前人发表的3个STS标记整合构建了包含有13个与恢复基因相关标记的高精细分辨率遗传图谱，构建了恢复系的BAC文库，使用这些标记为探针从BAC文库中筛选到50个克隆，平均每个克隆的插入片段大小为120Kb，并将遗传图谱和物理图谱紧密联系起来，最终将Rf₁基因定位在两个BAC克隆重叠区域的100Kb之间。Wang等(2007年)人使用RAPD、AFLP、STS、CAPS和SSR标记技术分析了(D8×SG747)×SG747群体，发现了三个新的RAPD标记UBC352₉₀₀、UBC683₅₀₀、UBC722₇₅₀和一个SSR标记CIR179₂₅₀，并将UBC722₇₅₀转化为CAPS标记，使用PPR基序设计的保守引物与AFLP组合测试回交群体得到一个PPR-AFLP标记与恢复基因Rf₂连锁，结合9个与Rf₂紧密连锁的分子标记构建了与Rf₂紧密连锁的遗传图谱；由于CIR179₂₅₀与Rf₂紧密连锁，同时又与Rf₁紧密连锁，并推测Rf₁和Rf₂都定位与D亚染色体组的LGD08连锁群上(现命名为D5染色体)。李朋波等(2007年)人对晋A衍生的不育系和恢复系组配的分离群体进行遗传和定位分析，表明‘晋A’恢复基因在F₂和BC₁的分离比例分别符合3∶1和1∶1，证明恢复基因由1对显性基因控制，用9个SSR标记和4个STS标记构建了长度为83.1cM的遗传图谱，将恢复基因Rf₁定位于第19染色体上(LGD08)与最近的标记CM042和CIR179分别相距5.4cM和10.3cM。而本课题组自主选育的抗虫三系杂交棉亲本P30A细胞质雄性不育系(胞质来源于104-7A)和Y18R恢复系(恢复基因来源于0-613-2R)的遗传背景均不同于前四者，申请者首次构建了其恢复基因的遗传图谱，从棉花微卫星数据库搜索单一EST序列侧翼SSR引物，对棉花(P30A×Y18R)×P30B回交群体进行育性分析，Mapmaker软件计算与恢复基因连锁的遗传距离，获得与恢复基因紧密连锁的新标记MGHES28；基于BAC克隆HZ-170-M6右末端序列设计STS引物，长度为505bp，对棉花(P30A×Y18R)×P30B回交群体进行育性分析，Mapmaker软件计算与恢复基因连锁的遗传距离，获得与恢复基因紧密连锁的新标记STSHY27；并将两个新标记应用于恢复基因的分子鉴定。

发明内容本发明的目的在于开发与抗虫三系杂交棉恢复基因紧密连锁新的分子标记，将该标记应用于构建恢复基因的遗传图谱和分子标记辅助选育优良恢复系。利用该标记有目的的发掘利用新的遗传基因资源，拓宽恢复谱，提高三系杂交棉优良基因的聚合选择效率。为实现上述目的，本发明设计以下技术措施：

构建棉花(P30A×Y18R)×P30B回交群体BC₁F₁代共369个单株。田间调查育性分离比例，其中可育株为180株，不育株为189株，卡方测验表明(X²＝0.11，P＞0.95)，本材料育性恢复基因由一对显性基因控制。在此基础上申请者通过作图开发了两个新的与恢复基因紧密连锁的分子标记MGHES28和STSHY27，可以准确的鉴定陆地棉细胞质雄性不育恢复基因Rf1。利用这两个新标记可用于分子标记辅助选育优良恢复系。

1.育性分离群体DNA混合池的构建

提取棉花(P30A×Y18R)×P30B回交群体BC₁F₁代共369个单株基因组DNA，分别构建不育DNA混合池和可育DNA混合池，每个混合池由5个单株构成。

2.恢复基因分子标记的PCR引物设计

申请人发明的陆地棉细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁分子标记MGHES28引物序列分别为SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2；STSHY27引物序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。申请人所开发的MGHES28标记扩增的特异DNA片段如序列SEQ ID NO：5所述，STSHY27标记扩增的特异DNA片段如序列SEQ ID NO：6所述。

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；菌种保存名称：HZ-170-M6；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所；菌株分类命名Escherichia coli；保藏日期：2009年07月3日；保藏编号：CGMCCNo.3160。

3.PCR反应体系的建立

EST-SSR标记分析

标准PCR反应体系为20μL，组成如下：

Template 1.0μL

10×Taq buffer 2.0μL

dNTP(2.5mM) 1.6μL

Forward Primer(10μM) 1.0μL

Reverse Primer(10μM) 1.0μL

Taq酶(2.5U/μL) 0.5μL

ddH₂O 11.9μL

Total 20μL

PCR反应热循环程序为：

1)94℃预变性2min，

2)94℃变性30s，

3)55℃退火30s，

4)72℃延伸30s，

5)Go to step2，35 cycle；

6)72℃延伸7min。

7)4℃保存

STS标记分析

标准PCR反应体系为20μL，组成如下：

Template 1.0μL

10×Taq buffer 2.0μL

dNTP(2.5mM) 1.6μL

Forward Primer(10μM) 1.0μL

Reverse Primer(10μM) 1.0μL

Taq酶(2.5U/μL) 0.5μL

ddH₂O 11.9μL

Total 20μL

PCR反应热循环程序为：

1)94℃预变性2min，

2)94℃变性30s，

3)55℃退火30s，

4)72℃延伸60s，

5)Go to step2，35 cycle

6)72℃延伸7min。

7)4℃保存

4.扩增产物DNA片段检测

1)分别以可育DNA混合池和不育DNA混合池为模板，MGHES28和STSHY27引物进行PCR扩增，产物分别在5.0％的聚丙烯胺胶和1.0％的琼脂糖胶上电泳。

2)聚丙烯胺胶电泳电压为2000V，预电泳30min，上样8μL，电泳时间1h。琼脂糖胶电泳电压为120V，时间为1h。然后在凝胶成像系统上观察电泳结果。

3)将扩增PCR产物回收测序。

5.标记与恢复基因遗传距离的确定

1)以构建好的同交群体不育单株DNA为模板，MGHES28和STSHY27引物检测重组体个数。

2)，统计分析，Mapmaker软件计算遗传重组距离。MGHES28标记与恢复基因遗传距离为2.4cM。STSHY27与恢复基因遗传距离为2.1cM。

6.标记应用于不同恢复系、保持系和不育系的鉴定

1)分别以不同恢复系、保持系和不育系DNA为模板，MGHES28和STSHY27引物进行PCR扩增。扩增产物分别在5.0％的聚丙烯胺胶和1.0％的琼脂糖胶上电泳。

具体实施方式实施例1：总DNA的提取

参考孙鑫等报道的SDS-CTAB法提取棉花总DNA。

1)提取液配制

1L提取液含：Tris-HCl(PH8.0) 0.1M

EDTA(PH8.0) 0.02M

NaCl 1.5M

PVP40(w/v) 2％

CTAB(w/v) 2％

以上溶液各自溶解后混合，定容到1L；临用前加2％β-巯基乙醇。

2)称取0.3g幼嫩棉花叶片放入2mL离心管里，加入钢珠，液氮速冻后，放置于Genegrid研磨仪上振荡30s，加入1mL预热65℃提取缓冲液。颠倒混匀。

3)将溶液置于65℃水浴中40min；加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1，V/V)振荡混匀，4℃离心机12000rpm离心10min，将上清转移到另一离心管中，用氯仿∶异丙醇(24∶1，V/V)再抽提一次，离心收集上清；

4)加入0.6倍体积的冰预冷的异丙醇，缓慢颠倒离心管混匀，室温静置30min。用毛细管将絮状DNA挑出，或者直接室温12000rpm离心10min，用70％的酒精洗涤1-2次，再用100％酒精洗涤1次，室温干燥DNA。

5)加200μL TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH8.0)或者纯水(ddH2O)，室温放置1小时，或者65℃水浴使DNA完全溶解；

6)加入20μL无DNA酶的RNA酶水(10mg/mL)，37℃保温1小时，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，V/V)抽提1～2次，将上清转移到另一个离心管中；

7)加0.1倍体积的3M NaAc(PH5.2)，2倍体积的冰预冷的无水乙醇，混匀后放置5分钟。缓缓水平转离心管5分钟，此时将于界面处形成一团粘稠透明的絮状沉淀用毛细管轻轻钩出，转移到1.5mL的离心管中；或者直接12000rpm离心10min，沉淀DNA。

8)加1mL70％的酒精洗涤沉淀，10000g离心10min，去掉上清，再用70％、100％的酒精各洗沉淀一次，在空气中使核酸沉淀干燥；

9)用50μL的TE重新溶解沉淀，于-20℃或-70℃贮存。

实例2：EST-SSR标记分析

育性分离群体DNA混合池的构建

田间调查棉花(P30A×Y18R)×P30B回交群体BC₁F₁代共369个单株育性分离情况，分别挂牌标记可育株和不育株，提取单株基因组DNA，分别构建不育和可育DNA混合池，每个混合池由5个单株构成。所构建不育和可育DNA混合池用于EST-SSR分子标记分析。

PCR反应体系的建立和热循环程序

主要参考Yin等方法。试验设计如下：

标准PCR反应体系为20μL，组成如下：

Template 1.0μL

10×Taq buffer 2.0μL

dNTP(2.5mM) 1.6μL

Forward Primer(10μM) 1.0μL

Reverse Primer(10μM) 1.0μL

Taq酶(2.5U/μL) 0.5μL

ddH2O 11.9μL

Total 20μL

PCR反应热循环程序为：

1)94℃预变性2min，

2)94℃变性30s，

3)55℃退火30s，

4)72℃延伸30s，

5)Go to step2，35 cycle；

6)72℃延伸7min。

7)4℃保存

引物的筛选

从棉花微卫星数据库下载98对名称为MGHES的EST-SSR引物，分别以棉花可育DNA和不育DNA混合池为模板进行PCR扩增，PCR产物在5.0％的聚丙烯胺胶上电泳。聚丙烯胺胶电泳电压为2000V，预电泳30min，上样8μL，电泳时间1h。琼脂糖胶电泳电压为120V，时间为1h。然后在凝胶成像系统上观察电泳结果。

回交群体BC₁F₁分离群体的EST-SSR标记分析

用在可育和不育DNA混合池中表现多态性的引物进行BC₁F₁群体369个单株进行PCR扩增和聚丙烯胺凝胶电泳，检测BC₁F₁群体多态性。

EST-SSR引物扩增特异DNA片段的回收测序

从聚丙酰胺胶切下PCR扩增的特异DNA片段，用无菌枪头将胶捣碎，加入50μL无菌ddH₂O溶解于室温放置1天，然后离心以沉淀胶块，吸取上清液，加入两倍体积无水乙醇沉淀过夜。15000rpm离心沉淀DNA，弃废液，晾干DNA，加10μL无菌ddH₂O溶解，取1μL作模板进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，用DNA回收试剂盒回收DNA，送北京中国农科院重大工程开放实验室测序部测序。

实例3：STSHY27标记分析

育性分离群体DNA混合池的构建

PCR反应体系的建立和热循环程序

主要参考Yin等方法。试验设计如下：

标准PCR反应体系为20μL，组成如下：

Template 1.0μL

10×Taq buffer 2.0μL

dNTP(2.5mM) 1.6μL

Forward Primer(10μM) 1.0μL

Reverse Primer(10μM) 1.0μL

Taq酶(2.5U/μL) 0.5μL

ddH₂O 11.9μL

Total 20μL

PCR反应热循环程序为：

1)94℃预变性2min，

2)94℃变性30s，

3)55℃退火30s，

4)72℃延伸60s，

5)Go to step2，35 cycle；

6)72℃延伸7min。

7)4℃保存

引物的筛选

根据5个标记所筛选到的21个阳性BAC克隆末端序列设计32对STS引物，扩增片段大小在200～600bp，分别以棉花可育DNA和不育DNA混合池为模板进行PCR扩增，PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶上电泳。电压为100V，电泳时间1h。然后在凝胶成像系统上观察电泳结果(图2)。

回交群体BC₁F₁分离群体的STS标记分析

STS引物扩增特异DNA片段的回收测序

从琼脂糖凝胶切下PCR扩增特异DNA片段，用DNA回收试剂盒回收DNA，送北京中国农科院重大工程开放实验室测序部测序。

实例4数据分析

遗传分析

共调查了配制(P30A×Y18R)×P30B回交群体369个单株的育性，其中180株为可育，记为1；189株为不育，记为0。卡方测验分析，群体分离比符合1∶1(X2＝0.11，P＞0.95)，完全符合一对显性基因模型。

遗传连锁分析

1)将两个标记对回交群体中34个可育和不育DNA混合池进行PCR扩增，统计重组体个数。MGHES28标记分析回交群体中出现了17个重组体，可育与不育的比例为197∶172，符合1∶1的分离比例。STSHY27标记分析回交群体中出现了13个重组体，可育与不育的比例为193∶176，符合1∶1的分离比例。

2)将MGHES28和STSHY27标记分析回交群体中出现的特异带有无情况输入计算机，运行Mapmaker 软件，计算两个标记与恢复基因的遗传距离。结果.MGHES28标记与恢复基因遗传距离为2.4cM；STSHY27与恢复基因遗传距离为2.1cM(图3)。

实例5分子标记应用于不同恢复系、保持系和不育系的鉴定

1)提取不同恢复系(R1，R2，R3，R4，R5)、保持系(B1，B2，B3，B4，B5)和不育系(A1，A2，A3，A4，A5)以及Y18恢复系(P1)和不育系P30A(P2)的基因组DNA。

2)以不同恢复系(R1，R2，R3，R4，R5)、保持系(B1，B2，B3，B4，B5)和不育系(A1，A2，A3，A4，A5)的基因组DNA为模板，MGHES28和STSHY27引物分别进行PCR扩增。扩增产物分别在5.0％的聚丙烯胺胶和1.0％的琼脂糖胶上电泳。

3)PCR鉴定结果表明MGHES28和STSHY27引物扩增出特异条带的为恢复系，未扩增出的为保持系和不育系(图4和图5)。

附图说明：

图1为M：DNA标准分子量；1F：MGHES28引物扩增可育DNA混合池；1S为MGHES28引物扩增不育DNA混合池；箭头所指为特异带。

图2为M：DNA标准分子量；F：STSHY27引物扩增可育DNA混合池；S：STSHY27引物扩增不育DNA混合池；箭头所指为特异带。

图3为MGHES28和STSHY27标记与恢复基因的遗传图谱。MGHES28标记与恢复基因遗传距离为2.4cM，STSHY27与恢复基因遗传距离为2.1cM。

图4为MGHES28引物在恢复系衍生系、保持系和不育系衍生系的扩增特征。M：DNA标准分子量；P1：亲本恢复系Y18；P2：亲本不育系P30A；A1～A5：5个不育系衍生系；B1～B5：不同保持系衍生系；R1～R5：不同恢复系衍生系。箭头所指为特异带。

图5为STSHY27引物在恢复系衍生系、保持系和不育系衍生系的扩增特征。M：DNA标准分子量；P1：亲本恢复系Y18；P2：亲本不育系P30A；A1～A5：5个不育系衍生系；B1～B5：不同保持系衍生系；R1～R5：不同恢复系衍生系。箭头所指为特异带。

序列表

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>棉花细胞质雄性不育恢复基因的分子标记MGHES28正向引物

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

cctgcaaacg ctattgatcc

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>棉花细胞质雄性不育恢复基因的分子标记MGHES28反向引物

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

cccagactgg tgatgatgaa

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>棉花细胞质雄性不育恢复基因的分子标记STSHY27正向引物

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tcagcttcaa gtaccgagca

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>棉花细胞质雄性不育恢复基因的分子标记STSHY27反向引物

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

aatagcccca tagccctagc

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>MGHES28引物扩增特异DNA片段

<210>5

<211>233

<212>DNA

<213>陆地棉恢复系Y18R(Gossypium hirsutum)

<400>5

cctgcaaacg ctattgatcc aaagcttaat atctcctgat cccgaactca attggccgag 60

ttcagataca acaacaagtt caggattctg gttatgtatt gcagcaacca caattcgatc 120

aacagcaaca accacaacag cagcagcagc agcagcagtt cttgcatgct ggctggtgca 180

cctaggcatt acattcatca tcaccagtct gggttcatca tcaccagtct ggg 233

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>STSHY27引物扩增特异DNA片段

<210>6

<211>505

<212>DNA

<213>陆地棉恢复系Y18R(Gossypium hirsutum)

<400>6

tcagcttcaa gtaccgagca acatcccata gttctagtgt actcagacaa ccacgatcca 60

ttcctgtgtg tcgaagaaaa gctgtggcat caatatggta gtgatcagac ggtggacggt 120

gaagatctat tgaagccttg ttcgaatctt taatttttta ttattgagat tttgaaggct 180

tattgagaaa tctgaagtga aatttgagaa gaggaaaaga ggagtcattt ggtaatgaca 240

attggccaga gaatgccatg aacgatagtg actagagtta tggaaaaaaa aaaaaagaaa 300

aagggagaag aaaaaaaggg ataaagattc aacagatagt agcaaactta ctagtggctc 360

tacgttggag gaacaaaatg ttcgtagcta aggtatgtcc atttcttctt cttcttcttc 420

ttcttcttct tcttcttctt cttcttctct ctttttttta ttcttttctt cctttttgct 480

gccctgctag ggctatgggg ctatt

Claims

1.两个与陆地棉细胞质雄性不育恢复基因连锁新标记MGHES28和STSHY27的开发。其步骤包括：

a).构建(P30A×Y18R)×P30B回交群体BC₁F₁代共369个单株，田间调查育性分离，可育株为180株，不育株为189株，卡方测验(X²＝0.11，P＞0.95)结果表明，可育与不育分离比例为1∶1，完全符合一对显性基因控制的模型。

b).SDS-CTAB法提取回交群体BC₁F₁代共369个单株的棉花叶片基因组DNA。构建可育和不育DNA混合池，每个混合池由5个单株构成。所有构建的可育和不育DNA混合池用于SSR和STS标记分析。

c).MGHES28和STSHY27标记分析回交群体可育和不育DNA混合池，进一步分析回交群体中不育单株出现的重组体。MGHES28和STSHY27标记扩增可育DNA混合池的特异DNA片段回收测序。

d).数据分析。

2.两个新标记MGHES28和STSHY27应用于棉花恢复系的分子鉴定。

a)提取不同棉花恢复系(R1，R2，R3，R4和R5)、保持系(B1，B2，B3，B4和B5)和不育系(A1，A2，A3，A4和A5)叶片基因组DNA。

b)以不同棉花恢复系(R1，R2，R3，R4和R5)、保持系(B1，B2，B3，B4和B5)和不育系(A1，A2，A3，A4和A5)叶片基因组DNA为模板，MGHES28和STSHY27标记进行PCR扩增，产物分别在5.0％聚丙烯胺和1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。

c)MGHES28和STSHY27标记在恢复系中扩增的特异DNA片段可明显的区分恢复系、保持系和不育系。

3.根据权利要求1的分子标记MGHES28引物，其特征在于：具有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的核苷酸序列。

4.根据权利要求1的分子标记STSHY28引物，其特征在于：具有SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的核苷酸序列。

5.根据权利要求1或2或3的分子标记MGHES28，其特征在于：具有SEQ ID No.5的核苷酸序列。

6.根据权利要求1或2或4的分子标记STSHY27，其特征在于：具有SEQ ID No.6的核苷酸序列。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述分子标记具有SEQ ID No.5的核苷酸序列。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述分子标记具有SEQ ID No.6的核苷酸序列。

9.用于SSR分析来获得与棉花细胞质雄性不育恢复基因的分子标记MGHES28引物对，其特征在于具有SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的核苷酸序列。用于STS分析来获得与棉花细胞质雄性不育恢复基因的分子标记STSHY27引物对，其特征在于具有SEQ ID No.3或SEQ ID No.4的核苷酸序列。

10.根据权利要求9所述用来SSR分析获得棉花细胞质雄性不育恢复基因分子标记MGHES28引物对扩增的特异DNA片段。其特征在于：所获得的分子标记引物对扩增的特异DNA片段具有SEQ ID No.5的核苷酸序列。

11.根据权利要求9所述用来STS分析获得棉花细胞质雄性不育恢复基因分子标记STSHY27引物对扩增的特异DNA片段。其特征在于：所获得的分子标记引物对扩增的特异DNA片段具有SEQ ID No.6的核苷酸序列。