CN101591708A - 黄瓜snp标记及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域的黄瓜SNP标记及其检测方法，具体为：鉴定黄瓜SNP位点的方法：选取纯合黄瓜亲本，测序，确定候选SNP位点；杂交获得F₁代单株，测序；检测F₁代测序结果的峰型图，确定出现杂合峰的候选位点。在黄瓜F₂代分离群体中确定SNP标记的多态性单株的方法：选取纯合黄瓜亲本，得到F₂代分离群体；选取F₂代中隐性表型单株，等量混合其DNA，构建隐性基因池；利用SNP引物进行扩增并测序，检测测序结果的峰型图；对隐性基因池单株分别利用SNP引物进行扩增并测序，检测测序结果的峰型图。一种黄瓜SNP标记，具有SEQ ID NO：1所示的序列。本发明缩短了SNP标记的开发和验证时间，减少了标记的检测成本。

Description

黄瓜SNP标记及其检测方法

技术领域

本发明涉及的是一种基因工程技术领域的标记及其检测方法，具体是一种黄瓜SNP(单核苷酸多态性)标记及其检测方法。

背景技术

广义的分子标记(molecular marker)是指可以遗传并可检测的特异的DNA序列、RNA序列或蛋白质。狭义的分子标记仅指DNA标记，这一界定标准目前已在世界范围内广泛采纳。分子标记是反映DNA分子水平遗传变异的遗传标记(genetic marker)。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性。DNA分子标记的出现和广泛应用对基因定位和基因组作图的发展产生了巨大的推动作用，使之成为遗传学乃至整个生物学研究的一个重要领域。从遗传学家Botstein首次提出DNA限制性片段长度多态性的思想，以及1995年PCR技术的诞生至今，已经有十几种基于DNA多态性的标记技术被建立，这些技术综合起来可以分为以分子杂交和限制性内切酶技术为基础的第一代分子标记(如RFLP等)；以PCR技术为基础的第二代分子标记(如RAPD，SRAP，SSR等)；以及与测序技术结合的以单核苷酸多态性为基因的第三代分子标记(如SNP)。同时，还衍生出以PCR技术与限制性内切酶技术相结合的分子标记(如AFLP，CAPs等)。

单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism，SNP)标记技术最早始于人类基因组计划中构建高密度人类遗传图谱的需要。1998年科学家首次提出并建立了SNP技术，目的是检测人类基因组中单个核苷酸的变异。SNP标记是由DNA序列中因单个核苷酸的变异而引起的遗传多样性，其在所有分子标记中数量最多，密度最高。有报道称水稻基因组中平均每1kb基因组序列存在1.70个SNP潜在位点。因此，SNP标记可以极大的增加标记数量，提高用于基因定位和遗传作图的标记密度。

然而，由于SNP标记的开发和检测都是已DNA分子测序为基础的，由此而来的检测成本和技术要求相对较高。在植物遗传学和分子生物学研究中，特别是在植物分子标记基因定位工作中，往往需要构建比较大的分离群体(一般均需＞1000单株)，进而需要对所有(或部分)单株进行标记扫描分析。传统鉴定和检测方法在这种大通量的分析工作中显得费时费力，高成本。这也在一定程度上制约了SNP标记在植物分子遗传学研究中的应用。同时，对一些基因组序列信息并不丰富的植物材料(如本发明中所使用的黄瓜材料)，SNP标记位点的鉴定工作本身也具有一定难度。

因此，发展SNP标记的开发和检测的新方法，缩短标记的开发和验证时间，减少标记的检测成本，是当前SNP技术应用于植物分子标记定位和大群体扫描的重要问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种黄瓜SNP标记及其检测方法。本发明缩短了SNP标记的开发和验证时间，减少了标记的检测成本。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种黄瓜SNP标记，具有SEQ ID NO：1所示的序列。

所述黄瓜SNP标记由SEQ ID NO：2所示上游引物和SEQ ID NO：3所示的下游引物扩增得到。

本发明涉及还一种黄瓜SNP标记的检测方法，包括如下步骤：

步骤一，选取纯合黄瓜亲本，对目标DNA区间进行测序，确定候选SNP位点；

步骤二，由纯合亲本杂交获得F₁代单株，对F₁代单株进行步骤一中的目标DNA区间的测序；

步骤三，检测F₁代测序结果的峰型图，确定出现杂合峰的候选位点。

本发明还涉及一种在黄瓜F₂代分离群体中SNP标记的多态性单株的检测方法，包括如下步骤：

步骤一，选取纯合黄瓜亲本，杂交获得F₁代，F₁代自交得到F₂代分离群体；

步骤二，选取F₂代中隐性表型单株，等量混合其DNA，构建隐性基因池；

步骤三，利用SNP引物进行扩增并测序，检测测序结果的峰型图，当出现F₁代测序结果峰型图的杂合峰时，则隐性基因池中含有交换株；

步骤四，对隐性基因池单株分别利用SNP引物进行扩增并测序，检测测序结果的峰型图，当出现F₁代测序结果峰型图的杂合峰时，该隐性单株即为SNP标记多态性单株。

本发明中的标记方法和检测结果通过研究黄瓜单性花决定基因M的试验过程加以验证。本发明利用单性花自交系亲本S52(华南类型自交系)和两性花自交系亲本H34(欧洲温室类型自交系)杂交获得F₁代，F₁植株再自交获得较大的F₂分离群体。随后利用标记S_ME8SA7筛选该扩大的群体，在该标记和M/m基因位点间获得两个交换单株。同时利用该标记筛选黄瓜基因组细菌人工染色体(BAC)文库，获得含有该标记片段的BAC克隆B78。该BAC克隆经末端测序获得两末端序列，并利用其M13末端序列开发出SNP标记P73。利用上述分离群体进行连锁分析发现，该标记与S_ME8SA7位于M基因位点同侧，并存在3个交换单株，这一结果证明了SNP标记P73的开发和检测方法的可行性。

本发明具有如下的有益效果：本发明缩短了SNP标记的开发和验证时间，减少了标记的检测成本；本发明的方法可以在黄瓜分子标记精细定位，染色体步移等遗传操作中有效发挥作用。

本发明中涉及的分子标记S_ME8SA7已在文献《Li et al.Development andfine mapping of three co-dominant SCAR markers linked to the M/m gene inthe cucumber plant(Cucumis sativus L.).Theor.Appl.Genet.2008，117：1253-1260》中公开。

本发明中涉及的黄瓜基因组BAC文库的筛选操作已在文献《Guan et al.Construction of a BAC library from cucumber(Cucumis sativus L.)andidentification of linkage group specific clones.Prog.Nat.Sci.2008，18：143-147》中公开。

附图说明

图1为SNP标记P73在黄瓜亲本材料S52单株目标DNA区间的PCR扩增测序峰型图；

图2为SNP标记P73在黄瓜亲本材料H34单株目标DNA区间的PCR扩增测序峰型图；

图3为SNP标记P73在黄瓜F₁世代单株目标DNA区间的PCR扩增测序峰型图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

SNP位点快速鉴定的方法

步骤一，对黄瓜亲本材料进行目标DNA区间的测序，确定候选SNP位点；随后对亲本杂交获得的F₁代单株进行目标DNA区间的测序

本发明中利用PCR标记对黄瓜基因组BAC文库进行扫描筛选，进而获得与M基因连锁的相关基因组序列。所有PCR反应体系均为：BAC文库质粒20ng，双向引物各0.2μmol/L，200μmol/L dNTPs，2mmol/L MgCl₂，1×Taq缓冲液，0.5UTaqDNA聚合酶，总反应体系为10μL，其中TaqDNA聚合酶购于Promega公司。扩增程序为：94℃3min；40cycles，94℃20s，65℃30s，72℃30s；72℃5min，1.5％琼脂糖凝胶电泳显示结果。

本发明首先利用标记S_ME8SA7筛选该扩大的群体，在该标记和M/m基因位点间获得两个交换单株，确定该标记与M基因的紧密连锁关系。

同时利用该标记筛选黄瓜基因组细菌人工染色体(BAC)文库，获得含有该标记片段的BAC克隆B78。我们对BAC克隆B78的两个末端进行了测序，获得两个约900bp的序列信息，利用此信息设计引物分别在两亲本及F₁单株中进行PCR扩增并对产物进行测序。

步骤二，观察F₁代测序结果的峰型图，若候选位点出现杂合峰，则该位点为SNP标记

如图1，2所示，发现来自该BAC克隆M13末端的片段在两亲本间可以产生差异扩增序列片段，差异位点为引物P73f侧下游217位核苷酸，其中为“A”的片段与单性花基因M连锁，为“C”的片段与两性花基因m连锁，该核苷酸序列信息列于SEQ ID NO：1中，此SNP标记命名为P73。

通过试验检测，本发明中所涉及的SNP标记开发和检测方法具有稳定性和实用性。利用本发明中介绍的方法开发SNP标记，可以在黄瓜分子标记精细定位，染色体步移等遗传操作中有效发挥作用。

实施例2

遗传分离群体的构建与交换单株的鉴定

步骤一，F₂分离群体的构建

欧洲温室类型自交系H34(父本)，两性花品种，正常生长条件下全株着生两性花，植株生长速度较快，成熟果实成球型，深绿色；华南类型自交系S52(母本)，单性花品种，植株生长早期(较低节位)着生雄花，随后雄花雌花交替分布，生长后期(较高节位)完全着生雌花，植株生长速度较慢，成熟果实长条状，白色。二者杂交获得F₁子代，单性花株(强雌株)，果实长条状，墨绿色。自交系S52、H34、F₁子代和单性花株/两性花株判断标准，已在文献《Li et al.Development and fine mapping of three co-dominant SCAR markers linked tothe M/mgene in the cucumber plant(Cucumis sativus L.).Theor.Appl.Genet.2008，117：1253-1260》中公开。本实施例利用F₁代自交产生F₂代群体。共种植约2700株F₂单株，鉴定单性花株/两性花株，卡方分析法进行验证。

步骤二，交换单株的筛选

①黄瓜基因组DNA的提取

用CTAB法提取亲本及F₂分离群体的叶片总DNA。方法为：取上部幼嫩叶片在液氮中快速研磨成粉末状，放于1.5ml的离心管中；加入预热的500μl CTAB提取缓冲液，60℃水浴0.5h-1h；加入等体积氯仿异戊醇，其中氯仿与异戊醇的体积比为24∶1，混匀后12000r/min 4℃离心10min；将上清液转入新的离心管，加等体积异丙醇，轻轻混匀，冰浴0.5h以上；12000r/min 4℃离心10min；倒去上清液，用体积分数为70％的乙醇冲洗沉淀两次，干燥后，加入TE缓冲液150μl溶解后，加入10μg/ml的RNA酶去除RNA，37℃水浴30min；在0.8％琼脂糖凝胶电泳，以50ng/μl的λDNA为标准，估计所得DNA的浓度；后用TE稀释终浓度为30ng/μl，存于-20℃备用。

②标记扫描F₂分离群体

利用与已有的与M基因连锁的分子标记(S_ME8SA7)和本发明中开发的一个分子标记(P73)扫描上述获得的F₂分离群体，寻找标记基因型(通过分析显隐亲本获得)与性状表现型(单性花/两性花)的差别单株，获得标记与M基因的交换单株。PCR体系：基因组DNA 30ng，引物0.2μmol/L，200μmol/L dNTPs，2mmol/L MgCl₂，1×Taq缓冲液，0.5U TaqDNA聚合酶，总反应体系为10μL(标记P73为50μL体系)，其中TaqDNA聚合酶购于Promega公司。PCR扩增程序程序如下表1。

表1

上述PCR产物检测方法为：标记S_ME8SA7使用3％琼脂糖凝胶电泳显示结果；标记P73直接送交上海生工进行测序。

需要说明的是，由于标记P73属于SNP标记，使用成本较高，故在本发明中，我们仅扫描所有隐性单株(约660株)。具体操作方法为：选取10株两性花(隐性表型)单株，等量混合DNA，共构建66个隐性基因池，在50μL体系中利用标记P73引物组合进行扩增，产物直接送交上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，测序引物使用P73f。利用测序得到的“峰型图”分析其约217位的核苷酸的峰型(核酸序列“CAGTnAAAT”中的n位点)，若为如图3中F₁单株表现的杂合峰型，该隐性基因池中即含有交换株，随后再以相同方法检测该隐性池，获得其交换株。

测序样品具体操作：将PCR产物中加入goldview荧光染料3μl，4℃下放置10min让染料同DNA结合，然后加入上样缓冲液2μl，混匀后通过1％琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外灯下切下目标片段放入1.5ml的离心管中，用DNA回收试剂盒回收，其中DNA回收试剂盒为上海生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒，产品号为Cat.No.SK1132。

序列表

<110>上海交通大学

<120>黄瓜SNP标记及其检测方法

<160>3

<210>1

<211>802

<212>DNA

<213>黄瓜(Cucumis sativus L.)

<220>

<221>mutation

<222>(217)

<223>n＝A或C

<400>1

TGCATTATAT ATCTCGAGGT GGCAACTTTA CTTTTCTTGA AATATTTTAG TTTAGTTTCT    60

ATGTGTGCAA AGAGAATGGG ATGTACATAT CAATGCATTC TAGTTATTTA TTTTTCTACT    120

ATCCATAAAT GTGAAATATT GGTCCAACTC TTTTATTATT AAAATTGGTT GAATAATAAT    180

AATGATAAAG TTTAAGAATT TATTTTTAAT TACAGTnAAA TGAATCAAAA TATCACTAAA    240

TGAACCGCGA CAAACCAAAA TAAACTAATA AAAACCTATC ATAGTTTATT ATAATCTAAC    300

ATATATAGAT TGTGATATAT ATTTTGTTAT ATTTGTAAAT ATTTTCAAAA GTTTTTTATT    360

TAAAATAATT TTGTTAAGTT AATAAATAAT TATGTTAGGT GCATATACAT TCTAAACTTT    420

TGATTTTATA GTTTCTTTAC TTTTAAGAAA TCTTAATTTC AATCTCTGTT GTTTGTTTCG    480

TTACAGTTGA TTTTTTAAAA ACTTTTTATT ATTCAATTAT AATAAATAAT AAGTTTGAGA    540

GACTAATTAA ATTTAAGATT TTATTAAAGA TATAGATGTT AATTACAATT TTTATGAAGG    600

AAGACATTAG GTTAATATAT CATTGAAATG TTTGAGTTAA AAAATGAGTA TAAAAACTAG    660

ATTCAGAACA TTAGCTTGTG GAAGCATAAA GATCAAAATG TTGTTGTAAA TTAAATAGAT    720

GACAATATAA TTATTTTGTC CTTTTTTTTT CTTTTCTTTT CTTTAGTTAT TACTTTATTG    780

ACTCTGAATT TGATGAACCC CA                                             802

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

TGCATTATAT ATCTCGAGGT GGC    23

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

TGGGGTTCAT CAAATTCAGA GTC    23

Claims (4)

1、一种黄瓜SNP标记，其特征在于，具有SEQ ID NO：1所示的序列。

2、根据权利要求1所述的黄瓜SNP标记，其特征是，所述黄瓜SNP标记由SEQ ID NO：2所示上游引物和SEQ ID NO：3所示的下游引物扩增得到。

3、一种黄瓜SNP标记的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，选取纯合黄瓜亲本，对目标DNA区间进行测序，确定候选SNP位点；

步骤二，由纯合亲本杂交获得F₁代单株，对F₁代单株进行步骤一中的目标DNA区间的测序；

步骤三，检测F₁代测序结果的峰型图，确定出现杂合峰的候选位点。

4、一种在黄瓜F₂代分离群体中SNP标记的多态性单株的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，选取纯合黄瓜亲本，杂交获得F₁代，F₁代自交得到F₂代分离群体；

步骤二，选取F₂代中隐性表型单株，等量混合其DNA，构建隐性基因池；

步骤三，利用SNP引物进行扩增并测序，检测测序结果的峰型图，当出现F₁代测序结果峰型图的杂合峰时，则隐性基因池中含有交换株；

步骤四，对隐性基因池单株分别利用SNP引物进行扩增并测序，检测测序结果的峰型图，当出现F₁代测序结果峰型图的杂合峰时，该隐性单株即为SNP标记多态性单株。

Images