CN102417924B

CN102417924B - 基于高分辨率溶解曲线的黄瓜杂交种纯度鉴定方法

Info

Publication number: CN102417924B
Application number: CN 201110198187
Authority: CN
Inventors: 兰青阔; 王永; 赵新; 朱珠; 郭永泽; 程奕
Original assignee: Central Laboratory of Tianjin Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Central Laboratory of Tianjin Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-07-15
Filing date: 2011-07-15
Publication date: 2013-04-17
Anticipated expiration: 2031-07-15
Also published as: CN102417924A

Abstract

本发明公开了一种基于高分辨率溶解曲线（ highresolutionmelting ， HRM ）的黄瓜杂交种种子纯度鉴定的方法。该方法对 CLA1 或 CLA6SNP 位点进行 HRM 分析，能够对市售黄瓜杂交品种进行纯度鉴定。本发明的检测方法在 1-2h 之内即可完成种子纯度鉴定工作，具有快速、低成本、操作方便和闭管检测防止污染等优势。

Description

基于高分辨率溶解曲线的黄瓜杂交种纯度鉴定方法

技术领域

本发明属于农业的蔬菜育种与应用技术领域，具体涉及黄瓜杂交种纯度鉴定方法，是一种基于高分辨率溶解曲线分析技术（ high resolution melting ， HRM ）的杂交种种子纯度鉴定方法。

背景技术

纯度是种子重要的指标，关系农业生产产量和农民收入，用于蔬菜种子纯度及品种鉴定的方法有田间试验、 RAPD 、 SSR 等技术，但在操作性、稳定性、多态性等方面不能满足目前的需要。单核苷酸多态性（ single nucleotide polymorphism ， SNP ），是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的 DNA 序列多态性，主要有密度高，遗传稳定性好、具有代表性、分析易自动化等特性，已成为继微卫星之后的新一代遗传学标记，近年来被广泛应用于蔬菜分子辅助育种及品种鉴定。 Jin-kee Jung 等（ 2010 ）利用 Allele Speciﬁc PCR (AS-PCR) 从 conserved ortholog set II (COSII) markers 中筛选出 40 个辣椒 SNP 位点，能区分 81 个商品种子中的 79 个，能鉴定 17 个甜辣椒； Wim Deleu 等（ 2009 ）从甜瓜公共 EST 数据库发掘 SNP 标记，鉴定获得 45 个 SNP 位点，丰富了甜瓜基因变异图谱，并将 SNP 标记用于甜瓜品种鉴定。

是由犹他大学和爱德华科技公司合作开发的一种 SNP 及碱基突变研究的技术（ Gundry C N ， 2002 ），是常规溶解曲线技术与饱和荧光染料和高精密度 PCR 仪相结合的再发展技术。其原理是通过实时监测精密升温过程中双链 DNA 饱和荧光染料与 PCR 扩增产物的结合情况，以区分出 PCR 产物中碱基的细微差异。 HRM 技术具有高通量、低成本、操作简便、闭管检测、分析简单等优势，广泛应用于医学分子分型诊断及甲基化研究。

用于植物 DNA 变异检测的历史较短，但已涉及多个研究方向。 David De Koeyer 等（ 2009 ）评估了 HRM 技术在马铃薯分型和多倍体检测上的应用，认为 HRM 技术在马铃薯基础和应用研究上非常有用； Hee-Jin Jeong 等（ 2011 ）利用 HRM 技术对区分 6 类辣椒品种及进行品种鉴定； Shu-Biao Wu 等（ 2009 ）通过 HRM 技术对杏树中 12 个 SNP-anchored putative 基因进行分型分析，并完善遗传图谱，为后续的功能研究奠定基础。

本专利将 HRM 技术应用于黄瓜 SNP 位点筛选，并获得 2 个 SNP 位点，平均每 481 bp 筛选出 1 个 SNP ，验证了 HRM 技术在黄瓜 SNP 筛选工作中的可行性。本研究通过 Illumina Eco real-time PCR system 进行 HRM 研究，在试验过程中，充分体现了 HRM 技术快速、低成本、操作方便和闭管检测防止污染等优势。筛选出的 2 个 SNP 位点在市售黄瓜品种中具有较强的多态性，适宜于其中 11 个品种的纯度鉴定，并且具备用于品种鉴定的潜能，为完善黄瓜遗传图谱及相关功能基因研究打下基础。

发明内容

本发明的目的在于公开了一种基于高分辨率溶解曲线分析技术（ high resolution melting ， HRM ）的杂交种种子纯度鉴定方法，为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

本方法通过对供试黄瓜杂交种进行 DNA 提取、 PCR 扩增和 HRM 分析，确认 CLA1 或 CLA6 SNP 位点分型，从而对黄瓜杂交种进行纯度鉴定。候选 SNP 位点类型及 PCR 引物见下表：

Figure 2011101981877100002DEST_PATH_IMAGE001

供试黄瓜杂交种取样及 DNA 提取方法为：每品种取 40 粒种子，去壳，液氮冷冻研磨（ Retsch MM400 生物粉碎仪），加入 CTAB 裂解缓冲液（ 20 g/L CTAB ， 1.4 M NaCl ， 0.1 M Tris-HCl ， 20 mM Na2EDTA ） 500 μ L ， 65 ℃恒温水浴（ Neslab ）裂解 30min ，后续 DNA 提取纯化按树脂型基因组 DNA 提纯试剂盒（赛百盛）操作进行。 DNA 提取后浓度统一稀释至 50 ± 1 ng/ μ L ， Nanodrop ND1000 ， Thermol ）。 DNA 提取方法也可以按市售试剂盒进行。

供试黄瓜杂交种 PCR 方法为：

(1)CLA1 上游引物序列 H-A1F1 ： 5 ’ -GAAACAAAAAAACACATTACTCCCA -3 ’， CLA1 下游引物序列 H-A1R1 ： 5 ’ - CTGCACAATCGTCAACACT -3 ’。

上游引物序列 H-A6F1 ： 5 ’ -GTGGGTGAGTTTTATCTTTAAACGA -3 ’， CLA6 下游引物序列 H-A6R1 ： 5 ’ - CTTCAATTCTACTGGCTCCAT -3 ’。

采用上述 PCR 扩增引物对供试种子样品模板 DNA 进行 PCR 扩增，其中的 PCR 扩增反应的总体积为 10 μ L ，扩增反应体系为： 2 ×带有 ROX 的 Platinum 定量 PCR SuperMix-UDG （ invitrogen ） 5 μ L ， 20 × Evagreen （ biotium ） 0.5 μ L ，上游引物和下游引物（ 10 μ mol/L ）各 0.2 μ L ，基因组 DNA 模板（ 50 ng/ μ L ） 0.5 μ L ，双蒸水补足 10 μ L 。 PCR 反应程序为 95 ℃预变性 10 min ， 40 个扩增循环（ 95 ℃ 15 sec ， 60 ℃ 30 sec ）。

供试黄瓜杂交种 HRM 分析方法为： 95 ℃变性 15 sec ， 55 ℃退火 15 sec ，然后逐步上升至 95 ℃保持 15 sec 。

供试黄瓜杂交种 SNP 分型鉴定：通过分析 HRM 结果，比较标准样品和供试种子样品的标准视图（ Normailized ）和差异视图（ Difference ），对供试种子样品进行 SNP 分型。

供试黄瓜杂交种纯度鉴定：通过计算供试种子样品中杂交种的比例确定种子纯度。

本发明的检测方法在不计算 DNA 提取过程耗时的情况下， PCR 耗时 40-90min ， HRM 分析 10-30min ，所以本发明的检测方法在 1-2h 之内即可完成种子纯度鉴定工作，具有快速、低成本、操作方便和闭管检测防止污染等优势。

本发明方法能够对市售 80% 以上黄瓜杂交品种进行纯度鉴定。

为了能更加清楚的说明本发明的测定方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明。

、原理

本方法应用一种新型的核酸分析方法其原理是：通过荧光信号实时监测精密升温过程中双链 DNA 饱和荧光染料与 PCR 扩增产物的结合情况，比较 PCR 产物中碱基的细微差异对供试样品进行 SNP 分型鉴定，从而计算杂交种的纯度。

、引物设计

通过测序比对和查询 NCBI 、 ICuGI 数据库等方法获得 2 个候选 SNP 位点，分别为 CLA1 和 CLA6 ，其类型、功能及引物序列详见表 1 。 HRM 引物设计采用小片段法，使用软件 LightScanner Primer Design software 设计，引物由上海生工合成 :

引物序列表如下：

Figure 2011101981877100002DEST_PATH_IMAGE002

3 、取样及 DNA 提取

供试品种取 40 粒种子，去壳，液氮冷冻研磨（ Retsch MM400 生物粉碎仪），加入 CTAB 裂解缓冲液（ 20 g/L CTAB ， 1.4 M NaCl ， 0.1 M Tris-HCl ， 20 mM Na2EDTA ） 500 μ L ， 65 ℃恒温水浴（ Neslab ）裂解 30min ，后续 DNA 提取纯化按树脂型基因组 DNA 提纯试剂盒（赛百盛）操作进行。 DNA 提取后浓度统一稀释至 50 ± 1 ng/ μ L ， Nanodrop ND1000 ， Thermol ）。 DNA 提取方法也可以按市售试剂盒进行。

、 PCR 反应

采用 (1)CLA1 上游引物序列 H-A1F1 ： 5 ’ -GAAACAAAAAAACACATTACTCCCA -3 ’， CLA1 下游引物序列 H-A1R1 ： 5 ’ - CTGCACAATCGTCAACACT -3 ’。

扩增引物对供试种子样品模板 DNA 进行 PCR 扩增（仪器为 Illumina Eco real-time PCR system ），其中的 PCR 扩增反应的总体积为 10 μ L ，扩增反应体系为： 2 ×带有 ROX 的 Platinum 定量 PCR SuperMix-UDG （ invitrogen ） 5 μ L ， 20 × Evagreen （ biotium ） 0.5 μ L ，上游引物和下游引物（ 10 μ mol/L ）各 0.2 μ L ，基因组 DNA 模板（ 50 ng/ μ L ） 0.5 μ L ，双蒸水补足 10 μ L 。 PCR 反应程序为 95 ℃预变性 10 min ， 40 个扩增循环（ 95 ℃ 15 sec ， 60 ℃ 30 sec ）。

、 HRM 分析（仪器为 Illumina Eco real-time PCR system ） 95 ℃变性 15 sec ， 55 ℃退火 15 sec ，然后逐步上升至 95 ℃保持 15 sec 。

、 SNP 分型鉴定：通过分析 HRM 结果，比较标准样品和供试种子样品的标准视图（ Normailized ）和差异视图（ Difference ），对供试种子样品进行 SNP 分型。

用 CLA1 位点检测， HRM 分析结果是 C/T 的测试种子是杂交种， HRM 分析结果是 C/C 或者 T/T 的测试种子不是杂交种。

用 CLA6 位点检测， HRM 分析结果是 A/G 的测试种子是杂交种， HRM 分析结果是 A/A 或者 G/G 的测试种子不是杂交种。

、纯度鉴定

通过计算供试种子样品中杂交种的比例确定种子纯度 :

种子纯度 = 杂交种数量 / 供试种子数量 *100% 。

附图说明 :

图 1 为 CLA1 位点的 HRM 分析标准视图（ Normailized ）；

图 2 为 CLA1 位点的 HRM 分析差异视图（ Difference ）；

图 3 为 CLA6 位点的 HRM 分析标准视图（ Normailized ）；

图 4 为 CLA6 位点的 HRM 分析差异视图（ Difference ）。

具体实施方式

为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明，在此需加以说明的是：本发明所述的引物序列见表 1 。

实施例 1

（ 1 ）样品包括 SNP 位点 CLA1 HRM 分析对照母本、父本和杂交种的 DNA ，以及供试黄瓜品种津优 36 ，属于地黄瓜，产地天津。

（ 2 ） PCR 引物序列表如下：

Figure 2011101981877100002DEST_PATH_IMAGE003

（ 3 ）取样及 DNA 提取

（ 4 ） PCR 反应

按上表所述的 PCR 扩增引物对供试种子样品模板 DNA 进行 PCR 扩增（仪器为 Illumina Eco real-time PCR system ），其中的 PCR 扩增反应的总体积为 10 μ L ，扩增反应体系为： 2 ×带有 ROX 的 Platinum 定量 PCR SuperMix-UDG （ invitrogen ） 5 μ L ， 20 × Evagreen （ biotium ） 0.5 μ L ，上游引物和下游引物（ 10 μ mol/L ）各 0.2 μ L ，基因组 DNA 模板（ 50 ng/ μ L ） 0.5 μ L ，双蒸水补足 10 μ L 。 PCR 反应程序为 95 ℃预变性 10 min ， 40 个扩增循环（ 95 ℃ 15 sec ， 60 ℃ 30 sec ）。

孔 PCR 反应板分布为：母本、父本、杂交种各 2 孔，阴性对照 2 孔， 40 个样品各 1 孔，共 48 孔。

（ 5 ） HRM 分析（仪器为 Illumina Eco real-time PCR system ） 95 ℃变性 15 sec ， 55 ℃退火 15 sec ，然后逐步上升至 95 ℃保持 15 sec 。

（ 6 ） SNP 分型鉴定：通过分析 HRM 结果，比较标准样品和供试种子样品的标准视图（ Normailized ）和差异视图（ Difference ），对供试种子样品进行 SNP 分型鉴定。

分型鉴定结果为 C/T 类型种子 39 粒， C/C 类型种子 1 粒。

（ 7 ）纯度鉴定

通过计算供试种子样品中杂交种的比例确定种子纯度。

种子纯度 =39/40*100%=97.5% 。

实施例 2

（ 1 ）样品包括 SNP 位点 CLA6 HRM 分析对照母本、父本和杂交种的 DNA ，以及供试黄瓜品种欧美水果黄瓜，属于水果黄瓜，产地宁阳。

（ 2 ） PCR 引物序列表如下：

Figure 2011101981877100002DEST_PATH_IMAGE004

（ 3 ）取样及 DNA 提取

（ 4 ） PCR 反应

分型鉴定结果为 A/G 类型种子 38 粒， G/G 类型种子 2 粒。

（ 7 ）纯度鉴定

通过计算供试种子样品中杂交种的比例确定种子纯度。

种子纯度 =38/40*100%=92.5% 。

实施例 3

（ 1 ）样品包括 SNP 位点 CLA6 HRM 分析对照母本、父本和杂交种的 DNA ，以及供试黄瓜品种津绿龙胜，属于地黄瓜，产地天津。

（ 2 ） PCR 引物序列表如下：

（ 3 ）取样及 DNA 提取

（ 4 ） PCR 反应

分型鉴定结果为 A/G 类型种子 39 粒， G/G 类型种子 1 粒。

（ 7 ）纯度鉴定

通过计算供试种子样品中杂交种的比例确定种子纯度。

种子纯度 =39/40*100%=97.5% 。

序列表

<110> 天津市农业科学院中心实验室

<120> 基于高分辨率溶解曲线的黄瓜杂交种纯度鉴定方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 基因序列

<400> 1

gaaacaaaaa aacacattac tccca 25

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 基因序列

<400> 2

ctgcacaatc gtcaacact 19

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 基因序列

<400> 3

gtgggtgagt tttatcttta aacga 25

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 基因序列

<400> 4

cttcaattct actggctcca t 21

Claims

1.用于黄瓜SNP位点CLA6 HRM分析的一对PCR扩增引物，其特征在于，包括上游引物序列：5’- GTGGGTGAGTTTTATCTTTAAACGA -3’，下游引物序列： 5’- CTTCAATTCTACTGGCTCCAT -3’。

2.一种采用权利要求1所述引物基于高分辨率溶解曲线分析技术的黄瓜杂交种种子纯度鉴定的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）采用权利要求1所述的 PCR扩增引物对供试种子样品模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应的总体积为10 μL，扩增反应体系为：invitrogen 生产的2×带有ROX的Platinum 定量PCR SuperMix-UDG 5μL，biotium生产的20×Evagreen 0.5μL，上游和下游引物10μmol/L，各0.2μL，浓度为50ng/μL的供试黄瓜杂交种基因组DNA模板0.5μL，双蒸水补足10 μL；PCR反应程序为95℃预变性10 min，40个扩增循环，循环条件为95℃ 15 sec，60℃ 30 sec；

（2）对PCR扩增产物进行HRM分析，程序为95℃ 变性15 sec，55 ℃退火15 sec，然后逐步上升至95℃保持15 sec；

（3）通过分析HRM结果，比较标准样品和供试种子样品的标准视图和差异视图，对供试种子样品进行SNP分型;通过计算供试种子样品中杂交种数量占总种子数量的比例确定种子纯度。