CN102676682A - 一种应用8重pcr进行胡杨群体遗传分析和亲子鉴定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种应用8重PCR进行胡杨群体遗传分析和亲子鉴定的方法。在本发明的方法中，使用一组引物进行多重PCR反应，同时对8个位点进行扩增，所述引物由序列为SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：8的引物组成。本发明还涉及由序列为SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：8的引物组成的引物组，包含所述引物组的试剂盒以及所述引物组的用途。本发明筛选出8对多态性高且两两不发生相互作用的引物，并且通过优化引物浓度和调整DNA模板量进行多重PCR反应。本发明的方法快速高效，适用于极微量DNA，易于自动化，在胡杨遗传学分析、亲子鉴定及品种保护等方面都有着广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于遗传学研究领域，该发明公开了一种可同时对胡杨(Populus euphratica，Torr&Gray)全基因组上8个SSR位点同时进行扩增的方法。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是现今生物监测和分子标记中最常用的扩增技术，它可将某一DNA片段在几小时内扩增几十至几百万倍。随着荧光标记PCR技术的普及和应用，目标片段的定量可以精确到1bp。但是一般PCR仅应用一对引物，通量较低，成本很高，在对于大群体、多位点的遗传学研究中，建立一种高效、高通量的方法，显得十分迫切和必要。
多重PCR(Multiplex PCR)是在普通普通PCR的基础上加以改进，于一个反应体系中加入多对特异性引物，针对同一模板的不同区域扩增多个片段的PCR技术。这一概念由Charnberian等[Nucleic Acids Res.1988，16：11141-11156]率先于1988年提出。由于多重PCR可以对多个位点同时进行扩增，具有省时、高效、降低成本和节约DNA模板的优点，对于一些模板较珍贵样本尤其重要。因此，该方法一经提出后，即得到广泛应用并迅速发展，在生命科学领域中已经成为一种重要的研究手段。
由于多重PCR要求在同一反应体系中进行多个位点的特异性扩增，因此技术难度增大。迄今为止，公开发表的成功的4重以上的多重PCR较少。为了得到理想的多重PCR反应体系，需要针对引物和DNA模板的浓度、引物设计和组合进行优化。
本发明研究对象为胡杨。胡杨是荒漠地区特有的珍贵森林资源，它对于稳定荒漠河流地带的生态平衡，防风固沙，调节绿洲气候和形成肥沃的森林土壤具有十分重要的作用，是荒漠地区农牧业发展的天然屏障。同时，胡杨是较古老的树种，保留有大量的自然群体，因此，对胡杨的研究对于胡杨的保护和利用、林木育种和群体进化遗传学研究等方面都具有重要的意义。
本发明提供了一种胡杨的多重PCR检测方法并将结果用于胡杨群体的遗传结构研究和亲本-子代关系分析。
发明内容
本发明针对传统PCR方法耗时耗力的不足，提供了一种高效、便捷的对胡杨多个SSR位点进行扩增的引物和方法，实现一个反应扩增8个具有高多态性的SSR位点，为后续的群体遗传学分析和自然群体中的亲子代鉴定提供了重要的技术支持。
本发明中对体系的优化一方面涉及引物设计过程中对引物序列进行比对，减小引物之间配对和互补的几率，由此获得8对多态性高且两两不发生相互作用的引物。本发明还一方面是在实验中对各位点引物的浓度进行摸索，调整各引物组分之间的浓度，使各位点平衡而高效的扩增。本发明一方面调整DNA模板的浓度，避免过高或过低的模板浓度对实验结果的影响。本发明又一方面对PCR最适条件的摸索，尤其是对退火温度、循环数和延伸时间的优化。本发明还涉及上述各方面的任意组合。优选地，本发明具备上述各个方面的优化。
因此，本发明提供下述实施方案。
1、一种应用8重PCR进行胡杨群体遗传分析和/或亲子鉴定的方法，其特征在于使用一组引物进行多重PCR反应，同时对8个位点进行扩增，所述引物由序列为SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：8的引物组成。
2、根据1所述的方法，其中，在所述引物中，正向引物的5’端分别用不同的荧光基团进行修饰，由此得到的结果用不同荧光标记，从而利于对结果进行分析。优选地，所述荧光基团包括Fam、Hex、Tamra和Rox。优选地，在所述引物为正向引物5’端用荧光基团Fam、Hex、Tamra或Rox修饰的引物，其由下述序列组成：
其中正向引物5’端的Fam，Hex，Tamra，Rox分别为荧光修饰基团，在结果中，Fam，Hex，Tamra和Rox分别对应的标记颜色为蓝色、绿色、黄色和红色。
3、根据1或2所述的方法，其中各引物扩增出条带片段大小分别为：
4、用于进行胡杨群体遗传分析和/或亲子鉴定的引物组，其特征在于所述引物由序列为SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：8的引物组成。
5、根据4所述的引物组，其特征在于，在所述引物中，正向引物的5’端分别用不同的荧光基团进行修饰，优选地，所述荧光基团包括Fam、Hex、Tamra和Rox。
6、根据4或5所述的引物组用于进行胡杨群体遗传分析和/或亲子鉴定的用途。
7、一种用于进行胡杨群体遗传分析和/或亲子鉴定的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于进行多重PCR反应的一组引物，所述引物由序列为SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：8的引物组成。
8、根据7所述的试剂盒，其特征在于，在所述引物中，正向引物的5’端分别用不同的荧光基团进行修饰，优选地，所述荧光基团包括Fam、Hex、Tamra和Rox。
本发明是一种多重PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)CTAB法(Doyle等，Phytochemistry Bulletin.(1987)9.1-15)或利用试剂盒对自然群体的胡杨进行基因组DNA提取
(2)根据文献(Wu等，Molecular Ecology Resources(2008)8，1142-1144)和公共数据库(http://www.ornl.gov/sci/ipgc/ssr_resource.htm)中引物的信息进行筛选和设计，依据扩增产物片段大小，获得8组引物，其中对扩增效果不理想的引物Pe14和Pe17进行了重新设计，命名为Pe14_2和Pe17_2，并分别在8组引物的正引物5’端标记荧光基团，对产物进行毛细管电泳检测以确定其片段大小。其中正引物5’端的Fam，Hex，Tamra，Rox分别为荧光修饰基团，在氩激光照射下分别会显示蓝色、绿色、黄色和红色，用于区分不同的PCR产物。
各引物序列与各正引物5’端具体修饰情况如下：
(3)按以下体系进行扩增：
PCR反应体系中引物终浓度如下：Fam-Pe16 0.3mol/μl；Fam-Pe50.1mol/μl；Hex-Pe14 0.125mol/μl；Tamra-Pe2 0.275mol/μl；Tamra-GCPM_1158 0.55mol/μl；Tamra-ORPM_207 0.55mol/μl；Rox-Pe17 0.2mol/μl；Rox-Pe8 0.15mol/μl。
按照以上浓度加入引物后，加入3μl 2x QIAGEN Multiplxe PCRMaster Mix；2μl DNA模板，用无菌水补至10μl。混匀后放入PCR仪中进行扩增。
PCR反应条件如下：
95℃15min；
94℃30s，56℃1min，72℃45s，30个循环；
60℃10min。
(4)取所得产物1.5μl进行毛细管电泳检测(ABI-3730)，以LizStandard Size 500为内标，利用软件GeneMapper读出片段长度。
(5)根据所得分子标记结果，可进行群体遗传与亲本-子代分析等方面的研究。
本发明的有益效果：
1)该多重PCR与传统PCR方法相比，可以大大提高效率，一次反应即可完成8个位点的扩增，操作步骤减少，快捷方便，减少了操作失误发生的可能。同时可节约DNA模板，对于采样较困难的胡杨自然群体尤为重要。
2)一组多重PCR引物组合中包含8对高多态性引物，可产生大量的高多态性分子标记数据，为遗传学研究以及胡杨亲本分析提供了有力的技术支持。
3)减小了引物之间配对和互补的几率，由此获得8对多态性高且两两不发生相互作用的引物。
以480个样本为例，此方法比传统的利用单一引物进行的PCR扩增与检测节约了50％的成本，且随着样本数的增大更为经济。
附图说明
图1：利用Multiplex Manager软件，根据片段长度设计出的引物组合，蓝、绿、黄、红分别代表Fam，Hex，Tamra和Rox四种荧光基团。
图2：利用GeneMapper软件读出的各组引物扩增产物的片段长度。每组引物所在位置与图1中各组引物一一对应，由上至下每一组荧光标记分别为Fam，Hex，Tamra，Rox和LIZ Standard Size 500。
具体实施方式
实施实例1
利用多重PCR方法对胡杨自然群体进行分子标记并计算遗传参数。
1)选择新疆库尔勒地区(纬度41.08°N，经度86.11°E)自然群体中150株成年胡杨。
2)CTAB法提取所有胡杨亲本的DNA，并将DNA稀释至10ng/μl，作为多重PCR的模板。
3)利用前述反应体系对所有DNA样本进行扩增。
4)对PCR产物进行毛细管电泳检测，并利用GeneMapper(AppliedBiosystems)软件读出PCR产物的片段长度。
5)根据群体的分子标记结果计算出相应的等位基因数，表观杂合度和期望杂合度，近交系数等，具体结果如下：
实施实例2
利用多重PCR方法对胡杨自然群体进行扩增并根据结果进行亲子代关系分析。
1)选择自然群体中20株成年胡杨雌株，采集蒴果，同时采集雌株附近的所有雄株个体60株。用组培方式繁殖母本蒴果中的种子，3个月后将幼苗移栽到温室统一培养，单株采集幼嫩叶片。
2)CTAB法提取所有胡杨亲本的DNA，每个雌株选择2-9个子代提取DNA，共126株。将DNA稀释至10ng/μl，作为多重PCR的模板。
3)利用前述的8重体系对所有DNA样本进行扩增。
4)对PCR产物进行毛细管电泳检测，并利用GeneMapper(AppliedBiosystems)软件读出PCR产物的片段长度。
利用Cervus(Field Genetics)软件对亲子代群体进行分析，根据计算得出的LOD值推断可能的亲子代关系组合。结果显示78.6％以上的结果处于95％的置信区间内，可见该方法有较高的准确率，对于育种等工作的应用有比较重要的参考作用。
Claims (8)
1.一种应用8重PCR进行胡杨群体遗传分析和/或亲子鉴定的方法，其特征在于使用一组引物进行多重PCR反应，同时对8个位点进行扩增，所述引物由序列为SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：8的引物组成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述引物为正向引物5’端用荧光基团Fam、Hex、Tamra或Rox修饰的引物，其由下述序列组成：
其中正向引物5’端的Fam，Hex，Tamra，Rox分别为荧光修饰基团，在结果中，Fam，Hex，Tamra和Rox分别对应的标记颜色为蓝色、绿色、黄色和红色。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中各引物扩增出条带片段大小分别为：
4.用于进行胡杨群体遗传分析和/或亲子鉴定的引物组，其特征在于所述引物由序列为SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：8的引物组成。
5.权利要求4所述的引物组，其特征在于，在所述引物中，正向引物的5’端分别用不同的荧光基团进行修饰，优选地，所述荧光基团包括Fam、Hex、Tamra和Rox。
6.权利要求4或5所述的引物组用于进行胡杨群体遗传分析和/或亲子鉴定的用途。
7.一种用于进行胡杨群体遗传分析和/或亲子鉴定的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于进行多重PCR反应的一组引物，所述引物由序列为SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：8的引物组成。
8.权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，在所述引物中，正向引物的5’端分别用不同的荧光基团进行修饰，优选地，所述荧光基团包括Fam、Hex、Tamra和Rox。
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