CN103898223B - 一种使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法，包括如下步骤：（1）提取胡杨的总RNA，反转录为cDNA，作为PCR的模板；（2）使用大于等于9个内参基因，设计特异性引物在实时荧光定量PCR仪上选择SYBR？Green法进行反应，得到CT值；（3）通过公式和geNorm软件的PV值计算功能，以0.15为阈值确定内参基因的数目；（4）根据所需数目选择内参基因，和目的基因一起进行qRT-PCR反应，将得到的CT值通过geNorm软件，计算得到目的基因在每个处理下用多内参基因组合得到相对表达量的变化数据。本发明所述方法与传统的单一内参基因方法相比，能够得到更为可靠的结论。

Description

一种使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，特别是涉及一种使用多内参基因组合进行实时荧光定量PCR研究胡杨抗逆关键基因的方法。

背景技术

胡杨(PopuluseuphraticaOliv)是第三世纪残余的古老树种，在6000多万年前就在地球上生存，分布于亚非荒漠地区，并且是唯一能在世界最大的流动性沙漠，塔克拉玛干沙漠，生长并建群的乔木树种，长期适应干旱盐碱和温差剧烈变化的极端沙漠环境，进化出了完整的应对干旱、盐碱、低温等逆境因素的机制，因此胡杨含有丰富的抗逆性基因资源等待开发，并且随着2013年中国科学家完成其全基因组测序工作，对于林木抗逆性机理等基础性研究，和定向培育抗逆造林新品种等应用型研究，胡杨将发挥十分重要的作用。

具有高度灵敏性、特异性和稳定性的实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）是目前应用最广泛的用于研究基因表达模式的分子生物学检测方法之一，它能检测极低含量的mRNA以及基因在不同样品间细微的表达差异变化，因此qRT-PCR常用来筛选有研究价值的关键基因。然而准确而又可信的实验结果受起始材料的用量、RNA的纯度、酶的效率、内参基因（内源对照）的选择等多方面因素的影响，其中稳定表达的内参基因是最为关键的前提条件。目前最常用的计算方法2^-ΔΔCT或者使用单一内参基因，目的基因表达量的变化高度依赖于所使用的单一内参基因表达量的变化。广泛的实验数据表明内参基因可能受不同组织、不同发育阶段或不同环境胁迫等条件的影响而稳定性发生变化，所以单一内参可能导致有偏差不准确甚至错误的实验结果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种结构简单、成本低、操作简便的使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法。

一种使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法，包括如下步骤：

（1）对胡杨进行抗逆胁迫处理，并分别提取胡杨在每个处理下的总RNA，反转录为cDNA，作为PCR的模板；

（2）使用多个胡杨常用的内参基因，所述内参基因数量大于等于9，设计特异性引物在实时荧光定量PCR仪上选择SYBRGreen法进行反应，得到CT值；

（3）通过geNorm软件的PV值计算功能，以0.15为阈值确定所选择的实验条件下需要的内参基因的数目n；

（4）根据所需数目选择内参基因，将选择的n个内参基因和目的基因一起进行qRT-PCR反应，将得到的CT值通过geNorm软件，得到目的基因在每个处理下相对表达量的变化数据，采用以下公式计算：

$\mathrm{ratio}=\frac{{\left(E_{t\arg \mathrm{etgene}}\right)}^{{\mathrm{\ΔCT}}_{{t\arg \mathrm{etgene}}^{(\min -\mathrm{sample})}}}}{\mathrm{NormalizationFactor}}\→\mathrm{ratio}=\frac{{\left(E_t\right)}^{{\mathrm{\ΔCT}}_t}}{\mathrm{NF}}$

本发明所述的使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法，其中步骤（2）和（4）的PCR体系均为20μl，加样顺序及用量依次为10μl2×SuperRealPreMixPlus,0.3μl20μM正向引物,0.3μl20μM正向引物,1μlcDNA模板,2μl50×ROXReferenceDye△,6.4μlRNase-freeddH₂O，反应程序为95℃15min，95℃20s60℃60s循环数45，得到溶解曲线。

本发明所述的使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法，其中步骤（2）中使用的内参基因为16个，分别为18S、60S、Actin、Cpn60β、EF1α、eIF-5A、GAPDH、GIIα、HIS、LIPL、LTP、RA、RP、RPL17、TUB和UBQ，16个候选的内参基因引物对的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:1～SEQIDNO:32所示。

本发明所述的使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法，其中所述环境胁迫处理为脱落酸处理、寒冷处理、脱水处理、干旱处理、短期盐胁迫处理或长期盐胁迫处理中的一种或几种。

本发明所述的使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法，其中目的基因为PeSCL7，其引物对的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:37～SEQIDNO:38所示，抗胁迫处理方式为脱水处理0、1、3、6、9、12小时，步骤（4）中n=3，3个内参基因分别为HIS、60S和Actin。

本发明所述的使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法，其中步骤（4）中目的基因为PePYL1，PeSCOF-1、PeCDPK6、PeCHY1或PeWRKY1，其中PePYL1，PeSCOF-1引物对的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:33～SEQIDNO:36所示。

本发明所述的使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法，其中所述抗逆胁迫处理包括如下步骤：

在每年的四月份取来自新疆维吾尔族自治区的胡杨仔苗，四月上旬种植于直径60cm高50cm的圆盆内，每盆3-5棵，土壤以沙土为主，含有少量蛭石和花卉营养土，每周浇两次水，待小苗生长3-4个月，即七月初或月末，苗高60～80cm的时候进行抗逆胁迫处理，所述抗逆胁迫处理方法为以下方法中的一种或几种：

A、脱落酸处理：对胡杨小苗叶面喷洒200mMABA溶液，溶液由ABA固体粉末配制而成，处理时间为12个小时，未喷洒ABA溶液的植株作为对照；

B、冷处理，将胡杨小苗连盆放在4-6℃的环境下，室温约25℃度下的植株作为对照，保持对照和处理的光照一致，处理时间12h；

C、脱水处理，从土壤中避免损伤根的前提下取出小苗，洗尽根部泥土直接裸露放置于湿度70%、温度25℃的环境下，正常生长的植株作为对照，处理时间12h；

D、干旱处理；通过浇水量控制相对土壤水分含量75%-10%，呈六个梯度，一直充分浇水的植株RSMC约75%-70%的作为对照，处理时间为一个月；

E、短期盐处理，将土壤中移出未伤根的胡杨苗洗尽根部泥土后水培于含有350mMNaCl的溶液中，未含NaCl的水培苗作为对照，每隔6h换一次水避免根部缺氧，处理时间12h；

F、长期盐胁迫，对长有胡杨苗的盆浇200mMNaCl水溶液2L，之后维持正常不含盐溶液的水25d；

其中，每种处理6个梯度，每个梯度三盆植物材料；在ABA、冷、脱水、短期盐胁迫处理1、3、6、9、12小时的时候，在长期盐胁迫5、10、15、20、25天的时候，干旱胁迫控制RSMC一个月后，取20-30片同一位置的叶子速冻于液氮中，然后再放置于-80℃保存材料。

本发明所述的使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法，其中在提取胡杨叶片的总RNA操作过程的最后一步用DNA酶消化，用ThermoNanoDrop2000测RNA的浓度，通过测OD₂₆₀/OD₂₈₀以及OD₂₆₀/OD₂₃₀两个值来检测RNA的纯度，用1%的琼脂糖凝胶电泳初步检测RNA的质量，Agilent2100微流控芯片检测RNA是否降解，每个处理每个梯度取1.8μg的RNA逆转录为cDNA，将得到的cDNA稀释8-10倍，保持终浓度的一致。

本发明使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法与现有技术不同之处在于:

本发明使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法弥补了现有的单一内参基因可能导致实验结果有偏差甚至错误的不足，利用此方法可以极大地促进实时荧光定量PCR技术计算方法的改进，该方法能够快速准确的从胡杨中鉴定出抗逆关键基因，用于逆境适应机制的研究和抗逆新品种的培育研究，同时多内参基因进行数据分析对于任何一个需要实时荧光定量PCR实验的生物物种均可采用；与传统的单一内参基因方法相比，精确而可信度高，能够得到更为可靠的结论，对于推动分子生物学方法的改进和完善，揭示细胞分化、发育、形态发生具有重要意义。

下面结合附图对本发明的使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法作进一步说明。

附图说明

图1是本发明的目标物种胡杨苗；

图2是利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的总RNA的质量；

图3是使用基于微流控技术的Agilent2100生物分析仪模拟RNA电泳检测RNA的纯度；

图4是用单一内参基因（上）和多内参基因组合（下）计算基因表达量所用的公式；

图5是根据图4公式再利用geNorm计算所需多内参基因数目的流程图；

图6为本发明实施例1中胡杨脱水胁迫条件下根据NF值的比值计算出的PV值，用PV值作图；

图7为本发明中用gNorm计算胡杨在脱落酸、冷处理等六种胁迫处理下PV值作图；

图8为本发明实施例1中用三个内参基因HIS、60S和Actin的组合计算PeSCL7基因在脱水胁迫0、1、3、6、9、12小时条件下基因表达量变化的技术流程图；

图9是分别用多内参基因组合计算PePYL1基因在脱落酸胁迫，PeSCOF-1基因在寒冷胁迫，PeSCL7在干旱、短期盐、长期盐胁迫条件下的表达量的变化。

具体实施方式

本发明以使用用多内参基因组合对胡杨PeSCL7基因在脱水胁迫0、1、3、6、9、12小时条件下的表达量变化的计算为例阐明发明内容。

实施例1

一种使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法，包括如下步骤：

步骤一、对胡杨进行抗逆胁迫处理，并分别提取胡杨在每个处理下的总RNA，反转录为cDNA，作为PCR的模板；

1、所述抗逆胁迫处理包括如下步骤：

在每年的四月份取来自新疆维吾尔族自治区的胡杨仔苗，四月上旬种植于直径60cm高50cm的圆盆内，每盆3-5棵，土壤以沙土为主，含有少量蛭石和花卉营养土，每周浇两次水，待小苗生长3-4个月，即七月初或月末，苗高60～80cm的时候进行抗逆胁迫处理，所述抗逆胁迫处理方法为以下方法中的一种或几种：

A、脱落酸处理：对胡杨小苗叶面喷洒200mMABA溶液，溶液由ABA固体粉末配制而成，处理时间为12个小时，未喷洒ABA溶液的植株作为对照；

B、冷处理，将胡杨小苗连盆放在4-6℃的环境下，室温约25℃度下的植株作为对照，保持对照和处理的光照一致，处理时间12h；

C、脱水处理，从土壤中避免损伤根的前提下取出小苗，洗尽根部泥土直接裸露放置于湿度70%、温度25℃的环境下，正常生长的植株作为对照，处理时间12h；

D、干旱处理；通过浇水量控制相对土壤水分含量75%-10%，呈六个梯度，一直充分浇水的植株RSMC约75%-70%的作为对照，处理时间为一个月；

E、短期盐处理，将土壤中移出未伤根的胡杨苗洗尽根部泥土后水培于含有350mMNaCl的溶液中，未含NaCl的水培苗作为对照，每隔6h换一次水避免根部缺氧，处理时间12h；

F、长期盐胁迫，对长有胡杨苗的盆浇200mMNaCl水溶液2L，之后维持正常不含盐溶液的水25d；

其中，每种处理6个梯度，每个梯度三盆植物材料；在ABA、冷、脱水、短期盐胁迫处理1、3、6、9、12小时的时候，在长期盐胁迫5、10、15、20、25天的时候，干旱胁迫控制RSMC一个月后，取20-30片同一位置的叶子速冻于液氮中，然后再放置于-80℃保存材料。

2、叶片高纯度和高浓度总RNA的提取，其步骤如下：

（1）配制提取RNA所需要的药品：DEPC水，CTAB缓冲液（含有1%PVP，2%CTAB，100mMTris-Cl,25mMEDTA,2%NaCl）,10MLiCl,70%乙醇。配置的用于RNA提取的溶液，离心管，枪头等均用0.1%DEPC水处理过夜，然后高压灭菌锅121℃灭菌15min.。实验操作过程时，戴上口罩和一次性橡胶手套；

（2）取少量胡杨（图1）叶片（约0.5g）置于研钵中，加入液氮磨至粉状，将粉末收集到2ml离心管中，迅速加入900ul65℃水浴预热的CTAB缓冲液和少量的二硫苏糖醇，盖好盖子立即在振荡器上剧烈震荡混匀，然后65℃水浴10min，其间混匀3-4次；

（3）取出离心管冷却2min，加入等体积氯仿-异戊醇（24：1），振荡器上振荡10min，使两者混合均匀，然后12000rpm/min的转速条件下4℃离心15min；

（4）小心吸取上清（勿吸到沉淀）至新的2mlDEPC水处理过的离心管中，加入等体积氯仿，振荡器上振荡6min，然后12000rpm/min转速4℃离心15min；

（5）小心吸取上清至新的1.5ml灭菌离心管中，加入1/4体积的LiCl溶液，-20℃冰箱中沉淀过夜，然后12000rpm/min4℃离心15min；

（6）弃上清，小心吸干离心管底残留液体，保留白色絮状沉淀，70%乙醇洗涤沉淀3次，然后12000rpm/min4℃离心5min；

（7）小心吸干管底所有残留液体，开盖将离心管至于通风橱中风干5-10min。

（8）每管加入20ulDEPC水溶解沉淀。

（9）分别用ThermoNanoDrop2000分光光度计，1%的琼脂糖凝胶电泳（结果见图2所示），Agilent2100生物分析仪（结果见图3所示）三种方法检测RNA的质量，每三个重复里取RNA纯度和浓度都较高的样品-80℃保存。

cDNA的合成，用1.8μg总RNA建立20μl反应体系，其步骤如下：

（1）使用TIANGENFastQuantRTKit，将模板RNA在冰上解冻；5×gDNABuffer、FQ-RTPrimerMix、10×FastRTBuffer、RNase-FreeddH2O在室温（15-25℃）解冻，解冻后迅速置于冰上。

（2）按照表1配置10μl去除基因组DNA的混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。其中RNA的浓度为1200ng/μl（1.2μg/μl），取1.8μg的RNA，所以体积是(1.8μg)/(1.2μg/μl)=1.5μl。

表1gDNA去除反应体系

组成成分	使用量
		5×gDNA Buffer	2μl
Total RNA	1.5μl
		RNase-Free ddH2O	6.5μl

（3）按照表2的体系配制反转录反应混合液。

表2反转录反应体系

组成成分	使用量
		10×Fast RT Buffer	2μl
RT Enzyme Mix	1μl
		FQ-RT Primer Mix	2μl
RNase-Free ddH2O	5μl

（4）将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。

（5）42℃，孵育15min。

（6）95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验。

步骤二、使用多个胡杨常用的内参基因，所述内参基因数量大于等于9，设计特异性引物在实时荧光定量PCR仪上选择SYBRGreen法进行反应，得到CT值；

确定所需多内参基因的数目：多内参基因对目的基因的表达量进行定量计算，前提是先计算归一化因子（NF值）。通过计算两个连续的NF值（Vn/n+1）的的变异系数（PV,Pairwisevariation），即NFn与NFn+1的比值（先对数转换再相除），来反应追加的内参基因的影响。当加入第n个基因时，PV值小于0.15，再追加基因对计算效果的提高不明显，所以0.15是阈值，n就是所需内参基因的最小数目。

（1）找出所研究的物种用来作为内参的基因，内参基因数目大于等于9，胡杨里根据文献有报道的有16个，对这16个内参基因设计特异性引物（16个内参基因的信息如表4所示），在实时荧光定量PCR仪器上进行反应，反应体系如表3，反应程序为：95℃15min，95℃20s60℃60s循环数45，然后对产物从40℃持续加热到100℃，在每个温度点读取荧光值得到溶解曲线，溶液曲线用于检测PCR扩增的特异性和整个实验体系的准确性。

表3qRT-PCR反应体系

组成成分	20μl体系
		2×SuperReal PreMix Plus	10μl
正向引物（20μM）	0.3μl
		正向引物（20μM）	0.3μl
cDNA模板	1μl
		50×ROX Reference DyeΔ	2μl
RNase-free ddH2O	6.4μl

（2）将得到的16个内参基因在脱水胁迫下的CT值按行和列列表，再按图4的公式和图5的流程图，计算出PV值，计算出的PV值绘出柱状图如图6。16个内参基因及部分目的基因的引物对的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:1～SEQIDNO:38所示，在序列表中按照表1中引物的从上至下的顺序分别命名为SEQIDNO:1～SEQIDNO:38。

表4本发明中16个内参基因及部分目的基因的基因名、功能注释、引物序列、扩增长度、PCR效率

（3）根据PV值确定n的值：PV值以0.15为筛选标准，图6的柱状图里第一个小于0.15的值是第二条柱图，已用星号标出，对应的横坐标是V3/V4（Vn/Vn+1），所以n=3，所以胡杨在脱水胁迫下进行基因表达分析所需的最小内参基因数目是3。用同样的方法得到了胡杨在脱落酸、寒冷、干旱、短期盐、长期盐五个处理下的PV值，再加上脱水处理以及综合六种处理（Total）绘制的PV柱状图如图7，根据横轴坐标，确定胡杨在另外五个处理下需要的内参基因数目是2，在综合六种处理时需要的数目是5。

步骤三、通过geNorm软件的PV值计算功能，以0.15为阈值确定所选择的实验条件下需要的内参基因的数目。

（4）根据所需数目选择内参基因，将选择的所有内参基因和目的基因一起进行qRT-PCR反应，将得到的CT值通过geNorm软件，得到目的基因在每个处理下基因表达量的变化数据。用三个内参基因的组合对目的基因PeSCL7在脱水胁迫下的表达量的变化进行计算，采用以下公式计算：

$\mathrm{ratio}=\frac{{\left(E_{t\arg \mathrm{etgene}}\right)}^{{\mathrm{\ΔCT}}_{{t\arg \mathrm{etgene}}^{(\min -\mathrm{sample})}}}}{\mathrm{NormalizationFactor}}\→\mathrm{ratio}=\frac{{\left(E_t\right)}^{{\mathrm{\ΔCT}}_t}}{\mathrm{NF}}$

通过PV值计算出来的n值为3，所以选择三个内参基因HIS（组氨酸家族H3蛋白）、60S(60S核糖体蛋白)、Actin(肌动蛋白)。按照表3的体系将三个内参基因和PeSCL7基因在实时荧光定量PCR仪器上进行反应，得到的CT值按照图8的数据计算流程图对PeSCL7的相对表达量进行计算。

为了验证技术流程的可操作性和准确性，同时也使用多内参基因按照同样的方法，对胡杨里的PePYL1基因在ABA（abscisicacid）处理条件下，PeSCOF-1基因在冷处理（cold）条件下，PeSCL7在干旱（drought）、短期盐处理（short-durationsalt，SS）、长期盐处理（long-durationsalt，LS）条件下的表达模式进行了研究，如图9。实验证明，用多内参基因组合进行实时荧光定量PCR，所得到的实验结果更符合预期，能和基因其它的功能验证结果保持一致。

本发明弥补了现有的单一内参基因可能导致实验结果有偏差甚至错误的不足，利用此方法可以促进实时荧光定量PCR技术计算方法的改进，与传统的单内参基因方法相比，精确而可信度高，能够得到更为可靠的结论。利用该方法，除了上述PePYL1，PeSCOF-1，PeSCL7基因，我们还从胡杨中鉴定出了抗逆关键基因PeCDPK6（钙依赖蛋白激酶6基因），PeCHY1（锌指蛋白基因），PeWRKY1（WRKY转录因子基因），表达量均受逆境胁迫诱导，具有较高的抗逆研究价值。同时该方法也可用于任何一个需要利用实时荧光定量PCR技术计算基因表达量变化的物种。本研究使用多内参基因组合进行实时荧光定量PCR能够准确地鉴定和筛选出胡杨中的抗逆关键基因，再进行后续的对其它木本植物进行遗传转化研究，培育速生而抗逆性强的林木新品种。对我国的生态建议、林木育种以及节水节能都具有十分重要的意义

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)对胡杨进行抗逆胁迫处理，并分别提取胡杨在每个处理下的总RNA，反转录为cDNA，作为PCR的模板；

(2)使用的16个内参基因，分别为18S、60S、Actin、Cpn60β、EF1α、eIF-5A、GAPDH、GIIα、HIS、LIPL、LTP、RA、RP、RPL17、TUB和UBQ，16个内参基因引物对的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:1～SEQIDNO:32所示；

设计特异性引物在实时荧光定量PCR仪上选择SYBRGreen法进行反应，得到CT值；

(3)通过geNorm软件的PV值计算功能，以0.15为阈值确定所选择的实验条件下需要的内参基因的数目n；

(4)根据所需数目选择内参基因，将选择的n个内参基因和目的基因一起进行qRT-PCR反应，将得到的CT值通过geNorm软件，得到目的基因在每个处理下相对表达量的变化数据，采用以下公式计算

。

2.根据权利要求1所述的使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法，其特征在于：步骤(2)和(4)的PCR体系均为20μl，加样顺序及用量依次为10μl2×SuperRealPreMixPlus,0.3μl20μM正向引物,0.3μl20μM反向引物,1μlcDNA模板,2μl50×ROXReferenceDye△,6.4μlRNase-freeddH₂O，反应程序为95℃15min，95℃20s60℃60s循环数45，得到溶解曲线。

3.根据权利要求2所述的使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法，其特征在于：目的基因为PeSCL7，其引物对的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:37～SEQIDNO:38所示，抗胁迫处理方式为脱水处理0、1、3、6、9、12小时，步骤(4)中n＝3，3个内参基因分别为HIS、60S和Actin。

4.根据权利要求2所述的使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法，其特征在于：步骤(4)中目的基因为PePYL1，PeSCOF-1、PeCDPK6、PeCHY1或PeWRKY1，其中PePYL1，PeSCOF-1引物对的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:33～SEQIDNO:36所示。

5.根据权利要求1所述的使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法，其特征在于：所述抗逆胁迫处理包括如下步骤：在每年的四月份取来自新疆维吾尔族自治区的胡杨仔苗，四月上旬种植于直径60cm高50cm的圆盆内，每盆3-5棵，土壤以沙土为主，含有少量蛭石和花卉营养土，每周浇两次水，待小苗生长3-4个月，即七月初或月末，苗高60～80cm的时候进行抗逆胁迫处理，所述抗逆胁迫处理方法为以下方法中的一种或几种：

A、脱落酸处理：对胡杨小苗叶面喷洒200mMABA溶液，溶液由ABA固体粉末配制而成，处理时间为12个小时，未喷洒ABA溶液的植株作为对照；

B、冷处理，将胡杨小苗连盆放在4-6℃的环境下，室温约25℃度下的植株作为对照，保持对照和处理的光照一致，处理时间12h；

C、脱水处理，从土壤中避免损伤根的前提下取出小苗，洗尽根部泥土直接裸露放置于湿度70％、温度25℃的环境下，正常生长的植株作为对照，处理时间12h；

D、短期盐处理，将土壤中移出未伤根的胡杨苗洗尽根部泥土后水培于含有350mMNaCl的溶液中，未含NaCl的水培苗作为对照，每隔6h换一次水避免根部缺氧，处理时间12h；

E、长期盐胁迫，对长有胡杨苗的盆浇200mMNaCl水溶液2L，之后维持正常不含盐溶液的水25d；

其中，每种处理6个梯度，每个梯度三盆植物材料；在ABA、冷、脱水、短期盐胁迫处理1、3、6、9、12小时的时候，在长期盐胁迫5、10、15、20、25天的时候，取20-30片同一位置的叶子速冻于液氮中，然后再放置于-80℃保存材料。

6.根据权利要求5所述的使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法，其特征在于：在提取胡杨叶片的总RNA操作过程的最后一步用DNA酶消化，用ThermoNanoDrop2000测RNA的浓度，通过测OD₂₆₀/OD₂₈₀以及OD₂₆₀/OD₂₃₀两个值来检测RNA的纯度，用1％的琼脂糖凝胶电泳初步检测RNA的质量，Agilent2100微流控芯片检测RNA是否降解，每个处理每个梯度取1.8μg的RNA逆转录为cDNA，将得到的cDNA稀释8-10倍，保持终浓度的一致。